クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

この技術の全体的な目標は、凍結破砕された葉組織サンプルのクライオ走査型電子顕微鏡を使用して、光合成膜の超分子組織を研究することです。この方法は、細胞やオルガネラの形態学的特性評価、膜内在性タンパク質複合体の分布、バイオミネラルの局在など、細胞生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、凍結破壊が葉組織に対して行われるため、チラコイド膜の超分子組織化が天然のオルガネラおよび細胞の状況内で調査されることです。

この方法は、ここでは生物学的サンプルで実証されていますが、ゲル、ポリマー、薬物送達システムなどにも適用できます。一般的に、これらの手順に不慣れな個人は、すべてのサンプルが十分に凍結または適切に破砕されるわけではないことに注意する必要があります。高圧凍結による葉組織の凍結固定を行うには、まず、0.1〜0.2mmのアルミニウム血小板の0.1mmの空洞の底をカミソリの刃の角を使用して引っ掻くことから始めます。

6つのサンプルに対して少なくとも12個の血小板を準備します。次に、無水エタノールを使用して血小板を洗い、清潔な皿に保管します。高圧凍結機を準備した後、サンプルボックスに液体窒素を入れます。

かみそりの刃で、植物から葉の小片を切り取り、ピンセットを使用して、1つのヘキサデカンで半分満たされた微量遠心チューブ内に組織を置きます。葉組織の細胞間空間に浸潤するには、テキストプロトコルに記載されているように準備された浸潤装置の先端を微量遠心チューブの蓋の穴に挿入し、プランジャーを引っ張って真空を作り出します。約30秒後、プランジャーを放します。

次に、ピンセットを使用して、チューブから葉片を取り外します。かみそりの刃を使用して、血小板に収まるほど小さいピースをカットします。また、必要に応じて、葉を0.2ミリメートル未満の厚さにトリミングします。

組織の崩壊を防ぐために、高圧凍結する前に葉に液体を浸します。サンプルの厚さは、ガラス固化サンプルを得る可能性を最大化するために、200ミクロン未満に保たれています。傷面を上にしてきれいな血小板を冷凍機のホルダーに入れます。

そして、切り取った葉片を血小板に入れます。1つのヘキサデカンを使用して血小板の残りのスペースを埋めてから、引っかき傷を葉に向けて別の血小板を使用してサンドイッチを閉じます。ホルダーを閉じて締めます。

ジェットボタンを押してサンプルを凍結します。次に、ホルダーをすばやく液体窒素に移します。プレクールピンセットを使用してサンドイッチをホルダーから取り外し、サンドイッチを割らないように注意してください。

この手順には2つの重要なステップがあります:凍結破壊はランダムなプロセスであり、その成功はクライオSEMと二重層コーティングでのみ評価できます。これは、ビーム損傷を最小限に抑えて高倍率画像を取得するために必要です。メーカーの指示に従ってフリーズフラクチャーマシンを準備およびプログラミングしながら、プラチナカーボンまたはPt/Cガンを45度に、カーボンガンを90度に置きます。凍結破壊システムステージをマイナス140度またはマイナス160度に冷却します。

次に、真空クライオトランスファーシャトルを機械に取り付け、液体窒素を使用してシャトルチャンバーを充填します。凍結破砕試験片ホルダーをローディングステーションに挿入し、液体窒素でローディングステーションチャンバーを充填します。次に、高精度グレードのピンセットを使用して、冷凍サンドイッチをホルダーにセットし、所定の位置に締めます。

次に、ホルダーを裏返してサンドイッチが所定の位置に固定されていることを確認し、2番目のサンドイッチについても繰り返します。冷却されたシャトルを凍結破壊機から取り外し、ローディングステーションに接続します。次に、シャトルバルブを開き、格納アームをホルダーに導入し、所定の位置にロックして、ホルダー付きのアームをシャトルに再導入します。

シャトルを凍結破壊機に再度取り付けた後、格納アームを使用してホルダーをチャンバーに導入します。次に、凍結骨折ミクロトームナイフを高さに合わせ、サンドイッチの上部の血小板をノックオフします。ミクロトームナイフで、サンドイッチをすばやく壊します。

そして、すぐにナイフを持ち上げて、ナイフに付着した破片によるサンプルの汚染を防ぎます。冷却されたシャッターを新たに露出した平面の上に配置して、チャンバー内の水分子による汚染の可能性からサンプルを保護します。次に、サンプルをプラチナでコーティングするには、[セットアップ]を押して画面にレイヤー1を表示します。

次に、GUN 1ボタンを押してからONボタンを押して、Pt/Cガンの電源を入れます。蒸発速度を調べ、毎秒0.02〜0.04ナノメートルに達したら、測定ボタンを押して、堆積層の厚さを監視すると同時にサンプルを露出させます。カーボンでコーティングするには、GUN 2を選択してからONボタンを選択します。

