Name: クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: 学ぶ凍結破砕法を用いたクライオ走査電子顕微鏡による葉組織内の光合成膜の超分子組織解析。この手法は、チラコイド膜の生体内構造と膜タンパク質複合体の局在を詳細に観察できる。

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私たちは、電子顕微鏡イメージングをスキャンする上で彼の有益な助言のためのアンドレスKaech（チューリッヒ大学）を感謝します。この作品は、米国・イスラエル国間農業研究と開発基金（無許可。US-4334から10を、ZR）を、イスラエル科学財団（無許可。1034年から1012年に、ZR）を、ヒューマン・フロンティア・サイエンス・プログラムによってサポートされていました（RGP0005 / 2013、ZR）。電子顕微鏡研究は、ワイツマン科学研究所でナノ・バイオ・ナノイメージング用アーヴィングとChernaモスコウィッツセンターで行われました。

高圧凍結により葉組織の1クライオ固定注：このセクションでは、凍結破壊実験のための葉組織の高圧凍結を実行する方法について説明します。植物試料に関連する考慮事項については29を参照してください。これは、いくつかの修飾を有する組織または試料の他のタイプに適合させることができます。 <ol><li>カミソリ刃の角を使用して、0.1 / 0.2ミリメートルのアルミニウム血小板（ 図1）の0.1ミリメートルのキャビティの底部を傷つけます。少なくともダースの血小板（6サンプル）を準備します。ディスクの円周上にナイフマークを作成しないように注意してください。 <ol><li>無水エタノールにディスクを洗って、引っ掻き後、それらを乾燥させ、清潔な皿に保ちます。 </li></ol></li><li>製造業者の指示に従って、高圧の冷凍機を準備します。イソプロパノールで高圧冷凍機のアルコール室を埋めます。 </li><li>自家製真空支援infiltratioを準備液体と葉組織に見出されるガスを置換するn個のデバイス。 <ol><li>しっかりと10ミリリットル注射器の先端に200μlのピペットチップを接続します。先端の〜1cmに切断してください。しっかりカット先端に合わせて1.5ミリリットルのマイクロチューブのキャップに穴を作ります。真空は、シリンジのプランジャーを引くことにより、チューブ内に作成することができます。 </li></ol></li><li>カミソリの刃を用いて植物から葉の小片をカットし、ピンセットで1ヘキサデセンで半分満たされたマイクロチューブの内側の葉を置きます。優しく真空を作成するためのプランジャーを引いて、液体と葉の間のスペースに侵入、約30秒間保持し、その後ゆっくりプランジャーを解放します。 </li><li>ピンセットを使用してチューブから葉片を削除します。それは0.2ミリメートルよりも厚い場合にはカミソリの刃で葉をトリミングし、血小板に収​​まる小片をカット。 </li><li>冷凍機のホルダーに傷側を上にしてきれいな血小板を配置し、その後ルの切断片を配置血小板へのaf。 1-ヘキサデセンと葉の周囲の残りのスペースを埋めます。葉が直面している傷と、別の血小板を用いたサンドイッチを閉じます。 </li><li>閉じて、ホルダーを締め、機械のチャンバーに挿入します。そして、（〜300のための2100バール - 500ミリ秒）を凍結する「ジェット」ボタンを押すと、すぐに液体窒素中にホルダーを移します。慎重にサンドイッチを破砕しないように注意しながら、予め冷却したピンセットを用いて、ホルダーから冷凍サンドイッチを削除します。 注：クローズド冷凍サンドイッチは、凍結すぐに骨折したり、後で使用するために液体窒素中に保持することができます。液体窒素を取り扱うときは防護服やメガネを使用してください。 </li></ol> 2.フリーズフラクチャーと二層コーティング27,28 <ol><li>製造元の指示に従って、両方の白金/炭素（のPt / C）を蒸発させるための銃や炭素を含む、使用のために凍結破砕機を準備します。 45度でのPt / C銃を置きますndは90度で炭素銃。 <ol><li>プリプログラムのPt / Cの2-nmの層のコーティングスキーム（被覆率0.02から0.04 nmの/秒）と（〜0.1 nmの/秒での）炭素の6 nmの層。 <ol><li>凍結破砕機の画面上の設定を入力します。コー​​ティングスキームを保存するユーザー番号を選択します。 </li><li> 「レイヤー1」のためのPt / Cを選択してください。時間枠を選択例えば 、5分（コーティングを完了するのに必要な所要時間を超えます）。 2nmの厚さを定義するために、上下の矢印を使用してください。 </li><li>セレクト炭素を除いて、2の手順を繰り返し2.1.1.2レイヤと6nmの厚さを定義するために移動するには「レイヤー」ボタンを押してください。 </li></ol></li><li>銃の動作をテストおよび調整します。 <ol><li> 「レイヤー1」を選択します。 「GUN1」ボタンを押すことでのPt / C銃を選択し、凍結破砕機の蒸発制御ユニットに「ON」ボタンを押してください。蒸発速度を監視し、UNT電圧と発光ノブを使用してそれを調整します0.04 nmの/秒 - イルは、0.02の割合に達しました。 Pt / C銃をオフにするを押して「OFF」。 </li><li> 「レイヤ2」を選択します。セレクト「GUN2」を除いて、2.1.2.1を繰り返し、〜0.1ナノメートル/秒の蒸着速度を調整。 </li></ol></li></ol></li><li> （水和または脱水葉のために、それぞれ）-140 Cまたは-160℃に凍結破壊システムのステージを冷却します。マシンに真空凍結移送シャトルを取り付け、液体窒素で、その室を埋めます。 10 -7×8ミリバール-冷却凍結破砕チャンバ内の圧力は、通常、1の間です。 </li><li>ローディングステーションに凍結破砕試料ホルダー（3 mmの血小板に適した）を挿入します。液体窒素でローディングステーション室にあふれます。 </li><li>高精度グレードのピンセットを使用して1つによって、ホルダ1の上に2冷凍サンドイッチをロードします。ホルダーに最初のサンドイッチを締めて、それが所定の位置にしっかり収まることを確認するためにホルダーを裏返し。第二のサンドイッチのために繰り返します。 </li><li> D凍結破砕機から冷却シャトルをetachとローディングステーションに接続します。 、シャトル弁を開き、ホルダーに後退アームを導入し、所定の位置にロック。シャトルにホルダーとアームを再導入し、ローディングステーションノブを使用して、シャトル弁を閉じます。凍結破砕機にシャトルを取り付け、後退アームとチャンバー内にホルダーをご紹介します。マシンからシャトルを取り外します。 </li><li>それはサンドイッチのトップ血小板をオフにノックするような高さに凍結破壊ミクロトームナイフを合わせます。 </li><li>ミクロトームナイフで、すぐにサンドイッチを壊し、その後、すぐにナイフに破片しがみついによってサンプルの汚染を防止するために、それを上げ、中の水分子によって汚染の可能性からのサンプルを遮蔽するために新たに露出した平面の上に冷却されたシャッターを回しますチャンバー。 </li><li>コー​​ト白金および炭素を含むサンプル。 <ol><li>皮下の「レイヤ1」を入力してくださいREEN。ボタンを「ON」に続いて「GUN1」ボタンを押すことでのPt / C銃をオンにします。蒸発速度を調べ、それが0.02に達すると - 0.04ナノメートル/秒、同時にサンプルを公開し、堆積層の厚さを監視するために、「測定」ボタンを押してください。 注：厚さが事前に選択された値に達したときに銃が自動的にオフになります。 </li><li> Pt / Cの蒸発が完了したときにシャッターを有するサンプルをカバーします。 </li><li> 「レイヤ2」に移動するには「レイヤー」ボタンを押してください。繰り返します（炭素用）」GUN2 &#39;とは0.1nm /秒〜の蒸発速度を選択することを除いて、2.8.1と2.8.2のステップ。 </li></ol></li><li> -120℃に凍結破壊システムのステージを温めます。 </li></ol> 3.クライオ走査電子顕微鏡<ol><li>クライオ作業のための走査型電子顕微鏡を準備します。 <ol><li>メインメニューからステージ/ステージ初期化を選択して確定します。 </li><li> [ツール/ガットOパネルには、リストから選択して「エアロック」パネルを開きます。 「閉じる列商工バルブ」ボタンをクリックします。 「真空」タブの下ベントボタンをクリックして、顕微鏡室ベント。 </li><li>ツール/後藤パネルを選択して、「ステージポイントリスト」パネルを開きます。サンプルホルダを受け入れるための適切な座標にステージを移動するためのクライオ交換位置を選択します。注：「凍結交換位置は、「真空搬送ユニットの位置に位置合わせとなるように予め設定されています。 </li><li>手袋のきれいなペアを持つ試料室を開き、顕微鏡のメインステージにクライオステージを挿入します。チャンバーを閉じ、「真空タブ」の下にポンプ]ボタンをクリックします。 </li><li> -120℃に顕微鏡を冷却します。液体窒素で顕微鏡デュワーを埋めます。ステージの温度が-120℃以下に下がると-120℃にクライオ転送制御部への熱の機能を有効にします。 </li></ol></li><li> ATT顕微鏡にクライオ移送シャトルをACHと（ステップ2.5のように）顕微鏡クライオステージに後退アームを使用して、サンプルホルダーを転送します。顕微鏡からのシャトルを取り外します。 </li><li>エアロックパネルの「オープンカラム商工バルブ」ボタンをクリックしてください。 </li><li>ジョイスティックを使用して - （2ミリメートル作動距離1）慎重に、対物レンズに近い試料ホルダーを移動します。 「開口部」タブで10μmの開口部を選択します。 「ガン」タブでEHTフィールドをダブルクリックします。 EHTターゲットの10（キロボルト）を入力し、[OK]をクリックします。底EHT]タブをクリックし、「EHTオン」を選択します。 </li><li> 「検出器」タブ内の検出器ドロップダウンリストから「InLens」を選択します。必要に応じて（ピント、明るさやコントラスト、ビームアライメント、非点収差）撮影条件を最適化します。 </li><li> 「スキャン」タブをクリックします。ビームのダメージを最小限にするために（ピクセルあたり100ナノ秒の滞留時間に対応する、「スキャン速度= 1 &#39;）の高速スキャンを選択し、1024×768ピクセルの「ストア解像度」。 「ノイズリダクション」ドロップダウンリストで「ライン平均」を選択します。検索のための30行 - 20にNの値を調整します。骨折した細胞と葉緑体（ 図2Aおよび図2B）を有する領域を検索する（キーボード上のコントロールのタブを押して）「センターポイント」機能を使用してサンプルを移動します。 </li><li> （ - 70 KX 50）（ 図2Cおよび2D）低倍率で骨折した葉緑体の画像を取得します。興味深いの葉緑体骨折の顔にズームインし、高倍率で画像を取得する（キーボード上のコントロールシフト-タブを押して）「センター機能」機能を使用します（100から200 KX、3および図4）。画像取得のためのステップ3.6と同じパラメータを使用しますが、ノイズリダクション30 N&gt; 100へのライン平均値を変更します。 <ol><li>スキャンを停止し、保存するための主顕微鏡制御部上または「スキャン」タブで記者フリーズ「保存TIFF」ボタンを押して画像を表示します。 </li></ol></li></ol> 4.画像解析注：このセクションでは、フィジー31のオープンソースパッケージを使用して凍結破壊SEM像から膜粒子のセグメンテーションのための短い手順を説明します。同様の結果が他の画像解析ソフトウェアを用いて得ることができます。 <ol><li>メインプログラムウィンドウに画像ファイルをドラッグしてフィジーで画像を開きます。イメージ/タイプ/ 8ビットを選択することにより、8ビットにイメージを変換します。選択画像/ /明るさ/コントラストを調整し、必要に応じて（ 図5A）を調整します。 </li><li>直線ツールを使用して、ラインに埋め込まれた画像のスケールバーのサイズを引きます。分析/セットスケールを選択します。適切なスケール情報（長さの既知の距離と単位）を入力し、[OK]をクリックします。この調整スケーリングされた画像を保存します。 </li><li>選択プロセス/フィルター/ガウスぼかし（1.5 nmの半径）とOK（ 図5B）をクリックします。 </li><li>選択画像/ / AUTを調整します（Niblack法を使用して）ローカルしきい値oおよびOK（ 図5C）をクリックします。 </li><li> [編集/反転およびプロセスを選択/バイナリ/流域（ 図5D）。 </li><li>フリーハンド選択ツールで関心領域（ROI）の周りに境界線を描画します。編集/選択を選択することにより、ROIマネージャーに選択を追加/マネージャまたは &#39;T&#39;をクリックして追加します。 </li><li>外編集/クリア（ 図5E）を選択します。 </li><li>セット/分析測定を選択し、適切なパラメータ（ 例えば、面積、フィット楕円）を選択します。 </li><li>粒子を分析/分析]を選択します。オプション &#39;縁に除外」し、[OK]をクリックし、必要に応じて、「Managerへの追加」と、粒子の大きさについて適切な範囲を入力し、「結果の表示」をマークします。その結果を図5Fに示されています。 </li><li>保存されたスケーリングされた画像化されたファイル（ステップ4.2）を開きます。 「すべて表示」を選択し、ROIマネージャの「ラベル」を選択解除します。選択した気難しいを確認レは、元の画像の上に置いて、手動で追加またはROIマネージャのボタンを「追加」または「削除」使用して選択を削除します。フリーハンド選択ツールとROIマネージャー（ 図5G及び5H）の「更新」ボタンを使用して、必要な任意の選択を修正してください。 </li><li>得られた測定値を使用してデータを分析します。結果ウィンドウで、結果をクリックして/、例えば、取得するために平均エリアを要約し、ROIマネージャに表示された粒子の長軸と短軸を意味します。結果/ディストリビューションをクリックし、（このような領域のような）パラメータを選択して、このパラメータのヒストグラムを表示するには、[OK]をクリックします。 </li></ol>

