古代生物群集抱いて内部を調査するための冷凍コアの外側部分からの外因性物質の除去

氷圏は、過去の環境条件下で生存し保存された生物へのアクセスを可能にします。本手順の全体的な目的は、凍結コアから外来物質を適切に回収・除去することで、潜在的な多様性を明らかにすることです。この手法により、氷河氷や永久凍土から回収された生物を特定することで、特定の時代に関する貴重な歴史的疑問への回答を得ることができます。

コンタミネーションが混入する可能性が高いため、フィールドで無菌的なコアを採取することは困難です。したがって、この手法の主な利点は、管理されたラボ環境でコンタミネーションの除去が行われることです。スクレイピングや除染のステップは習得が難しい場合があるため、本プロトコルの視覚的なデモンストレーションが重要となります。

この作業は実質的に2人で行う必要があるため、特に多くの忍耐とチームワークが求められます。この手順の実演は、私の研究室のサポートサイエンティストであるKaren FoleyとRobert Jonesが担当します。本プロトコルでは、細心の注意を払った清浄さが不可欠です。

450 °Cに設定したオーブンを使用し、以下のものを4時間焼成します。滅菌済みの核酸フリー金属ラック、ガラス器具、金属製ピンセット、およびガラスウールです。再汚染を防ぐため、厚手のアルミホイルで包んで使用してください。

次に、0.22 micronフィルターを用いて85% ethanolと超純水をろ過滅菌します。これらの液体は4 °C以下に保つ必要があります。そうしないとサンプルに亀裂が生じ、汚染しやすくなるためです。ethanolは-20 °Cで保存してください。

水を4 °Cで保存します。次に、プラスチック製の定規を70% ethanolで滅菌し、続いてDNA除染液およびRNase除染液で処理します。各溶液を塗布した後、すぐに拭き取ってください。

その後、定規を滅菌済みの核酸フリーのWhirl-Pakバッグに保管します。次に、まず室内の壁、床、および金属製ワークベンチを1%漂白剤で洗浄し、コールドルームのスペースを準備します。その後、室温を約-11°Cに設定します。

準備が整ったら、室内の汚染やサンプルのコンタミネーションの可能性を低減するため、コールドルーム内では簡易防護服、ニトリル手袋、およびマスクを着用してください。本手順では2名が連携して作業する必要があります。再汚染の機会が多くあるため、この連携作業は困難を伴う場合があります。

成功を確実にするため、互いに監視し、コミュニケーションを取り、頻繁に手袋を交換します。すべての準備が整ったら、滅菌済みの材料とサンプルをコールドルームに持ち込み、漂白剤で洗浄したテーブルの上に配置します。これには、準備した S.marcescens の培養液が含まれます。

まず、永久凍土コアを準備したアルミホイルの上に置きます。次に、滅菌済みのフォームプラグを使用して、S.marcescensの希釈培養液をコアの外側に軽く接種します。その後、トレイの上の滅菌済みメタルラックにコアを設置します。

次に、鋼製ミクロトーム刃を70% ethanol、DNA除染溶液、およびRNase除染溶液で滅菌ワイプします。続いて、研究者Aが同様の手順でニトリル手袋を洗浄します。その後、Aはトレイの上でコアを45度の角度に保持します。

Aがコアを回転させる間に、Bは滅菌済みブレードを使用して、端の部分を含むコア全体の外側から約5 mmを優しく削り取ります。必要に応じて、ブレードを3種類の溶液で再洗浄してください。次に、Aがコアを回転させている間に、Bはフィルター滅菌した95% ethanolをコアに迅速かつ慎重に注ぎます。

次に、コアを水で素早くすすぎます。トレイ上のメタルラックを交換し、新しいラックにコアを置きます。操作者はニトリル手袋を洗浄した後、トレイ上の清潔なラックにコアを配置します。

その間、Bはコア全体にDNA除染溶液をスプレーし、続いてフィルター滅菌水で洗浄します。次に、Bはコア全体にRNase除染溶液をスプレーし、再度水で洗浄します。最後に、コアを滅菌済みのWhirl-Pakバッグに入れます。

まず、ラミナーフローを備えたバイオフード内で、ガラス皿の上にメタルラックを設置します。次に、コアをメタルラックの上に置きます。約10分間、コアの外表面から2〜5 mmが融解するまで待ちます。

この間、2分ごとにコアを90度ずつ回転させます。融解後、ピンセットでガラスウールを掴み、コアの表面全体を拭って細菌を回収します。その後、そのガラスウールを用いて2枚のプレートに接種します。

次に、定規を用いてコアの外寸法を測定します。その際、コアに触れないようにしてください。また、コアの外側に塗布した際に使用した元の培養液を用いて、さらに2枚のプレートに接種し、接種菌が生存可能であったことを確認します。その後、コアを大きな滅菌袋に移し、-80 °Cで保存します。

接種したプレートを23 °Cで1週間インキュベートし、この温度で赤色に変化するS.marcescensのコロニーを確認します。本プロトコルには一連の重要なステップがありますが、中でも特に重要なステップの一つがSerratia Marcescensの増殖確認です。S.marcescensのコロニーが視認できない場合は、次の融解フェーズに進んでください。

S.marcescensのコロニーが認められる場合は、コアからさらに5 mmを削り取り、手順を繰り返します。また、低温室の低温にさらされた元の培養物からS.marcescensが増殖したかどうかを確認してください。サンプルは、アラスカ州フォックスにある110 mのトンネル内の氷および永久凍土から採取されました。

トンネルにより、氷に富んだシルトおよび沖積層へのアクセスが可能となった。サンプルは3連で採取した。ニューハンプシャー州の施設にて、記載されたプロトコルを実施した。

コアから培養した細菌の16S rRNA遺伝子をシーケンスした。Pseudomonas属が優占していたが、Planctomycetia綱に関連するメンバーも存在していた。また、特に注目すべきはSerratia属が検出されなかったことであり、これにより除染プロトコルが外来DNAを十分に除去したことが示された。

このビデオを視聴することで、氷床および永久凍土コアの除染を成功させる方法について十分に理解できるはずです。習得すれば、適切に実施することで、低温室での処理ステップを30分から45分で完了させることができます。この手順を行う際は、触れるすべての物や場所に細心の注意を払うことが極めて重要です。

判断に迷った場合は、手袋を交換し、再度滅菌を行ってください。本手順に続き、アンプリコンシーケンシングやショットガンメタゲノミクスなどの他の手法を用いることで、その期間の種組成はどうであったか、あるいはどのような環境条件下でどのような機能的特性が支配的であったかといった、さらなる疑問を解消することができます。