蒸発速度が毎秒約0.1ナノメートルになったら、測定ボタンを押すと同時にシャッターを動かしてサンプルを露光します。コーティングが完了したら、ステージをマイナス120°Cまで温めます。クライオ作業用の走査型電子顕微鏡を準備するには、メインメニューから「ステージ」、「ステージ初期化」の順に選択し、確認します。

「Vacuum」タブで、「Vent」ボタンをクリックして顕微鏡チャンバーをベントします。次に、[ツール]、[パネルに移動]の順に選択し、[ステージポイントリスト]パネルを開きます。CRYO EXCHANGEの位置を選択して、サンプルホルダーを受け入れるための適切な座標にステージを移動します。

清潔な手袋を着用したまま、試料チャンバーを開き、クライオステージを顕微鏡のメインステージに挿入します。チャンバーを閉じ、[Vacuum]タブで[Pump]ボタンをクリックします。次に、顕微鏡デュオールに液体窒素を充填して顕微鏡を冷却します。

ステージの温度がマイナス120°Cを下回ったら、クライオトランスファーユニットの熱機能を作動させ、ステージをマイナス120°Cまで温めます。次に、クライオトランスファーシャトルを顕微鏡に取り付け、リトラクトアームを使用してサンプルホルダーを顕微鏡クライオステージに移します。ジョイスティックを使用して、試料ホルダーを対物レンズに慎重に近づけます。

「アパーチャ」タブで、10 ミクロンのアパーチャを選択します。次に、[Gun (ガン)] タブで [EHT Target (EHT ターゲット)] フィールドをダブルクリックし、EHT ターゲットに 10 キロボルトを入力して [OK] をクリックします。次に、加速電圧をオンにするには、下部の[EHT]タブをクリックして[EHT]を選択し、[検出器]タブで[On.In]ドロップダウンリストから[InLens]を選択します。次に、[スキャン]タブをクリックし、ビームの損傷を最小限に抑える高速スキャンであるスキャン速度を1に等しく、ストア解像度が1024 x 768ピクセルになるように選択します。

[ノイズリダクション] ドロップダウンリストで [ライン平均] を選択し、検索用に n の値を 20 から 30 ラインに調整します。次に、キーボードのControlキーとTabキーをクリックして、centerpoint機能を使用してサンプルを関心のある領域に移動すると同時に、細胞が割れた領域を拡大するために識別します。細胞が破砕した領域を特定したら、拡大しながらサンプルをスキャンして、破砕した葉緑体を見つけます。

次に、ノイズ低減のために、ラインの平均 n 値を 100 より大きい値に変更します。「スキャン」タブで、「フリーズ」を押してスキャンを停止します。キーボードの Control Shift Tab を押すと、中央機能機能を使用して、興味深い葉緑体骨折の面にズームインします。また、高倍率の画像は以前と同じパラメータを使用して取得されます。

最後に、 TIFFを保存 ボタンをクリックして画像を保存します。テキストプロトコルに従って画像解析を行います。この図は、骨折した細胞の大きな領域を持つ高圧凍結凍結破砕Craterostigma Pumilum葉片を含む血小板のクライオSEM画像を示しています。

この例では、リーフピースがありません。しかし、葉の組織は残り、血小板のナイフ溝に付着していました。成功したフラクチャーが見つかった後、細胞の低倍率画像を取得して、フラクチャーされた葉緑体などの関心領域を特定します。チラコイド膜の骨折面を特定するために、単骨破砕された葉緑体の画像が取得されます。

この例に示されているのは、C.Pumilumの葉のチラコイド膜の高倍率画像です。4つの異なる破砕面を区別することができます。積み重ねられた膜と積み重ねられていない膜の外形質破砕面、それぞれEFとEFu、および積み重ねられた膜と積み重ねられていない膜、PFとPFuの原形質面。

光化学系II(PS2)は、EFの積層グラナ膜領域とEFuストロマラメラ膜領域の両方に位置しています。ハイドレートすると、PS2 密度は EFu よりも EF の方が約 3 倍高くなり、2 つの面が区別されます。C.Pumilumの脱水中、EF中のPS2の密度は徐々に減少し、水和条件ではその密度の約半分に達する。

特に、相対水分含有量の5〜10%までさらに脱水すると、PS2複合体は列と配列に組織化されます。凍結破壊レプリカ技術の開発は、膜タンパク質複合体のサイズと生体膜内のそれらの配置を研究する道を開きました。凍結破壊とクライオSEMでの高圧凍結の組み合わせにより、組織や細胞レベルからほぼネイティブな状態の高分子レベルまで、さまざまな種類のサンプルをいくつかのサイズスケールで調査できます。

ここに示す手法に加えて、エネルギー分散型X線分光法(EDS)などの方法もクライオSEMに適用できます。たとえば、バイオミネラルのアルカリ化などです。