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<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).</li>
<li>Nevo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+Thylakoid+Membrane+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Photosynth%22%5BJournal%5D)">Architecture of Thylakoid Membrane Networks.</a> Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この論文に記載された技術は、低温走査型電子顕微鏡によるよく保存高圧凍結した植物組織のコンテキスト内で凍結破断した膜の調査を可能にします。これらの手順を使用することの主な利点は、試料調製は、純粋に物理的なことです。化学物質や脱水を伴う全く手順は必要ありません。これにより、ネイティブに近い状態26,32で生物学的構造を研究することができます。葉組織を使用する利点は1つが葉緑体の中に、 すなわち 、それらの天然の生理学的コンテキスト内で、全体的な細胞組織に関する情報、ならびにチラコイド膜のような研究の特定の膜を得ることができるということです。 C.を研究に不可欠もう一つの利点、異なる相対含水率（RWC）でpumilum植物は、その水和状態が準備中に変更されていないことです。これは、出発物質として単離葉緑体やチラコイド膜を利用に反対しているように凍結破壊実験のために。後者では、1はまた、いくつかの構造的および/または超分子の変化の可能性が高い細胞小器官/膜分離中に行われることを考慮しなければなりません。 比較的厚い...

酸素発生型光合成、古代のシアノバクテリアに起因するが、葉緑体の細胞小器官の開発につながっ内共生イベントによって藻類や陸上植物に継承されました。すべての現代の酸素発生光栄養生物では、光合成電子伝達とプロトン起動力と還元力の発生が「チラコイド」膜と呼ばれる平坦化嚢様小胞内に行われています。これらの膜は、光合成の光駆動反応を行い、エネルギー変換のための媒体を提供するタンパク質複合体を収容します。植物や（一部）の藻類のチラコイド膜は、2つの別個の形態学的ドメインに区別される：「間質ラメラ」と呼ばれる「グラナ&#39;とグラナを相互接続積み重ね膜と呼ばしっかり密着膜領域、1。植物や藻類チラコイド膜の様々な凍結破壊の研究は1970年代初めに開始し、行われています。とき凍結破砕、膜細胞区画に応じて、exoplasmic顔（EF）と原形質顔（PF）を生成、それらの疎水性コア2に沿って分割する半膜ボーダー、もともとBranton らによって造語として。 。それぞれ、 &#39;S&#39;と&#39;U&#39;表す「積み重ね」と「アンスタック」膜領域と、EFでは、EFU、のPFとPFU：1975年3工場と藻類チラコイドは、4つの異なる破断面を有します。分割または破壊されていない膜タンパク質の複合体は、膜のE又はP側のいずれかに留まる傾向を有します。チラコイドの異なる破断面は、異なるサイズの粒子および密度4、及び続く多数の調査を含む初期の観察は、光反応を行う観察粒子と膜タンパク質複合体との間の識別と相関関係につながっ5-13 （また、14,15をレビュー参照）。 FREチラコイド膜のエズ-破壊実験は、通常、単離手順中に発生する可能性があり、構造的および/ ​​または超分子組織内の任意の変化の危険にさらされ、（ただし、16,17を参照）葉緑体または単離されたチラコイド膜の調製物に対して実施されます。破砕後、レプリカが厚いカーボンの層（C）、および生物学的材料18の最終的に消化し ​​て、その後、白金/カーボン（白金/ C）を蒸 ​​発させることによって調製されます。複製は、透過型電子顕微鏡（TEM）によって可視化されます。従来の凍結割れレプリカ法は、 例えば 、光合成膜と異なるへの適応の超分子組織を研究するための重要なツールとして機能し続けています。、光、条件19-23。 homoiochlorophyllous復活工場Craterostigmaのpumilum 24の我々の最近の研究では、超分子組織Oの変化を調査することを目的としましたチラコイド膜Fも含め全体としての細胞組織内の、脱水及び再水和中。 homoiochlorophyllous復活種の独自性は、彼らが彼らの光合成装置を保持しながら、それらの栄養組織（葉）で乾燥の条件を生き残ることができるということです。水が利用可能になると、これらの植物は回復し、数日25時間以内に光合成活動を再開する。この研究のために、凍結破砕葉試料の低温走査EM（SEM）イメージングは​​、高圧力がサンプルクライオ固定化のために凍結と一緒にしました。これらの手順は、その天然の状態26に近い状態で凍結された水和生物学的サンプルを可視化する手段を提供します。一つの主な利点は、サンプルが無い連続工程で凍結破断し、塗布後に直接検討されていることです。その水和状態が準備中に維持されているように、これは、異なる相対含水率（RWC）での植物の調査に特に関連します。どうやってこれまでに、1つのクリティカルな欠点は、凍結水和サンプルは光合成複合体の大きさの正確な測定に必要な高倍率、でスキャンする場合は特に、撮影時の光損傷に苦しむ可能性があることです。これを克服するために、この方法は、特定のクライオSEM撮像条件を利用して組み合わせ「二層コーティング」（DLC）27,28と呼ばれます。これらは、有意に少ないビームと小文字が区別されたサンプルをもたらし、光合成タンパク質超分子組織と復活プラントCの他の細胞成分に関する貴重な情報の解明のために許可されましたその場で高倍率でpumilum。

