分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング

このステンシルベースのマイクロパターニング法の全体的な目標は、ヒト多能性幹細胞を対象として、幹細胞の分化パターンを制御する空間環境勾配を生成するためのシンプルで堅牢な手段を提供することです。この方法は、細胞間および細胞マトリックス接着力の空間勾配が幹細胞分化運命の組織化にどのように役立つかなど、ヒト幹細胞モデルを使用した組織パターニングにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の利点は、細胞が付着するための細胞接着性ECMパターンを生成するために、追加の表面改質を必要としないことです。

これは、この分析法が、各細胞株に特異的なさまざまなECMおよび基質構成に適合していることを意味します。この方法は、マイクロパターニングのステップを学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。それは、ステンシルとセルの正確で慎重な取り扱いが必要だからです。

この手順では、PTMS ステンシルが既に設計および製造されている必要があります。同様に、ヒトEFC細胞を基底膜マトリックス上で増殖させ、手順の後半でコロニーを播種する準備が整います。まず、700マイクロリットルの70%分析グレードのエタノールを超純水に皿に入れます。

次に、PDMSステンシルを溶液の上に置き、皿をバイオセーフティキャビネットにセットして一晩乾燥させます。翌日、ステンシルの下に気泡が発生していないことを確認します。次に、細胞をステンシルに播種できるようになるまで、皿をフィールドに入れます。

16.7ミリリットルのDMF12を添加してヒトESC品質の基底膜マトリックスのアリコートを調製し、1.5倍の溶液を作り、氷上に保持します。基板を100ワットの酸素プラズマで90秒間処理します。プラズマチャンバー内に入るまでディッシュを開けず、治療後すぐにカバーします。

この処理により、基板を溶液に浸漬した際に気泡が発生するのを防ぐことができます。次に、ステンシルを調製した450マイクロリットルの1.5x基底膜マトリックス溶液で覆います。次に、皿をパラフィルムで密封し、5時間インキュベートします。

先に進む前に、調製したHESCコロニーの6つのウェルプレートを確認してください。典型的なHESC形態を失った分化細胞のコロニーを同定し、吸引します。それらはすべて丸みを帯びて見え、上皮の形態が密集しており、核小体が目立つ高い核と細胞質の比率を持っている必要があります。

次に、めっき細胞の各ウェルを2ミリリットルのDMF12で2回洗浄します。2回目の洗浄後、各ウェルにアキュターゼなどの消化酵素1ミリリットルを加え、プレートを摂氏37度で8分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを軽くたたいて、基質からすべてのコロニーを剥がします。

次に、ウェルに塗布する消化酵素1ミリリットルにつき少なくとも4ミリリットルの培地で各ウェルをすすぎ、細胞懸濁液を1本の15ミリリットルの円錐管に集めます。細胞を室温で200gで3分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します。次に、上清を吸引し、10マイクロモルの岩石阻害剤を補充した400マイクロリットルのHESC維持培地に細胞を再懸濁します。

細胞を3回穏やかに回転させて、塊をバラバラにします。次に、サスペンションの密度を修正します。よく混ぜて、200マイクロリットルを1:20に希釈します。

血球計算盤を使用して希釈液中の細胞をカウントします。次に、必要に応じて、岩石阻害剤を含む媒体を使用して、メイン懸濁液を希釈します。続行するには、準備した各ステンシルに必要な数のセルを追加します。

単層の細胞のみを堆積させる必要があるため、それらを均等に広げます。ステンシルを5分間邪魔されずに置いて、セルが落ち着くようにします。次に、ロードされたステンシルをインキュベーターに慎重に移し、移し替え中ずっと皿を水平に保ちます。

細胞をステンシルに1時間かけてインキュベートします。細胞が付着することを許可された後、顕微鏡で細胞を検査して、適切に付着したことを確認します。ステンシルをフードに戻し、ステンシルから付着していないセルを吸引します。

次に、DMF12に含まれる0.5%適合の非イオン性界面活性剤を2ミリリットル、ステンシルの周囲に加えます。ステンシルを覆うように溶液を渦巻きます。次に、オートクレーブ滅菌した鉗子を使用して、ステンシルを皿からそっと剥がします。

ステンシルを取り外した後、顕微鏡でマイクロパテエンド細胞を検査します。非イオン性界面活性剤は、これらの細胞の乾燥を防ぎます。界面活性剤を添加した培地溶液で、マイクロパテレンド細胞を摂氏37度で10分間インキュベー

10分後、溶液を吸引し、2ミリリットルの通常のDMF12培地でプレートを3回洗浄します。洗浄後、岩石阻害剤を含む2ミリリットルのHESC維持培地を追加します。もう一度、細胞を検査して、マイクロパターンが適切に形成されていることを確認してください。

次に、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、培地を吸引し、DMF12で細胞を一度洗浄し、次に2ミリリットルのサプリメント分化培地を追加して、細胞が中内胚葉分化を受けるように誘導します。後で、結果を分析します。

レーザーカッターを使用したセルステンシルの作製により、1000ミクロンの特徴が得られました。ステンシルは、マイクロパターン化されたスルーホールを備えた薄いステンシルシートと、セルを封じ込めるために使用されるPDMSガスケットで構成されていました。このツールを使用して、中内胚葉の分化中にマイクロパターン化されたHESCを調査しました。

H9-HESCコロニー周辺は、コロニー内部の細胞よりもインテグリン接着が高くなります。したがって、細胞は、アクチバン、BMP4、およびFGF2で誘導されると、上腕T陽性中内胚葉細胞に分化します。このような細胞を異なる形状の単層にパターン化すると、幾何学的および等方性の直角および凸湾曲で、インテグリンを介した牽引力が局所的に集中し、中内胚葉の分化が増加しました。

単一のコロニー内の異なる部位でのT発現強度は、正方形および長方形のコロニーの鋭いコーナー、および半円弧の凸曲率で、中胚葉誘導の程度が実際に高いことを示しました。これは、細胞接着媒介的な機械的力が、記載された方法を用いて調節され得ることを実証している。手順を試みる前に、作業している特定のヒト多能性幹細胞株のマトリックスコーティング時間、細胞消化および接着時間を最適化することが重要です。