ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ

この手順の全体的な目標は、キメラ抗原受容体を修飾したヒト化マウスを作成することです。この方法は、HIV感染やその他の慢性感染症や悪性腫瘍に対する幹細胞ベースの操作免疫の有効性の試験に関して、HIVおよび免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。免疫不全のメカニズムや、免疫系を強化し、より優れた抗ウイルス免疫または抗腫瘍免疫を作り出す治療法を開発する方法など。

この手法の主な利点は、大量の実験的操作が可能であることです。ヒト化BLTマウスモデルはヒト免疫を模倣しており、この場合、HIV感染に対する細胞ベースの遺伝子治療の前臨床試験が可能です。手順を実演するのは、Valerie Rezek と Brianna Lam で、彼らは私の研究室の技術者です。

まず、メスを使って胸腺を約1mmの小片に切り、RPMI培地を補充した皿に入れます。次に、湾曲した鈍い鉗子を使用して、各胸腺片を96ウェルプレート上の単一のウェルに配置します。組織が乾燥しないように、すべてのウェルに100〜200マイクロリットルの培地を追加します。

顕微鏡下で組織を視覚化して、胸腺ではない可能性のある組織や結合組織が付着している組織を排除します。次に、確認された胸腺の断片を取り除き、それらをT25細胞培養フラスコに組み合わせます。7ミリリットルの抗生物質を添加したRPMI培地をフラスコに加え、軽く揺らして混ぜます。

次に、フラスコを組織培養インキュベーターに入れます。このステップにより、組織の細菌汚染を防ぐことができます。胎児の肝臓からCD34陽性の造血幹細胞を分離するには、IMDMが入った皿に2つのメスを使用して肝臓を約3ミリメートルの立方体に切断します。

白い結合組織をすべて取り除いて廃棄します。次に、16ゲージの鈍い針を取り付けた10ミリリットルの注射器を使用して、肝臓片と培地を取り出し、50ミリリットルの円錐管に移します。組織を完全に均質化するために、さらに5〜7回穏やかに取り上げて排出します。

10ミリリットルのIMDM培地を調製した後、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、抗生物質、Dnase、および抗真菌剤を補充します。メディアを0.22ミクロンのフィルターに通します。次に、ろ過した培地を肝臓懸濁液に加えます。

肝臓懸濁液が入った50ミリリットルの円錐管をキャッピングした後、漏れを防ぐためにパラフィルムなどのセルフシールフィルムでしっかりと密封します。37°Cのインキュベーターでチューブローテーターを90分間回転させます。インキュベーション後、消化した細胞懸濁液を100ミクロンの細胞ストレーナーで濾過し、新鮮な50ミリリットルのチューブに入れます。

サスペンションにPBSを追加すると、総容量が最大50ミリリットルになります。これを2本の50ミリリットルチューブに分割し、それぞれに25ミリリットルの細胞懸濁液を入れます。各チューブ内の細胞をゆっくりと、Ficollなどの10ミリリットルの密度遠心分離培地で穏やかに下敷きます。

1200倍のgで20分間休憩せずに回転させます。遠心分離後、各チューブから界面を慎重に取り外し、2本の別々の50ミリリットルチューブに移します。インターフェースの各チューブの容量をPBSで最大50ミリリットルにします。

その後、300 g で 7 〜 10 分間遠心分離します。細胞ペレットを2%のFBSを含む50ミリリットルのPBSと3回組み合わせて洗浄し、毎回300倍のgで7〜10分間回転させます。最終回転後、ペレットを50ミリリットルのRPMIメディアと10%のFBSに再懸濁します。

血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次に、CD34陽性細胞を、製造元のプロトコルに従ってCD34ソーティングキットを用いて直ちに選別し、CD34陽性画分とCD34陰性画分の両方を保存する。胸腺の小片と培地をフラスコから60ミリメートルの皿に注ぎます。

容積式ピペットの先端を氷上の開いた1.5ミリリットルの滅菌スクリューキャップチューブに入れて冷やします。また、細胞ペレットとマトリゲルなどのゼラチン状タンパク質混合物を氷の上に置きます。承認された動物プロトコルに従って、レシピエントマウスを注射可能な麻酔薬で麻酔します。

足を絞ってマウスの麻酔レベルを確認します。ピンチに対する反応がないことは、麻酔の手術面を示しています。各マウスの左側を腰から肩まで、背中の中央と胃の間から剃ります。