<table><tbody><tr><td>エタノールabs</td><td>バイオラボ</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>バイオラボ</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-六重セン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0.1/0.2 血小板</td><td>エンジニアリングオフィス M. Wohlwend GmbH, Switzerland</td><td>241</td><td>血小板は直径3mm、厚さ0.5mm(タイプA)、深さ0.1/0.2mmの空洞(直径2mm)です。同様の血小板は、ライカマイクロシステムズから入手できます。</td></tr><tr><td>高精度グレードのピンセット</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72706-01</td><td>デュモン (スイス) デュロスタースタイル #5ピンセット;他の高精度ピンセットと交換できます。</td></tr><tr><td>高圧凍結機</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>高圧凍結の代替品: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH;2. HPM 010、RMCベッカラー;3. EM PACT2、ライカマイクロシステムズ;4. EM HPM 100、ライカマイクロシステムズ;5. EM ICE、ライカマイクロシステムズ。</td></tr><tr><td>凍結破壊システム</td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>クライオ調製ローディングステージ</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>単体凍結破砕用試料ホルダー</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>16LZ04746VN</td><td>直径3mmの試料キャリア用クランプホルダー</td></tr> 真空<tr><td>クライオトランスファーシャトル</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>クライオSEMステージ</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>画像取得ソフトウェア</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>Fiji/Image J, 国立衛生</td><td>研究所 http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

凍結破砕サンプルのクライオ走査電子顕微鏡（SEM）は近く、ネイティブ条件での生物学的構造の調査を可能にします。ここでは、葉試料内の光合成（チラコイド）膜の超分子組織を研究するための技術について説明します。これは、高圧葉組織の凍結、凍結破砕、二層コーティングし、最終的にクライオSEM画像によって達成されます。二層コーティング法の使用は、凍結、水和サンプルならびに最小充電効果に最小ビーム損傷に高倍率（&gt; 100,000）の画像を取得することができます。記載された手順を用いて、我々はその場で、復活の植物Craterostigmaのpumilumの脱水中に行わ光化学と光捕集アンテナタンパク質複合体の超分子分布の変化を調べました。

図1は 、高圧凍結、凍結破砕Craterostigma pumilumの葉片を含む血小板のクライオSEM像を示します。いくつかのサンプルでは、骨折した細胞の大部分は、（ 図1A）が得られます。他では、葉片がしっかりとアッパーディスクにバインドされたままで、それ（ 図1B）と一緒に叩き落とされます。しかし、後者の場合には、いくつかの葉の組織は、血小板上のナイフの溝に付着したままであってもよい（ 図1B、矢じり）およびデータのかなりの量は、まだ彼らは骨折した提供、葉&quot;残党&quot;を撮像することにより回収することができます。成功した骨折が見つかった後、細胞の低倍率画像はこの場合、葉緑体（ 図2）において、関心領域を識別するために取得されます。 C....

