ヒトの血液脳脊髄液関門の脈絡叢上皮細胞ベースのモデルは、基底外側からの細菌感染症を研究するために、

この方法の全体的な目標は、ヒトの血液-脳脊髄液関門の脈絡叢上皮細胞ベースのモデルを生成することです。基底外側からの細菌感染の研究を可能にします。この方法は、細菌と脈絡叢上皮との相互作用中にどのプロセスが関与しているかなど、中枢神経系の感染症に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、病原体と上皮細胞の基底外側黒面との相互作用を分析できることです。この方法は、脈絡叢上皮を横切る免疫細胞と腫瘍細胞の転生の調査など、他の研究にも適用できます。この方法にヒト脈絡叢乳頭腫(HIBCCP細胞)を使おうと思ったのは、柴田 et.al の2005年の原稿を読んだときでした。

細胞株を記述します。まず、滅菌鉗子を使用して、0.33cm四方の成長領域の細胞培養フィルターインサートを、3ミクロンサイズの細孔を逆さまにして12ウェルプレートの個々のウェルに配置します。次に、血清学的ピペットを使用して、予熱した培地の約3ミリリットルをウェルに充填し、下部コンパートメントがちょうど満たされるまで、追加の溶液を吸引します。

次に、フィルターの上に100μmの37度継代培養培地を100μm加え、10%のFCSを添加します。培地を添加するときは、気泡が細胞に十分に供給されるのを妨げるため、気泡の発生を避けることが非常に重要です。培地をすべてのインサートに加えたら、プレートを覆い、インサートを摂氏37度の5%CO2インキュベーターに移します。

次に、HIBCPP細胞のフラスコを10ミリリットルのPVSで、渦巻きながら2回洗浄します。2回目の洗浄後、3ミリリットルの0.25パーセントトリプシンEDTAを細胞に加え、フラスコを渦巻かせます。その後、細胞を約20分間インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、細胞がフラスコの底から浮き上がり、丸い形をしていることを確認します。細胞は互いに完全に分離せず、しばしば凝集体に見られます。17ミリリットルの培地で培養物を再懸濁して反応を停止し、懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。

次に、細胞をスピンダウンし、ペレットを適切な量の培地に再懸濁してカウントします。次に、細胞を1ミリリットルあたり10〜6個の細胞の1倍に希釈し、チューブを反転させて細胞を均一に分散させます。次に、各フィルターインサートの上部に80マイクロリットルのセルを追加します。

すべてのインサートが播種されたら、プレートを覆い、インキュベーターに戻して一晩培養します。翌日、24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの培地を加えます。次に、鉗子を使用して、各インサートを持ち上げ、内部の培地を廃棄し、インサートを右側を上にして24ウェルプレートの個々のウェルに配置します。

フィルターインサートを12ウェルプレートから24ウェルプレートに反転させるときは、細胞が上に成長している状態でフィルターメンブレンに触れないように注意してください。インサートに0.5ミリリットルの新鮮な培地を入れ、プレートをインキュベーターに戻します。インサートを2日ごとに新しい培地で新しい24ウェルプレートに移し、それにより上部コンパートメントの培地を交換します。

細胞の経上皮電気抵抗、またはTEERを測定するには、まず上皮組織ボルトオーム計の電極先端を80%エタノールに浸します。15分後、電極をエタノールから取り出して電極を乾燥させます。次に、チップを継代培養液のアリコートにさらに15分間入れます。

電極が平衡化したら、長い方のアームを細胞培養プレートの1つのウェルの下部コンパートメントの底部に接触するように配置し、短い方のアームをフィルターインサートコンパートメントに届くように配置します。細胞を含まない培地に挿入する細胞培養フィルターの抵抗値を測定し、ブランク値を取得します。次に、シードされた各インサートのTEERを測定します。

測定後、電極を80%エタノールに15分間戻し、ドライチューブで保存します。HIBCPPシードインサートのTEER値が70Ω/cm二乗を超えた場合は、5μg/ミリリットルのインスリンと1%のFCSを添加した新鮮な培養培地を使用して培地を更新し、プレートを細胞培養インキュベーターに一晩戻します。インサート培養物の傍細胞透過性を決定するには、新鮮な血清低培養培地に調製したばかりのFITC-イヌリン1ミリリットルあたり50マイクログラムを各インサートの上部フィルターコンパートメントに加え、細胞をインキュベーターに戻します。

培養物が約500Ω/cm二乗のTEERに達したら、10回の感染の多重度で目的の細菌懸濁液を細胞に感染させ、適切な培養期間の間、細胞をインキュベーターに戻します。次に、フィルターを1ミリリットルの無血清培地で新しいウェルに移すことにより、細胞を3回洗浄します。毎回、同じ培地の500マイクロリットルで培地をフィルターコンパートメントに入れ、最後に、各細胞培養フィルターインサートの下部ウェルから培地サンプルを収集し、マイクロプレートリーダー内のすべてのサンプルを10個および2個のFITCイヌリン標準希釈液に対して測定することにより、細菌感染後にフィルターコンパートメントから細胞層を通過したイヌリンの濃度を決定します。

HIBCCP細胞は、分子交換を適度に制限することを可能にする特定のバリア機能を示します。例えば、タンパク質、ZO-1、Occludin、およびClaudin-1に関連するタイプジャンクションの免疫蛍光染色解析では、細胞間接触部位に途切れることのないシグナルが明らかになります。タイトジャンクションの連続的なストランドによるセルの相互接続性を示しています。

適切な条件下で培養すると、HIBCPP細胞は、処理なしでセンチメートル当たり最大約500オームに達する高い膜電位を示し、血液 - 脳脊髄液関門の典型的なバリア機能を維持し、膜電位の形成と同様に、高分子に対する低透過性を示す。ただし、DMSOの濃度が増加すると、TEER値は用量依存的に減少し、サイトカラシンD治療後にも同様にTEER値が大幅に低下します。.さらに、2 容量パーセントの DMSO またはサイトカラシン D を添加すると、FITC-イヌリンフラックスの透過性がこれに比例して大幅に増加します。

さらに、HIBCCP細胞への細菌感染は、2つの病原性細菌株による細胞層への重大な侵入をもたらす。MC58、およびそのカプセル欠損変異体。一方、非病原性α14株ではわずかな浸潤のみが観察されます。

この手順を試みる際は、無傷のHIBCCP層が接触によって破壊されるため、細胞を播種した後にフィルターメンブレンに触れないように注意することが重要です。この手順に続いて、体外転生アッセイなどの他の方法を実行して、脈絡叢上皮細胞間の免疫細胞および腫瘍細胞の移動のメカニズムに関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、薬理学分野の研究者がin vitroで脈絡叢上皮を横切る基質の移動を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、病原体による基底側方感染に対する血液脳脊髄液関門のHIBCCP細胞ベースモデルの作り方を十分に理解できるはずです。人間の病原体を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、適切な安全フードの下で作業するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。