Name: ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学ぶヒト化BLTマウスモデル構築法によるHIVに対する幹細胞ベースの設計免疫の評価。この手法は前臨床試験における細胞遺伝子治療の開発に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

フィギュアを作るための芸術的なアシスタントを提供してくださったジェシカ・セランダーさんに感謝いたします。この研究は、NIAID / NIHからの助成金によって資金提供されました。RO1AI078806、UCLAエイズ研究センター(CFAR)、助成金番号。P30AI28697、カリフォルニア再生医学研究所、助成金番号。TR4-06845、米国エイズ研究連盟(amfAR)、助成金番号#108929-54-RGRL、およびカリフォルニア大学マルチキャンパス研究プログラムとイニシアチブ、カリフォルニア抗ウイルス薬創薬センター (CCADD)

<ol><li>Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT+humanized+mice+as+a+small+animal+model+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection.</a> Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).</li>
<li>Zhen, A., Kitchen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+gene+therapy+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based gene therapy for HIV infection.</a> Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).</li>
<li>Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SIV+CTL+escape%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).</li>
<li>Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Antigen-Specific+T+Cells+from+Genetically+Modified+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+in+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice.</a> PloS one. 4 (12), e8208(2009).</li>
<li>Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SIV+CTL+escape%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).</li>
<li>Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+suppression+of+HIV+by+antigen+specific+T+cells+derived+from+engineered+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649(2012).</li>
<li>Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+HIV-1-infected+cells+and+inhibition+of+viral+replication+by+universal+receptor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells.</a> PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).</li>
<li>Zhen, A., Kamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+Immunity+Derived+From+Chimeric+Antigen+Receptor-engineered+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells.</a> Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+Therapy+for+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).</li>
<li>Pejchal, R., Doores, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+and+Broad+Neutralizing+Antibody+Recognizes+and+Penetrates+the+HIV+Glycan+Shield%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield.</a> Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).</li>
<li>Caskey, M., Klein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viraemia+suppressed+in+HIV-1-infected+humans+by+broadly+neutralizing+antibody+3BNC117%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117.</a> Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).</li>
<li>West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+on+the+role+of+antibodies+in+HIV-1+vaccine+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy.</a> Cell. 156 (4), 633-648 (2014).</li>
<li>Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+immune+system+in+immunodeficient+mice+through+combined+human+fetal+thymus%2Fliver+and+CD34%2B+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation.</a> Blood. 108 (2), 487-492 (2006).</li>
<li>Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li>
<li>Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+immune+system+investigation%3A+progress%2C+promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges.</a> Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).</li>
<li>Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+BLT+humanized+mouse+as+a+stem+cell+based+gene+therapy+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181(2012).</li>
<li>De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+six+colors%3A+a+new+era+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond six colors: a new era in flow cytometry.</a> Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).</li>
<li>Shimizu, S., Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li>
<li>Denton, P. W., Olesen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+latency+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV latency in humanized BLT mice.</a> Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Zhou, J., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies+formation+and+differentiation+from+mouse+embryonic+stem+cells+in+collagen%2FMatrigel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds.</a> Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).</li>
<li>Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Exogenous+T-cell+Receptors+Into+Human+Hematopoietic+Progenitors+Results+in+Exclusion+of+Endogenous+T-cell+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression.</a> Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).</li>
<li>Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+humanized+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Current advances in humanized mouse models.</a> Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).</li>
<li>Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogammaglobulinemia+in+BLT+humanized+mice--an+animal+model+of+primary+antibody+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency.</a> PloS one. 9 (10), e108663(2014).</li>
<li>McCune, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+the+SCID-hu+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and applications of the SCID-hu mouse model.</a> Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).</li>
<li>Srivastava, S., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR-T+Cells%3A+Design+Concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR-T Cells: Design Concepts.</a> Trends in immunology. 36 (8), (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

CARおよびHSCベースに設計免疫が臨床研究に向けて勢いを増しと、密接にこれらの操作された細胞の分化と機能を調べるために、適切な動物モデルを有することが重要です。このプロトコルでは、HIVに対する工学的遺伝的に改変された幹細胞とヒト化マウスを構築し、テストするための方法を説明しました。移植の前に、幹細胞の効率的な形質導入を有することが重要です。しかしながら、標的細胞の認識に増殖するT細胞の能力に起因して、幹細胞の修飾の低レベルは、HIV複製8に強い応答を生成するのに十分でした。 それにもかかわらず、幹細胞改変の高いレベルを達成するために、我々は、自己胸腺の代わりに別の場所で13-15に記載されていたマウスの手術のために肝臓および胸腺塊とゲル状のタンパク質の混合物で形質導入したCD34 +細胞を使用することをお勧めします。ゼラチン状のタンパク質の混合物がsolubilizです細胞外マトリックスタンパク質に富む編組織基底膜。通常の生理学的条件下で、ゼラチン状タンパク質混合物は、幹細胞20の効果的な付着および分化を可能に...