希釈したCarprofenのキログラムあたり6ミリグラムを動物の肩または鼠径部の三角形に皮下注射します。.トロカールのカニューレをPBSで60mmの皿に洗い流します。一対の鈍く湾曲した鉗子を使用して、60ミリメートル皿の胸腺の一部をカニューレの開口部のすぐ内側に配置し、次にトロカールを引き戻して組織をカニューレに吸引します。

次に、容積式ピペットと冷却チップを使用して、細胞ペレットの入ったチューブに5マイクロリットルの冷たいゼラチン状タンパク質混合物を追加します。そして、細胞懸濁液を生成するために穏やかに攪拌します。細胞懸濁液をカニューレの開口部にピペットで固定し、トロカールをゆっくりと引き戻して針をロードします。

マウスの剃った部分をポビドンヨードで綿棒で拭き、続いてイソプロペニルを3回綿棒で拭きます。脾臓の位置を示す皮膚の下の最も暗い場所を特定します。腎臓は脾臓に対して約5ミリメートル背側にあります。

足のピンチの反応がないことによって適切なレベルの麻酔を確保した後、湾曲した鉗子を使用して皮膚を持ち上げ、手術用ハサミを使用して脾臓と平行に皮膚に15ミリメートルの切開を行います。次に、下の腹膜層にも同様の切り込みを入れます。男性では、腎臓は簡単に見えるため、腹部を押すだけで押し出されます。

止血剤または湾曲した鈍い鉗子で腎臓を支えます。女性では、卵巣が腎臓を簡単に抽出するのを妨げる傾向があります。止血剤を使用して、卵巣を摘み取り、腎臓を慎重に露出させます。

針の先端を持つ鉗子を使用して、腎臓嚢の後端にある小さな穴を摘み取ります。トロカールをこの穴にスライドさせ、カニューレの開口部が腎臓カプセルで完全に覆われるまで腎臓に沿ってスライドさせます。腎臓嚢の下の組織をそっと押し出し、トロカールを引き出します。

湾曲した鉗子を使用して、胸腺片が針と一緒に戻ってこないようにします。次に、鉗子で腹膜を持ち上げ、止血器をそっと使用して腎臓を元の位置に戻します。腹膜の外科的縫合糸で1つのダブルノットステッチを結びます。

また、2つのAutoclips巻線クリップを配置して、スキンを閉じます。次に、形質導入したCD34陽性細胞を混合し、100マイクロリットルの容量の6つの細胞に0.5倍10を吸引してインスリン注射器に入れます。これらの細胞を後眼窩静脈注射を通じてマウスに注入します。

注射後、片方の眼に少量の眼用潤滑剤を綿棒で拭き取り、マウスをケージに背向けに寝かせます。すべてのマウスを移植した後、動物が良心性を取り戻し、歩行できるようになったことを確認してから、飼育室に戻します。マウスは手術の10週間後に屠殺され、血液、脾臓、胸腺、骨髄が採取されました。

得られた細胞を抗ヒトCD45抗体および抗ヒトCD4抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析しました。ここに見られるように、CD4キメラ抗原受容体改変細胞は、フローサイトメトリーによって複数のリンパ組織で検出できます。CD4キメラ抗原受容体改変細胞は、複数の系統に分化することができます。

ここでは、CD4キメラ抗原受容体改変マウスの脾細胞を採取し、T細胞とB細胞のマーカーを染色しました。T細胞マーカーおよびB細胞マーカーに陰性の細胞は、単球およびマクロファージのマーカー、およびナチュラルキラー細胞に対して陽性であった。HIV感染CD4キメラ抗原受容体マウスの脾細胞をHIV感染細胞または非感染T-one細胞のいずれかで刺激し、それらの細胞内サイトカイン産生が示された。

このビデオを見れば、キメラ抗原受容体を改変したヒト化BLTマウスの作り方を十分に理解できるはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば48時間で完了します。この手順を試みるときは、安定したペースで作業し、手術中のマウスの状態に細心の注意を払うことを忘れないでください。

初心者にとっては、より貴重な組織や幹細胞を扱う前に、手術や眼科注射の練習をすることが重要です。この技術は、開発後、HIVやその他の感染症の分野の研究者が、ヒト化マウスモデルで疾患の病因と免疫ベースの治療法を探求する道を開きました。