Name: EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶEAK16-II/EAKIIH6ペプチドを用いたFACS精製胸腺上皮細胞の3-D自己組織化ヒドロゲル構築法。C57BL/6Jマウス由来細胞の生存と機能維持に有用な、生分解性で注入可能なタイムスバイオエンジニアリング技術です。

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この作品は、国立衛生研究所によって部分的にサポートされていたR21 AI113000（WSM）とR01 AI123392（YF）を付与します。

実験で使用した全ての動物は、アレゲニー健康ネットワーク/アレゲニーシンガー研究所の施設内動物管理使用委員会によって審査および承認されたプロトコルの下でアレゲニー・シンガー研究所の動物施設に収容しました。 1.コラゲナーゼで胸腺を消化<ol><li>収穫胸腺。 <ol><li>胸腺を収穫するために、二酸化炭素（CO 2）チャンバー内で3-5週齢のC57BL6 / Jマウスを安楽死させます。具体的には、3〜5分間、CO 2の誘導の下でチャンバー内にマウスを置き、心臓や呼吸停止を検証することによって、死亡を確認。 </li><li>その裏に死体を置き、70％エタノールで体を濡らします。皮膚を通してその腹部に鋭い、ストレート解剖ハサミで小さな水平切開を行います。それは裏返しされるように両端（頭部と脚）の皮膚を引きます。 </li><li>すぐ下に解剖ハサミで水平カットを作ります最低リブとは、横振動板をカット。ピンセットで剣状突起を持ち、両側にまで進んリブの真ん中を切りました。胸腺がはっきり見えるように肋骨/胸骨を引き上げます。 注：胸腺、心臓の上に直接位置する2葉からなり、白色半透明色のものです。 </li><li>湾曲した鉗子を使用して、静かに（材料のリストを参照してください）​​洗浄液中の結合組織および転送のオフ胸腺ローブをスクープし、引き出します。 </li></ol></li><li> 9mLのRPMI-1640（ロズウェルパーク記念研究所培地-1640）、0.025 mg / mlで精製されたコラゲナーゼ、10mMのHEPES [4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸]、および0.2 mg / mlで混合することにより、消化液を調製50ml遠心管中のDNase I。使用するまで37℃の水浴中で消化溶液を保管してください。 注：準備消化溶液の量は、1 5ミリリットルポリスチレン丸で一緒にインキュベートすることができる最大5つの成体マウスの胸腺、のために十分です下部チューブ。 </li><li> 5〜6ミリリットルRPMI-1640を含む60ミリメートルの組織培養皿に胸腺を転送します。 </li><li>リンパ球が流出できるように小片（約1mm 3の正方形）に28 Gインスリン注射針で胸腺を解剖。 </li><li>ガラスパスツールピペットでペトリ皿で​​あるRPMI-1640と胸腺の作品をすすぎます。皿を傾け、胸腺断片が底に沈殿してみましょう。ゆっくり吸引し、ガラスピペットを用いて、RPMI-1640上清を捨てます。解決策はあまり不透明になるまで、ガラスピペットを用いて4-5回5〜6ミリリットルRPMI-1640でこのすすぎ工程を繰り返します。 注：胸腺断片は、胸腺組織の過剰な損失をもたらす、プラスチックに固執する傾向があるので、ガラスピペットは、この段階で推奨されています。残りの手順については、プラスチック製のピペットを使用しています。 </li><li>ステップ1.5で説明したように最後のすすぎの後、上清を捨てます。 3ミリリットルの消化溶液を追加し、5ミリリットル丸底Pに胸腺片とソリューションを転送olystyreneチューブ。 </li><li>チューブ回転にチューブを置き、12回転の回転速度で6分間37℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、胸腺断片は、重力によって、チューブの底に沈殿してみましょう。パスツールピペットを用いて上清を回収し、洗浄溶液10mlと50mlの遠心管に移します。 5分間、300×gで遠心分離し、上清を捨て、10mlの洗浄溶液で細胞を懸濁します。氷の上に保管してください。 </li><li>繰り返しは、5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブに胸腺断片に二回1.6から1.8を繰り返します。同じ50ミリリットルチューブに上清をプール。 注：遠心分離は、第2および第3の洗浄のための必要はありません。 </li><li> 50mlの遠心管にチューブ、転送中の任意の残りのフラグメントを打破するために、最終的な消化の後、アップピペットと2ミリリットルのプラスチック血清学的ピペットを用いてダウン。 </li><li> 5分間、300×gで遠心分離50ミリリットルチューブ、上清を吸引、洗浄ブフェの10ミリリットルで再懸濁100μmのセルストレーナーを通してrおよびフィルタ。氷の上に保管してください。 </li></ol>不連続密度勾配でのTECの2濃縮<ol><li> 2.4ミリリットルの密度勾配培地（水中のイオジキサノールのw / vの60％）と9.6ミリリットル洗浄溶液を混合することにより、21％密度勾配溶液を調製します。 </li><li> 2.5ミリリットル洗浄緩衝液中で5分間再懸濁し、300×gでステップ1.11から50ミリリットルコレクションチューブに解離した胸腺細胞を遠心します。 </li><li>細胞懸濁液に20ミリリットルRPMI-1640培地を追加します。 </li><li>電子ピペッターで10ミリリットル血清学的ピペットで21％密度勾配液の12ミリリットルを記入してください。細胞を含有する50mLの遠心チューブの底に血清学的ピペットの先端を配置し、重​​力を介してチューブの底に排出するための密度勾配溶液を可能にします。 <ol><li>穏やかに異なる密度の二層を生成終了するピペットからの密度勾配溶液を排出。 </li></ol></li><li> 600×gでFOで遠心分離スイングバケットローター中で、室温で20分rは。最も遅いレベルでの減速度を設定します。 </li><li>新しい50ミリリットルチューブにトップ層との界面を転送します。 注：のTECのほとんどは界面に保持されます。リンパ球は、遠心分離後、チューブの底に沈殿します。これらの細胞は、他の目的に使用する場合、3回20mLの洗浄溶液でペレットを洗浄。洗浄緩衝液10ml中に細胞を再懸濁。 </li><li> 4℃で6分間、400×gでステップ2.6および遠心機でチューブに40ミリリットルに洗浄液を追加します。ピペットで上清を、吸引を削除します。 </li><li>ステップ2.7で説明したように洗浄し、吸引2回繰り返します。 </li><li>洗浄液の2ミリリットル中に再懸濁し、血球計数器で細胞をカウント。 </li></ol> FACS 3.分離のTEC <ol><li>洗浄液や転送に1×10 6細胞/ 100μlの濃度でステップ2.9から細胞を調整します（フローソーターの指示により推奨されるように、ポリプロピレン、ポリスチレン、）5ミリリットル丸底チューブに細胞。 </li><li> 1×10 6個の細胞当たり2μlの抗Fc受容体のIgGを添加し、4℃で10分間インキュベートします。 </li><li> （：150希釈、サンプルあたり10μlの1）および抗EpCAM（1：100希釈、サンプルあたり10μl）を抗体および以上4℃で20分間インキュベート抗CD45を追加します。 </li><li> 4℃で6分間、400×gで2ミリリットルの洗浄液と遠心で細胞を洗浄します。ピペットで上清を吸引除去します。 </li><li> 1ml中の細胞1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁します。 </li><li> 100μmのストレーナーを通して濾過。 </li><li>仕分け機器に細胞を適用します。その後、側方散乱光（SSC）/前方散乱光（FSC）パネル（死細胞）、13をソートするためCD45-のEpCAM +のために選択された集団にゲート上の最小のセルを除くリンパ球とTEC人口を選択します。 </li></ol> 4. GTEC / EAK骨材のeneration 注：試薬調製と層状フードの下で混合セルを伴う手順を実行します。 <ol><li>滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブ中の抗HisタグIgGの4μlの、抗EpCAM IgGの8μlのとPA / Gの2.6μLを混合することにより、PA / Gアダプター複合体を準備し、そして室温で5分間インキュベートします。 </li><li>洗浄溶液、およびピペット低蒸発、96ウェル丸底組織培養プレートの1ウェルに100μlの5×10 4細胞/ mlにステップ3.7からソートのTECを調整します。細胞に14.6μlのPA / Gアダプター複合体を追加します。 4℃で20分間ロッキングプラットフォーム上でプレートを置きます。 </li><li> 200μlの洗浄液で1回洗浄。 6分間400×gでプレートを遠心。マイクロピペットで上清を捨てます。 </li><li> 200μlの10％スクロース溶液で1回洗浄します。 6分間400×gで遠心分離します。マイクロピペットで上清を捨てます。 </li><li> 30μlの10％s内の細胞を再懸濁しウェルあたりショ糖ソリューションterile。 </li><li> EAKIIH610μlの（7.5ミリグラム/ ml）を加え、室温で5分間インキュベートします。 </li><li> TEC混合物にEAK16-II（10mg / ml）の20μlのを追加します。 </li><li>ゲル化を開始するために、システムへの完全培地100μlを加えます。室温で15〜20分間プラットフォームシェーカー上でプレートを置きます。 </li><li> 37℃のインキュベーターでプレートを置き、5％CO 2。 2-4時間後、完全培地の別の100μlのを追加します。 </li><li>使用時まで一日おきに培地交換。 <ol><li>吸引除去し、表面からの培地100μlのマイクロピペットを用いてゲルを乱すことなく、ゆっくりとでは、ウェルの壁にピペットチップを配置することによって、予め温めた培地100μlを追加します。 </li></ol></li></ol> TEC / EAK骨材の5キャラクタリゼーション<ol><li> in vivoでの TEC / EAK凝集体の機能を調べるために、無胸腺ヌードの腎臓被膜下O / N培養と移植後のTEC / EAKヒドロゲルを収集以前に記載された手順11,14を用いて、マウス、。 </li><li> 4-6週間は、抗CD4、-CD8のカクテルで-CD45を移植し、汚れを投稿ヌードマウスからEDTA含有採血管に50〜100μlの血液サンプルを採取することにより末梢におけるT細胞の発生を監視します、および-CD3 12は抗体。 </li><li>単一細胞解析ソフトウェア12を使用して、フローサイトメトリー（FCM）で末梢血白血球におけるTリンパ球の割合を分析します。 </li></ol>