組み合わせ抗レトロウイルス療法の成功にもかかわらず、HIV感染は依然として生涯疾患です。 HIVに対する細胞性免疫応答は、HIVの複製を制御するのに非常に重要な役割を果たしています。幹細胞操作の最近の進歩は、HIV治療1-3ための遺伝子治療アプローチの迅速な開発を可能にしました。その結果、HIVに対する細胞ベースの治療の有効性のインビボ研究において可能適切な動物モデルを有することが重要です。 動物モデルにおいてHIVの操作ウイルスが唯一のヒトの細胞に感染しているという事実によって複雑になります。この制限を回避するために、科学者は、アカゲザル4,5にサル免疫不全ウイルス（SIV）などの疾患モデルを使用することに頼っています。残念ながら、種間の固有の違いやSIVとHIVの間の違いにこのモデルの主要な制限があります。また、唯一の専門性の高い施設は、cですヒト以外の霊長類での作業を支援するapable、各マカクは、大規模な投資が必要。従って、HIV感染/発症に対して感受性であるヒト免疫系を利用し、より少ない財政法外であるモデルの差し迫った必要性があります。 非肥満糖尿病（NOD）-severe複合免疫不全（SCID）-commonガンマ鎖ノックアウト（Cγ - / - ）（またはNSG）血液/肝臓/胸腺（BLT）ヒト化マウスモデルますます重要なツールであることが証明されていますHIV感染を研究します。造血幹細胞（HSC）および胎児胸腺を移植することにより、マウスが開発し、ヒトの免疫系1-3を再現することができます。幹細胞ベースの遺伝子治療の一つのタイプは、抗原特異的T細胞に分化する造血幹細胞（HSC）を再プログラミングすることによってHIVを標的とするために、末梢T細胞を「リダイレクト」することを含みます。我々は以前に示した、分子クローニングされた抗HIV特異的T細胞の再と工学のHSCSL9エピトープ（アミノ酸77-85; SLYNTVATL）に対する受容体（TCR）は、HIV-1のGagは、ヒト化NSG-BLTマウスモデル6におけるHIVの複製を抑制する成熟T細胞の形成に幹細胞をリダイレクトすることができます。分子クローン化TCRを使用する注意点は、それがこの治療の適用を制限する特定のヒト白血球抗原（HLA）のサブタイプに制限されることです。キメラ抗原受容体（CAR）、一方、普遍すべてのHLAサブタイプに適用することができます。初期の研究は、CD3のドメインを細胞内シグナル伝達ζに融合されたヒトCD4の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインで構成CARを利用して実施された（CD4ζCARと呼ばれます）。 CD4ζCARは、HIVエンベロープを認識し、T細胞受容体7によって媒介されるものと同様である細胞傷害性T細胞応答を誘発することができるCD8 T細胞上に発現しました。我々は最近、ヒトHSCは、複数の造血リーに分化することができるCD4ζCARで修飾することができることを実証しましたヒト化マウスモデル8においてHIV複製を抑制することができる機能的なT細胞を含むneages。癌9ためのキメラ抗原受容体療法、および一本鎖抗体車の構築を可能にする、HIVに対する強力な幅広い中和抗体10-12の継続的な特徴付けの急速な進歩により、それはCD4ζCARに加えて、知覚、多くの新たな候補構築物であります、生成され、HIV疾患および他の疾患の幹細胞ベースの遺伝子治療のためにテストされます。また、これらの抗原特異的な自動車を含むヒト化NSG-BLTマウスモデルはまた、密接に、インビボでのヒトT細胞応答を調べるために有用なツールを提供することができます。ゼラチン状タンパク質混合物中の造血幹細胞が胎児肝幹16の代わりに使用されているという点で重要なことは、我々のプロトコルは、13-15 BLTマウスのヒト化構築のための以前に記載された方法とは異なります。このプロトコルは、説明しますhumaniの1）建設CD4ζCARで操作ZED BLTマウス。 2）遺伝的に改変された細胞の分化の特徴を、 3）遺伝的に改変された細胞の機能性の特徴付けを。