ここでは、凍結破壊された植物組織を研究する手順を説明します。高圧凍結葉試料は凍結破砕され、二重層コーティングされているため、保存状態の良い凍結水和試料が得られ、クライオ走査型電子顕微鏡を用いて高倍率でイメージングされ、ビーム損傷が最小限に抑えられます。

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

本手法の総合的な目的は、凍結割断した葉組織サンプルのクライオ走査電子顕微鏡観察を用いて、光合成膜の超分子構造を研究することです。この手法は、細胞やオルガネラの形態学的特性、膜貫通タンパク質複合体の分布、およびバイオミネラルの局在など、細胞生物学における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、葉組織に対して凍結割断を行うため、チラコイド膜の超分子構造を、天然のオルガネラおよび細胞内コンテキストの中で調査できる点にあります。本手法では生物学的サンプルを用いて実演していますが、ゲル、ポリマー、薬物輸送システムなどにも適用可能です。一般的に、これらの手順に不慣れな方は、すべてのサンプルが良好に凍結されたり適切に破砕されたりするわけではないことに留意してください。高圧凍結による葉組織の凍結固定を行うには、まずカミソリの刃の角を使用して、0.1〜0.2 mmのアルミニウムプレートの0.1 mmのキャビティの底をひっかきます。6つのサンプル用に、少なくとも12枚の血小板を準備します。次に、絶対エタノールを用いて血小板を洗浄し、清潔なディッシュに保持します。高圧凍結装置の準備が整った後、サンプルボックスに液体窒素を満たします。カミソリで植物の葉から小さな断片を切り出し、ピンセットを用いて、ヘキサデカンを半分まで満たしたマイクロ遠心チューブの中に組織を入れます。葉組織の細胞間隙に浸透させるため、本文のプロトコルに従って準備した浸透デバイスのチップをマイクロ遠心チューブの蓋の穴に挿入し、プランジャーを引いて真空状態にします。約30秒後、プランジャーを離します。次に、ピンセットを用いてチューブから葉の断片を取り出します。カミソリを用いて、プレートに収まる十分な小ささに切り出します。必要に応じて、葉の厚さが 0.2 millimeters 未満になるように調整してください。組織の崩壊を防ぐため、高圧凍結の前に葉に液体を浸潤させます。ガラス化サンプルの得られる確率を最大にするため、サンプルの厚さは200 microns以下に維持します。スクラッチ面を上にして、清潔なプレートを凍結機のホルダーに設置してください。次に、切り出した葉の断片をプレートに配置します。ヘキサデカンを用いてプレートの残りの隙間を満たした後、別のプレートの傷がついている面を葉に向けて重ね、サンドイッチ状に挟み込みます。ホルダーを閉じて固定してください。ジェットボタンを押してサンプルを凍結させます。次に、速やかにホルダーを液体窒素の中へ移します。プレクールしたピンセットを使用して、サンプルを破損させないように注意しながら、ホルダーからサンドイッチを取り出します。本手順には2つの重要なステップがあります。1つ目はランダムなプロセスであり、その成否はcryo-SEMでしか評価できないフリーズフラクチャー、2つ目はビームダメージを最小限に抑えて高倍率画像を得るために必要な二層コーティングです。製造元の指示に従ってフリーズフラクチャー装置の準備とプログラミングを行う際、白金カーボン（Pt/C）ガンを45度に、カーボンガンを90度に設定します。フリーズフラクチャーシステムのステージを-140°Cまたは-160°Cまで冷却してください。次に、真空クライオ転送シャトルを装置に取り付け、液体窒素でシャトルチャンバーを満たします。凍結割断用試料ホルダーをロードステーションに挿入し、液体窒素でロードステーションチャンバーを満たします。続いて、高精度ピンセットを用いて、凍結させたサンドイッチ試料をホルダーにセットし、しっかりと固定します。次に、ホルダーをひっくり返してサンドイッチがしっかりと固定されているかを確認し、2つ目のサンドイッチについても同様に繰り返します。冷却されたシャトルを凍結折断機から取り外し、ロードステーションに接続します。その後、シャトルバルブを開き、リトラクタブルアームをホルダーに挿入して固定し、ホルダーを装着したアームを再びシャトル内に戻します。シャトルをフリーズフラクチャー装置に再装着した後、リトラクタブルアームを使用してホルダーをチャンバー内に導入します。次に、サンドイッチ状のサンプルの上部プレートを切り落とすように、フリーズフラクチャーマイクロトームナイフの高さを調整します。マイクロトームナイフを用いて、迅速にサンプルを破断させます。その後、ナイフに付着した破片によってサンプルが汚染されるのを防ぐため、すぐにナイフを上昇させます。冷却されたシャッターを新しく露出した平面の上に配置し、チャンバー内の水分子によるサンプルの汚染を防止します。次に、サンプルに白金をコーティングするため、Setupを押し、画面にLayer 1を表示させます。次に、「GUN 1」ボタンに続いて「ON」ボタンを押し、Pt/Cガンを起動させます。蒸着速度を確認し、0.02〜0.04 nm/sに達したら、「Measure」ボタンを押して、試料を露光させながら堆積層の厚さをモニターします。