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著者は利益相反を宣言しません。

TECは、胸腺間質の優勢な集団であると胸腺の構造と機能のために重要な役割を果たしているが、それらは、総胸腺細胞充実の約0.1から0.5パーセントを表します。彼らはまた、細胞死の高いパーセンテージは時折すなわち 、治療は、細胞外マトリックス（ECM）からのTECを解離するために、コラゲナーゼ消化後に観察されている脆弱な細胞です。その希少性（マウス胸腺あたり200,000）および脆弱性は、それのTECを分離するためにやりがいのある仕事ました。 TECの分離における高度に精製されたコラゲナーゼの最近の使用率が大幅に酵素消化15-19以下の生きた細胞の数を増加しています。 抗体を大量に細胞表面標識およびFACSによって収集される必要があるイベントの過剰な数のために必要とされるが、TECの非常に小さな数は、それらの分析および分離のための主要な課題です。抗体コンジュゲートしながらD磁気ビーズ技術は、CD45 +胸腺細胞を枯渇させるために使用することができ、それらの大量長期的には、それが経済的に法外なレンダリングします。我々は効果的に単純な、1ステップ密...

胸腺は、獲得免疫系の機能に必須である病原体反応、自己寛容T細胞の多様な集団の生成を担う主要なリンパ器官です。それは、胸腺細胞の開発、リンパ球前駆細胞として骨髄から移住動的な器官である、胸腺間質のスポンジ状の三次元（3-D）マトリックスを通って移動し、系統仕様と分化を起こし、最終的にのように移住します成熟T細胞。このよくプログラムされたプロセスの成功は、移行胸腺細胞や住宅胸腺上皮細胞（TECを）、胸腺微小環境の整合性を確立し、維持するために必須である胸腺間質の優勢な集団間のクロストークに大きく依存します。 その解剖学的位置とユニークな機能に基づいて、TECのは、2つのサブセットに分けることができます。皮質でのTEC responある（cTECs）1,2- T細胞（正の選択）を制限し、自己MHC（主要組織適合遺伝子複合体）を選択するためのsible、および自己反応性T細胞を除去するために不可欠である髄質（mTECs）中のTEC（負の選択）。多くの要因（ 例えば 、老化、感染症、放射線照射、薬物治療）は妥協適応免疫が得られ、胸腺上皮に不可逆的な損傷を引き起こす可能性があります。多くの試みにもかかわらず、胸腺機能を回復することは、胸腺微小環境を再現する難しさに挑戦してきました。 2次元環境で培養のTECが急激胸腺形成3,4のための重要な遺伝子の発現を減少させる一方、特に、胸腺三次元（3-D）の構成は、のTECの生存および機能に重要です。 EAK16-II（AEAEKAKAEAEAKAK）およびそのC末端histidinylatedアナログEAKIIH6（AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH）は低分子量であり、脱イオンWATEに可溶性である両親媒性オリゴペプチドRが、20mMのNaClを（ヒト体液中の正常な塩濃度は、154 mMで）より高いイオン強度に曝されたとき、β原線維を形成するためにゲル化を受けます。この環境応答性は、3D構造を形成するように多目的なビルディングブロックを作ります。複合タンパク質薬物および他の生体分子を固定するためのアダプタとして機能することができる（：EAKII-H6上のHisタグは、ドッキング機構を、これにより抗HisのIgG / Fc結合組換えタンパク質A / G（PA / GはαH6）提供します例えばヒドロゲル複合5-8に、抗体）。 我々は以前に、ヒドロゲルに固定蛍光標識されたIgG分子は、最大13日間9のための注入部位に保持することができることを実証しました。 αH6時更に、抗CD4 IgGを用いて固定PA / GアダプタがEAK16-II / EAKIIH6（EAK）ヒドロゲルに添加し、CD4 + T細胞を特異的に10を捕捉しました。同様の技術を使用して、我々は最近のTEC Cの3-Dの凝集を実証しています（：PA / G：αEpCAMαH6）TEC-特定の抗EpCAM抗体を運ぶアダプター複合体とEAKハイドロゲルに昇格するウルド。ヌードマウスの腎臓カプセル下に移植した場合、EAKハイドロゲルに埋め込 ​​まれたTECクラスタが効果的に生体内11,12に機能的なT細胞の開発を支援することができます。 ここでは、迅速かつ効果的に蛍光活性化細胞選別（FACS）でのTECを浄化し、EAKハイドロゲルシステムと3次元TEC凝集体を生成するために、我々の方法を示します。