<table><tbody><tr><td>CD34マイクロビーズキット</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-702</td><td>ヒトCD34+前駆細胞の選別用</td></tr><tr><td>バンバンカー</td><td>和光</td><td>302-14681</td><td>細胞凍結用</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNAキット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>血清中のウイルス量を測定するため</td></tr><tr><td>MACSQuant Flow Cytometer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>フロー分析用</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade;</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>フロー解析用</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma</td><td>H6254-500MG&nbsp;</td><td>組織消化用</td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼI&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>ワージントン</td><td>LS002006&nbsp;</td><td>組織消化用</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>生命技術</td><td>17104-019&nbsp;</td><td>組織消化用</td></tr><tr><td>CFXリアルタイムPCR解析システム</td><td>バイオラッド</td><td></td><td>ウイルス量と遺伝子発現の測定用</td></tr><tr><td>マウス、株NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>ヒト化マウスの構築用</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10378016</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>ピペラシリン/タゾバクタム</td><td>ファイザー</td><td>Zosyn</td><td>抗真菌</td></tr><tr><td>Amphotericin B (Fungizone antimycotic)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15290-018</td><td>抗真菌</td></tr><tr><td>オートクリップ 巻線クリップ 9 mm - 1,000 ユニット</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>427631&nbsp;</td><td>手術用</td></tr><tr><td>滅菌ポリ強化オーロラ手術用ガウン、ケースごとに30枚&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>メドライン</td><td>DYNJP2707&nbsp;</td><td>手術用</td></tr><tr><td>縫合糸、4-0、vicryl&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>オーウェンズと</td><td>マイナー23000J304H&nbsp;&nbsp;</td><td>手術用</td></tr><tr><td>アルコール準備パッド&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>手術用</td><td>Owensとマイナー</td><td>3583006818</td></tr><tr><td>Gloves、外科用、6 1/2</td><td>Owensと手術</td><td>用</td>マイナー <td>4075711102</td></tr><tr><td>Yssel'</td><td>CD34+細胞形質導入ヒト</td>血清アルブミンのための血清フリーT細胞培地<td>ジェミニバイオ製品</td><td>400-102</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td>CD34+ 細胞導入用</td></tr></tbody></table>

ヒト化マウスモデルにおけるhiv感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

HIVに対する幹細胞ベースの遺伝子治療の急速な発展に伴い、造血分化と遺伝的に修飾された細胞の免疫機能を研究するための動物モデルの差し迫った必要性があります。ヒト骨髄/肝臓/胸腺（BLT）マウスモデルは、T細胞、B細胞、NK細胞および単球を含む末梢におけるヒト免疫系の完全な再構成を可能にします。人間の胸腺インプラントはまた、自家胸腺組織におけるT細胞の胸腺選択を可能にします。 HIV感染の研究に加えて、モデルは、造血幹細胞（HSC）に由来する細胞の分化、発達と機能を研究するための強力なツールとして立っています。ここでは、ヒト化非肥満糖尿病（NOD）の建設を概説複合免疫不全（SCID）-commonガンマ鎖ノックアウト（Cγ - / - ）-severe HSCを形質導入と-Bone骨髄/肝臓/胸腺（NSG-BLT）マウスをCD4キメラ抗原受容体（CD4CAR）とレンチウイルスベクター。我々はCD4CAR HSCが正常に複数の系統に分化し、抗HIV活性を有することができることを示します。研究の目的は、HIVに対する工学的免疫のためのin vivoモデルとしてNSG-BLTマウスモデルの使用を実証することです。それは、レンチウイルスとヒト組織を用いているため、実験や手術は、特別な予防措置（BSL2 +）の施設でバイオセーフティレベル2（BSL2）でクラスII安全キャビネット内で行うべきである、ということは注目に値します。

図1は、修正された幹細胞とヒトBLTマウスの構築の概要を示します。 10週間の移植手術後、マウスは、遺伝子改変された細胞の分化及び発達を評価するために屠殺しました。 図2に示すように、複数のリンパ組織（血液、脾臓、胸腺および骨髄）CD4ζCARで修飾されたマウスから採取しました。このプロトコルで使用さCD4ζCARは、抗CD4抗体およびGFP 8の発現によって検出することができるCD4キメラ抗原受容体とGFPを含有します。細胞を単離し、ヒトCD45に対する抗体、ならびに抗CD4抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析しました。 GFPおよびCD4二重陽性細胞は、複数のリンパ組織におけるCD4CAR +細胞の存在を示す、検出されました。 遺伝子改変細胞の分化を調べるために、<html>脾細胞は、ヒトCD45（リンパ球）、CD3（T細胞）、CD19（B細胞）、C...