カーボンコーティングを行う場合は、「GUN 2」を選択して「ON」ボタンを押してください。蒸発速度が約 0.1 nanometers per second になった時点で、Measure ボタンを押し、同時にシャッターを動かしてサンプルを露出させます。コーティングが完了したら、ステージを minus 120 degrees Celsius まで昇温させます。クライオ電子顕微鏡をクライオ作業用に準備するには、メインメニューから Stage、Stage Initialize を選択し、確定します。「Vacuum」タブにある「Vent」ボタンをクリックして、顕微鏡チャンバーをベントします。次に、「Tools」から「Goto Panel」を選択し、「Stage Points List」パネルを開きます。「CRYO EXCHANGE」ポジションを選択して、サンプルホルダーを受け入れるために適切な座標へステージを移動させます。清潔な手袋を着用し、試料室を開けてクライオステージを顕微鏡のメインステージに挿入します。試料室を閉じ、「Vacuum」タブの「Pump」ボタンをクリックします。次に、顕微鏡のデュワーに液体窒素を充填して、顕微鏡を冷却します。ステージの温度が-120°Cまで下がったら、クライオ転送ユニットの加熱機能を起動し、ステージを-120°Cまで温めます。次に、クライオ転送シャトルを顕微鏡に取り付け、リトラクタブルアームを使用してサンプルホルダーを顕微鏡のクライオステージに転送します。ジョイスティックを使用して、 specimen holder を対物レンズに慎重に近づけます。「Apertures」タブで、10ミクロンのアパーチャを選択します。次に、「Gun」タブの「EHT Target」フィールドをダブルクリックし、EHTターゲットに10 kilovoltsと入力して「OK」をクリックします。続いて、加速電圧をオンにするため、下部の「EHT」タブをクリックし、「EHT On」を選択します。「Detectors」タブのドロップダウンリストから「InLens」を選択します。その後、「Scanning」タブをクリックし、ビームダメージを最小限に抑えるための高速スキャンであるスキャン速度「1」と、保存解像度「1024 x 768」ピクセルを選択します。「Noise Reduction（ノイズ低減）」のドロップダウンリストから「Line Average（ライン平均）」を選択し、探索用にnの値を20から30ラインに調整します。次に、キーボードのControlキーとTabキーをクリックしてセンターポイント機能を使用し、サンプルを関心領域へ移動させながら、同時に倍率を上げて細胞が破壊されている領域を特定します。細胞が破壊されている領域を特定した後、倍率を上げたままサンプルをスキャンし、破壊された葉緑体を探します。次に、ノイズを低減させるため、Line Averageのn値を100以上に変更します。ScanningタブでFreezeを押し、スキャンを停止させます。キーボードのControl Shift Tabを押し、Center-Feature機能を用いて、注目すべき葉緑体の破断面をズームアップし、以前と同じパラメータで高倍率画像を取得します。最後に、Save TIFFボタンを押して画像を保存します。テキストプロトコルに従って画像解析を行ってください。この図は、広範囲に細胞破砕が見られる高圧凍結・凍結破断面のCraterostigma pumilumの葉片を含む血小板のcryo-SEM画像を示しています。この例では、葉の断片が失われていますが、プレートレット上のナイフの溝に一部の葉組織が残っています。良好な破断面が見つかった後、低倍率で細胞の画像を撮影し、破砕されたクロロプラストなどの関心領域を特定します。単一の破砕クロロプラストの画像を撮影し、チラコイド膜の破断面を特定します。この例に示されているのは、C. pumilumの葉におけるチラコイド膜の高倍率像です。ここでは4つの異なる破断面を区別することができます。積み重なった膜および積み重なっていない膜の外原形質面（それぞれEFおよびEFu）、ならびに積み重なった膜および積み重なっていない膜の内原形質面（それぞれPFおよびPFu）がそれにあたります。光化学系II（PS2）は、積層したグラナ膜領域であるEFsと、ストロマラメラ膜領域であるEFuの両方に存在します。水分を含んだ状態では、EFsにおけるPS2の密度はEFuよりも約3倍高く、これにより2つの面が区別されます。C.Pumilumの脱水過程において、EFsにおけるPS2の密度は徐々に低下し、水分を含んだ状態の密度の約半分に達します。注目すべきことに、相対含水率が5～10%までさらに脱水されると、PS2複合体は列やアレイ状に組織化されます。凍結破断面レプリカ法の開発により、膜タンパク質複合体のサイズや生物学的膜内での配列の研究が可能となりました。凍結破断とクライオSEMにおける高圧凍結を組み合わせることで、組織・細胞レベルから、ほぼ天然の状態での高分子レベルに至るまで、さまざまな種類の試料を複数のスケールで調査することができます。ここで示した手法に加えて、エネルギー分散型X線分光法（EDS）などの手法もクライオSEMに適用可能です。例えば、バイオミネラルのアルカリ化の解析などに利用されます。