<table><tbody><tr><td>TEC Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701(1 Gallon)</td><td>エタノール 200 プルーフ、脱イオン水</td></tr><tr><td>解剖ハサミ、ストレート</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子、ストレート</td><td>ファイン サイエンス ツールズ</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子、湾曲</td><td>ファイン サイエンス ツールズ</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>洗浄液</td><td></td><td></td><td>1x PBS、0.1% BSA、2&nbsp;mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (ウシ血清アルブミン)</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (エチレンジアミン四酢酸)</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>消化液</td><td></td><td></td><td>9 ml RPMI-1640, 0.025&nbsp;mg/ml リベラーゼTM研究用グレード、10&nbsp;mM HEPES、0.2&nbsp;mg/ml DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>「精製コラゲナーゼ」</td></tr><tr><td>1&nbsp;M HEPES</td><td>ロンザ</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp;ml遠心分離管</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp;mm組織培養皿</td><td>ファルコン</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp;cc U-100 インスリン注射器 28&nbsp;1/2&nbsp;G</td>ベ<td>クトン・ディキンソン</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp;mlポリスチレン丸底チューブ</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp;mlガラスピペット</td><td>フィッシャーヘルスケア</td><td>13-678-27E</td><td>胸腺の破片をすすぐために使用します。胸腺の破片は、プラスチック製のピペットで壁に付着する傾向があります。</td></tr><tr><td>MACSmixチューブ回転子</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp;&マイクロ;m セルストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>密度グラジエント培地: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp;mlポリプロピレン丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD16 / CD32(Fcブロック)</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553142</td><td>原液としての使用、2&nbsp;&マイクロ;l サンプルあたり</td></tr><tr><td>抗マウス CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>1:150, 10&nbsp;&マイクロ;l サンプルあたり</td></tr><tr><td>抗マウスCD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>1:100、10&nbsp;&マイクロ;l per sample</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルセル解析ソフトウェア</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK Gel Assembly</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Tag</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td><td>"anti-His-Tag IgG"</td></tr><tr><td>精製抗マウスCD326 (EpCAM)</td><td>BioLegend</td><td></td> <td>118202"anti-EpCAM IgG「</td></tr><tr><td>組換えタンパク質A/G</td><td>Pierce Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5」&nbsp;ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>「1.5&nbsp;ml微量遠心チューブ「</td></tr><tr><td>96ウェル、組織培養プレート、低蒸発蓋付き丸底</td><td>BDファルコン</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングプラットフォーム:ニューテーターミキサー no.1105</td><td>BDクレイアダムス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10%スクロー</td>ス <td>シグマ</td><td>S0389</td><td>滅菌蒸留水で調製</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)</td><td>American Peptide Company&nbsp;</td><td></td><td>カスタム合成、10&nbsp;mg/ml</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHHH-CONH2)</td><td>American Peptide Company&nbsp;</td><td></td><td>カスタム合成、7.5&nbsp;mg / ml</td></tr><tr><td>完全中</td>RPMI-1640<td></td><td></td><td>、10%FBS、1%ペン/連鎖球菌、1%L-グルタミン、1%NEAA、5&nbsp;mM HEPES、50&nbsp;&マイクロ;M 2-メルカプトエタノール</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ウシ胎児血清)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>使用前に不活性化された熱</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200&nbsp;mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (非必須アミノ酸) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp;M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (100x)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>プラットフォームシェーカー: ベリーダンサー</td><td>Stovall Life Sciences Inc.</td><td>モデル:USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