このプロトコルは、HIV感染に対する幹細胞ベースの操作免疫を持つヒト化骨髄/肝臓/胸腺マウスモデルを構築する方法を説明しています。

ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

この手順の全体的な目的は、キメラ抗原受容体で修飾されたヒト化マウスを作製することです。この手法は、HIV感染やその他の慢性感染症および悪性腫瘍に対する幹細胞ベースのエンジニアリング免疫の有効性を検証するなど、HIVおよび免疫学分野における重要な課題の解決に寄与します。例えば、免疫不全のメカニズムの解明や、免疫システムの強化方法、およびより優れた抗ウイルスまたは抗腫瘍免疫を構築するための治療法の開発などが挙げられます。この手法の主な利点は、大量の実験的操作が可能であることです。ヒト化BLTマウスモデルはヒトの免疫系を模倣しており、本研究においては、HIV感染に対する細胞ベースの遺伝子治療の前臨床試験を可能にします。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の技術者であるValerie RezekとBrianna Lamです。まず、サプリメント添加RPMI培地を入れたディッシュ内で、メスを用いて胸腺を約1 mm³の小さな断片に切り分けます。次に、曲がり先鈍端鑷子を用いて、切り分けた胸腺の断片を96ウェルプレートの各ウェルに1つずつ配置します。組織が乾燥しないよう、すべてのウェルに100-200 µLの培地を添加します。顕微鏡下で組織を観察し、胸腺ではないと思われる組織や、結合組織が付着している組織を除去します。次に、確認した胸腺の断片を取り出し、T25セルカルチャーフラスコにまとめます。フラスコに抗生物質を添加したRPMI培地を7 mL加え、ゆっくりと揺らして混合します。次に、フラスコを組織培養インキュベーターに入れます。この操作により、組織への細菌汚染を防ぎます。IMDMを含むディッシュ内で、2本のメスを用いて肝臓を約3 mm³の小さな破片に切断し、胎児肝からCD34陽性HSCの分離を開始します。白い結合組織を除去し、廃棄します。次に、16ゲージの鈍針を装着した10 milliliterシリンジを使用して、肝臓の断片と培地を回収し、50 milliliterコニカルチューブに移します。組織を完全に均質化させるため、吸引と排出をさらに5〜7回ゆっくりと繰り返します。10 mLのIMDM培地を調製した後、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、抗生物質、Dnase、および抗真菌剤を添加します。この培地を0.22 µmフィルターでろ過します。その後、ろ過した培地を肝細胞懸濁液に加えます。肝細胞懸濁液を入れた50 mLコニカルチューブに蓋をし、液漏れを防ぐためにパラフィルムなどの密封フィルムでしっかりと密閉します。37 °Cのインキュベーター内で、チューブローテーターを用いて90分間回転させます。インキュベーション後、消化した細胞懸濁液を100 µmのセルストレーナーでろ過し、新しい50 mLチューブに回収します。懸濁液にPBSを加え、全量を50 millilitersにします。これを2本の50 milliliterチューブに分け、各チューブに25 millilitersの細胞懸濁液を分注します。Ficollなどの密度勾配遠心分離用培地10 millilitersを、各チューブの細胞層の下にゆっくりと慎重に重ねます。1200 ×gで20分間、停止することなく遠心分離します。遠心後、各チューブから界面層を慎重に取り除き、2本の別の50 mLチューブに分注します。各界面層のチューブの容量をPBSで50 mLまでにします。その後、300 ×gで7〜10分間遠心分離します。細胞ペレットをまとめ、2% FBSを含むPBS 50 mLで3回洗浄し、その都度300 ×gで7〜10分間遠心分離します。最後の遠心分離後、ペレットを10% FBS添加RPMI培地 50 mLに再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。次に、メーカーのプロトコルに従ってCD34ソーティングキットを用い、直ちにCD34陽性細胞を分取し、CD34陽性画分とCD34陰性画分の両方を保存します。フラスコから胸腺片と培地を60 mmディッシュに注ぎます。ポジティブディスプレイスメントピペットチップを、蓋を開けた1.5 mLの滅菌スクリューキャップチューブに入れ、氷上で冷却します。