studying-supramolecular-organization-photosynthetic-membranes-within

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

私たちは、収集する方法のプロトコル全体ミトコンドリアのプロセス電子クライオ断層像を提示する。技術はネイティブ生体膜に大きな膜タンパク質複合体の構造、機能、および組織への詳細な洞察を提供しています。...

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

基本的な技術および透過型電子顕微鏡による検査のための生体試料とナノ材料のフリーズフラクチャー処理の改良が記載されている。この技術は、生体膜の超微細構造の特徴と専門性を明らかにするため、材料科学、ナノテクノロジー製品の超微細構造レベル次元の空間データを取得するための好ましい方法である。...

生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素

高品質の透過型電子顕微鏡画像を取得することは、特に植物細胞の場合、水で満たされた大きな液胞と曝気された空間が豊富にあるため、困難です。タンデム高圧凍結と急速凍結置換により、TEM用の植物試料の調製時間が大幅に短縮され、超微細構造保存性に優れた試料が得られます。...

タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

この論文は、高分子のほぼネイティブな状態の高品質な顕微鏡画像を取得するために使用されるクライオ電子顕微鏡法について説明しています。この方法は、高分子の3D再構成を生成するために考案された単一粒子アプローチを使用したさらなるコンピュータ化された処理に適した画像を生成します。...

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

このプロトコルでは、シアノ バクテリアの一時的な DNA の締固めを可視化する方法について説明します。同期の栽培、蛍光顕微鏡、急速凍結、高によって監視電圧低温電子断層撮影法を使用します。これらの方法のためのプロトコルを提案し、,...

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

キシレム内の水分布を観察することは、木質植物の水流ダイナミクスに関する重要な情報を提供します。本研究では、サンプル調製時の水位のアーティフィスの変化を排除するクライオスタットとクライオSEMを用いて、キシレム水分布をその中で観察する実践的なアプローチを実証する。...

クライオ走査型電子顕微鏡で可視化された木質植物のキシレム水分布

このプロトコルは、APEX2タグ付けされた膜タンパク質を、最適に保存された細胞超構造内の透過電子顕微鏡法によって局在させることができるクライオAPEX法を記述する。...

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

集束イオンビームミリングを使用して、凍結した生物学的サンプルを急落させてクライオ電子線トモグラフィー用にガラス体オングリッドラメラを作成します。...

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

クライオに焦点を当てたイオンビームマイクロマシニングによる、凍結した生体試料のラメラ調製プロトコルを提示し 、その場で...

クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

本プロトコルは、Tomo5を用いた高分解能クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集と、その後のデータ処理およびemClarityを用いたサブトモグラム平均化について記述する。アポフェリチンは、2.86...

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

クライオSTEMトモグラフィーは、埋め込み、切片作成、またはその他の侵襲的な調製物なしで、無傷の細胞の細胞小器官を視覚化する手段を提供します。得られた3D解像度は現在、数ナノメートルの範囲であり、数マイクロメートルの視野および1μmのオーダーのアクセス可能な厚さを有する。...

クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

学ぶ凍結破砕法を用いたクライオ走査電子顕微鏡による葉組織内の光合成膜の超分子組織解析。この手法は、チラコイド膜の生体内構造と膜タンパク質複合体の局在を詳細に観察できる。

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

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