eak 16-ii / eakiih6自己組織化ヒドロゲルとfacs精製した胸腺上皮細胞の3-d集約を推進

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

胸腺退縮は、老化または病理学的損傷に関連しており、成熟T細胞の産生を減少させます。機能不全に陥った胸腺の機能を回復させることは、侵入する病原体に対する効果的なT細胞媒介性獲得免疫応答を維持するために重要です。しかし、胸腺の再生と再生は、胸腺上皮細胞(TEC)の生存と機能に重要な胸腺間質の特異な3D微小環境を再現することの難しさに大きく起因し、困難であることが証明されました。私たちは、両親媒性EAK16-IIオリゴペプチドとそのヒスチジニル化アナログEAKIIH6の自己組織化特性に基づいて、TEC凝集体の形成を促進する新しいハイドロゲルシステムを開発しました。TECは、密度勾配で単離された胸腺細胞から濃縮され、蛍光活性化セルソーティング(FACS)で選別され、抗Him IgGとともにタンパク質A/Gアダプター複合体にアンカーされた抗上皮細胞接着分子(EpCAM)抗体で標識されました。細胞凝集体の形成は、TECをEAKIIH6およびEAK16-IIオリゴペプチドとインキュベートし、次に培地のイオン濃度を上げてゲル化を開始することにより促進されました。EAKハイドロゲルに埋め込まれたTEC凝集体は、無腺ヌードマウスに移植すると、in vivoで機能的なT細胞の発達を効果的に促進できます。

CD45-間質細胞を濃縮するために密度勾配分離プロトコルを使用しての有効性を調べるために、インタフェースと沈殿リンパ球ペレットの両方から採取した細胞を、抗CD45及び抗EpCAM抗体で染色しました。抗ULEX Europaeusアグルチニン1（UEA1）および抗MHCクラスII抗体の両方がさらにCTECとMTECサブセットを識別するために、染色カクテルに含まれていました。 図1に示すように 、我々が日常のTECの15〜20倍濃縮の近くに達成することができました。 EAKヒドロゲル中のTECの凝集を調べるために、のTECは遍在膜結合、赤色蛍光tdTomato分子を発現する、4週齢B6.ROSA MT /ミリグラムマウスから単離しました。上記のように調製TEC凝集体は、（ インビトロで 2日間培養し、共焦点顕微鏡下で検査しました<stron><p...

このビデオは、FACS単離のための密度勾配で胸腺上皮細胞（TEC）を濃縮するプロトコールを示しています。また、EAK16-II/EAKIIH6ペプチドを使用してTEC凝集体の形成を促進する様子も示しています。EAK16-II/EAKIIH6ハイドロゲルの微小環境は、TECの生存と機能を維持するために必要な3D構成を提供します。

EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

この手順の全体的な目標は、胸腺上皮の自己生存と機能をサポートするための三次元構造で胸腺上皮細胞凝集を促進するためのEAK 16-II / EAKIIH6ペプチドの使用を実証することです。この方法は、胸腺の生物工学分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、EAK-16-II/EAKIIH6ペプチドを利用し、胸腺上皮細胞の凝集を促進し、生分解性であり、注射に使用できる可能性があることです。胸腺を収穫するには、まず生後3〜5週齢のC57ブラック6Jマウスを仰臥位に置き、髪を70%エタノールで濡らします。鋭利でまっすぐな解剖ハサミを使用して、腹部の皮膚に小さな水平切開を行います。次に、切開部の両側の皮膚を引っ張って腹腔を露出させます。次に、一番下のリブのすぐ下に横に切り込みを入れ、絞りに対して横向きに切り込みを入れます。鉗子を使用して、剣状突起を引っ張り、胸の両側に沿って肋骨の中央を切り取ります。胸腺がはっきりと見えるように、肋骨と胸骨を引き上げます。次に、湾曲した鉗子を使用して、結合組織から胸腺の葉をそっとすくい取り、洗浄液に入れます。すすぎ後、胸腺を5〜6ミリリットルのRPMI 1640を含む16ミリリットルの組織培養皿に移し、28ゲージのインスリン針を使用して組織を約1立方ミリメートルの正方形に解剖します。次に、ガラス製のパスツールピペットを使用して、皿の中の培地で組織の断片をすすぎます。次に、皿を傾けて、破片を底に落ち着かせます。中澄みを吸引してゆっくりと取り除きます。次に、溶液が不透明でなくなるまで、毎回5〜6ミリリットルの新鮮な培地でさらに4〜5回の洗浄を繰り返します。最終洗浄後、皿に3ミリリットルの消化液を加え、胸腺片と溶液を5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに移します。チューブローテーター上で組織を摂氏37度、12rpmで6分間インキュベートします。回転の終わりに、破片をチューブの底に沈殿させ、パスツールピペットを使用して上清を10ミリリットルの洗浄液を含む15ミリリットルの円錐形チューブに移します。上清を遠心分離し、細胞を氷上の新鮮な洗浄液10ミリリットルに再懸濁します。次に、先ほど示したように、胸腺の断片を回旋子でさらに2回消化し、同じ50ミリリットルのチューブに上清を引き込みます。最終消化後、プラスチック製の2ミリリットル血清ピペットを使用して、残っている断片を粉砕し、組織のフラリーを50ミリリットルのチューブに移します。チューブをスピンダウンして細胞を回収し、ペレットを10ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。次に、チューブを氷の上に置いた状態で、100ミクロンのストレーナーで細胞をろ過します。胸腺上皮細胞を濃縮するには、細胞を再度スピンダウンし、ペレットを2.5ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。次に、20ミリリットルのRPMI 1640を細胞に加え、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、新たに調製した21%密度勾配溶液12ミリリットルを重力によって細胞の下に慎重に層にします。次に、スイングバケットローター内で最も遅い減速速度で遠心分離することにより、細胞を分離します。遠心分離の最後に、最上層と界面を新しい50ミリリットルのチューブに移し、最大40ミリリットルの洗浄液を細胞に加えます。ピペットを使用して3回連続して遠心分離し、各洗浄後に上清を吸引することにより、密度勾配を除去します。次に、最終的なペレットを2ミリリットルの洗浄液に再懸濁してカウントします。胸腺上皮細胞EAK凝集体を生成するには、胸腺上皮細胞を洗浄液で4ミリリットル希釈の5倍10〜4細胞に調整し、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞を低蒸発96ウェル、丸底、組織培養プレートに播種します。次に、調製したばかりの14.6マイクロリットルのタンパク質AGアダプター複合体を各ウェルに加え、プレートを摂氏4度のロッキングプラットフォームに置きます。20分後、マイクロピペットを使用して上清を除去し、ウェルあたり200マイクロリットルの洗浄液で細胞を洗浄します。次に、200マイクロリットルの10%スクロース溶液で細胞を再度洗浄します。ペレットをウェルあたり30マイクロリットルの10%滅菌ショ糖溶液に再懸濁します。次に、細胞を10マイクロリットルのEAKIIH6で室温で5分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、20マイクロリットルのEAK 16-IIを加え、続いて100マイクロリットルの完全培地を加え、プレートを室温のプラットフォームに置いてゲル化を開始します。15〜20分後、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに2〜4時間移します。次に、さらに100マイクロリットルの完全培地を追加し、プレートをインキュベーターに戻します。培地を交換するには、マイクロピペットを使用して、ゲルを乱さずに培養物の表面から100マイクロリットルの培地を吸引し、先端を各ウェルの壁に当てて、100マイクロリットルの予熱培地を培養物に播種します。今示したように密度勾配分離プロトコルを使用すると、CD45ネガティブ間質細胞は、これらの代表的なドットプロットに示されているように、日常的に15〜20倍濃縮できます。ここでは、先ほど示したように、4週齢の赤色蛍光発現トランスジェニックマウスから調製した胸腺上皮細胞凝集体をin vitroで2日間培養し、共焦点顕微鏡で調べました。一度習得すると、胸腺上皮細胞は3〜4時間でフローソーティングのために濃縮できます。この技術の開発後、この技術は、胸腺組織工学の分野の研究者が、適応免疫系を調節するための注射可能な機能的なミニ胸腺ユニットを開発する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

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