同様に、細胞ペレットとMatrigelなどのゲル状タンパク質混合物を氷上に置きます。承認済みの動物実験プロトコルに従い、投与用麻酔薬を用いてレシピエントマウスを麻酔します。マウスの足の指を軽くつまんで、麻酔深度を確認します。つまみに対する反応がないことは、手術可能な麻酔面にあることを示しています。各マウスの左側、背中の中心から腹部にかけての腰から肩までを剃毛します。希釈したCarprofenを1 kgあたり6 mg、動物の肩または鼠径三角に皮下注射します。60 mmディッシュ内のPBSでトロカール管をフラッシュします。鈍端の曲鑷子を用いて、60 mmディッシュから胸腺片を管の開口部のすぐ内側に配置し、その後トロカールを引き戻して組織を管内に吸引します。次に、ポジティブディスプレイスメントピペットと冷却したチップを用いて、冷却したゼラチン状タンパク質混合液5 µLを細胞ペレットの入ったチューブに加えます。そして、緩やかに撹拌して細胞懸濁液を作成します。細胞懸濁液をカニューレの開口部にピペットで加え、トロッカーをゆっくりと引き戻して針に充填します。マウスの除毛部位をポビドンヨードで拭き、続いてイソプロパノールで3回拭き取ります。皮膚の下で最も色が濃い部分を確認し、そこを脾臓の位置として特定します。腎臓は脾臓から背側へ約5 mmの位置にあります。足底へのピンチ刺激に対して反応がないことを確認し、麻酔が十分に効いていることを確かめた後、曲鉗子で皮膚を持ち上げ、外科用ハサミを用いて脾臓に平行に15 millimeterの皮膚切開を行います。次に、その下の腹膜層でも同様に切開します。雄の場合、腎臓が容易に視認できるため、腹部を軽く押さえるだけで押し出すことができます。止血鉗子または曲がった鈍端鉗子で腎臓を支持します。雌の場合、卵巣が腎臓の取り出しを妨げることがあります。止血鉗子で卵巣を掴み、慎重に腎臓を露出させてください。針先ピンセットを用いて、腎被膜の後端に小さな穴を開けます。この穴にトロカーを挿入し、カニューレの開口部が腎被膜に完全に覆われるまで腎臓に沿って滑り込ませます。腎被膜下の組織をそっと押し出し、トロカーをゆっくりと引き抜きます。曲がった鉗子を使用して、胸腺の断片が針と一緒に外に出てこないようにします。次に、鉗子で腹膜を持ち上げ、止血鉗子で腎臓をゆっくりと元の位置に押し戻します。外科用縫合糸を用いて、腹膜にダブルノットで1針縫合します。また、皮膚を閉鎖するためにAutoclips Wound clipsを2箇所に留置します。次に、形質導入されたCD34陽性細胞を混合し、0.5 × 10⁶ cellsを100 µLの容量でインスリン用注射器に吸引します。これらの細胞を、後眼静脈注射によりマウスに注入します。注射後、眼用潤滑剤を各眼に少量塗布し、マウスを側臥位にしてケージに戻します。すべてのマウスへの移植が完了した後、動物が意識を回復し、歩行可能であることを確認してから飼育室に戻します。手術から10週間後にマウスを安楽死させ、血液、脾臓、胸腺、および骨髄を採取しました。得られた細胞を抗ヒトCD45抗体および抗ヒトCD4抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析しました。ここで示されているように、CD4キメラ抗原受容体を導入した細胞は、フローサイトメトリーによって複数のリンパ組織で検出可能です。CD4キメラ抗原受容体導入細胞は、複数の系統へと分化することができます。本研究では、CD4キメラ抗原受容体導入マウスから脾細胞を回収し、T細胞およびB細胞のマーカーで染色した。T細胞およびB細胞マーカー陰性の細胞は、単球、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞のマーカー陽性であった。HIV感染CD4キメラ抗原受容体マウス由来の脾細胞を、HIV感染T細胞または非感染T細胞で刺激し、細胞内でのサイトカイン産生量を示した。このビデオを視聴することで、キメラ抗原受容体で修飾されたヒト化BLTマウスの構築方法について十分に理解できるはずです。この手法を習得すれば、適切に実施することで48時間以内に完了させることができます。この手順を行う際は、一定のペースで作業を進め、処置を受けているマウスの状態に細心の注意を払うことが重要です。初心者にとって、より貴重な組織や幹細胞を扱う前に、手術や眼内注射の練習を行うことは重要です。この技術の開発により、HIVやその他の感染症分野の研究者が、ヒト化マウスモデルを用いて疾患の病原性と免疫療法の探索を行う道が開かれました。

stem-cell-based-engineered-immunity-against-hiv-infection-humanized

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ヒト化マウスを用いた腫瘍特異的T細胞の生成および特徴付けは、ここで説明されます。ヒト胸腺組織、遺伝子組み換えヒト造血幹細胞を免疫不全マウスに移植されています。抗腫瘍免疫応答の生体観察を可能に設計されたヒト免疫系の再構成でこの結果。...

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

このビデオでは、ヒト免疫系(HIS)マウスを生成する技術を示しています。CD34+造血幹細胞(HSC)は、抗体被覆磁気ビーズを用いてヒト臍帯血バフィーコート細胞から単離されます。CD34+...

臍帯血造血幹細胞を分離してヒト免疫系マウスを作製

このビデオでは、ヒト免疫系と肝細胞を持つデュアルヒト化マウスモデルを生成する方法を示します。これは、ヒト肝細胞、造血幹細胞、造血幹細胞および前駆細胞をトランスジェニック免疫不全マウスに脾腔内注射により移植し、肝細胞の生着とヒト免疫細胞の発達につながるというものです。...

ヒト肝細胞と免疫細胞を用いたヒト化マウスモデルの開発

このビデオは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対する幹細胞ベースの操作免疫を持つヒト化マウスモデルを生成する技術を示しています。ヒト胎児胸腺組織と人工造血幹細胞(HSC)を、重度の免疫不全マウスの腎臓嚢に移植します。HIVに対してキメラ抗原受容体(CAR)を発現する造血幹細胞は、ゼラチン状のタンパク質混合物に混合され、胸腺組織との共局在を促進します。処置後、HSCはさまざまなヒト免疫細胞に分化し、HIVに対する機能的なヒト免疫システムを備えたヒト化マウスモデルが開発されます。...

HIVに対する遺伝子操作免疫を持つヒト化マウスモデルの構築

このプロトコルは、ひと造血幹細胞の放射線-調節された新生児 NSG マウス注入肝を介してヒト化マウス (胡 NSG) を確立するためのメソッドを提供します。胡 NSG マウス HIV 感染および組合せの抗レトロ ウイルス療法 (カート) に敏感であるし、HIV...

ヒト NOD/SCID/IL2rγ のnull (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

このプロトコルは、ヒト免疫系および肝細胞の両方を有するヒト化マウスを確立するための信頼性の高い方法を提供する。ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞の脾臓内注射を介して達成される二重再構成免疫不全マウスは、ヒト免疫不全ウイルス-1感染の影響を受けやすく、肝臓損傷を再キャパチレートするHIVに感染した患者...

HIV関連肝病因に対する二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立

ここでは、ヒト化マウスにおけるHIV感染のダイナミクスを研究するための3つの実験的アプローチについて説明する。最初は慢性感染イベントの研究を許可し、後者の2つは一次感染またはウイルス再活性化後の急性イベントの研究を可能にする。...

ヒト化免疫不全マウスモデルにおける慢性、急性、再活性化HIV感染

幹細胞移植、膣内ヒト免疫不全ウイルス暴露、液滴デジタルPCR...

膣内HIV曝露とHIV感染治療に対するヒト化NOGマウス

このプロトコルは、ヒト化マウスにおけるHIV-1...

HIV-1感染ヒト化マウスにおける経口併用抗レトロウイルス治療

このプロトコルは、免疫腫瘍学研究のためのヒト免疫系(HIS)マウスの生成について概説しています。このモデルに移植されたヒト腫瘍に対するヒト免疫療法を試験するためのこのモデルの使用における指示および考慮事項は、腫瘍に対するヒト免疫系の応答を特徴付けることに重点を置いたものとして提示されている。...

ヒト腫瘍を有するヒト化マウスモデルにおける癌免疫療法の試験

学ぶヒト化BLTマウスモデル構築法によるHIVに対する幹細胞ベースの設計免疫の評価。この手法は前臨床試験における細胞遺伝子治療の開発に有用です。

ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ

さらに動画を探す