カチオン性およびアニオン性リポソームを用いてCNSへの治療用のsiRNAの送達
2016年7月23日
このプロトコルの目標は、神経標的ペプチドを持つカチオン性/アニオン性リポソームをCNS送達システムとして使用し、siRNAがBBBを通過することを可能にすることです。 siRNAのような治療のための送達システムの最適化は、プリオンや他の神経変性疾患に対するより多くの治療選択肢を可能にするでしょう。
この手順の全体的な目標は、siRNAのような低分子薬物を脳に送達できる送達システムを設計することです。この方法は、siRNAがタンパク質のミスフォールディング疾患に対する実行可能な治療選択肢であるかどうかなど、神経変性分野の重要な質問に答えることができます。そして、脳への信頼性の高い薬物送達システムを設計できますか?
リポソーム薬物送達システムを作成する主な利点は、siRNAを神経組織を直接通過して神経細胞に損傷を与えるのではなく、静脈内または血流を通じて送達できることです。この技術の意味するところは、血液脳関門を越えて、特にアセチルコリン発現ニューロンに特異的に送達できるため、神経変性疾患の治療と診断にまで及びます。マウス尾静脈の注射は、マウスの尾静脈のサイズが小さいため、習得が難しいため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。
まず、DOTAPとコレステロールの比率を1対1で準備します。異物リポソーム製剤の場合は、2ナノモルのDOTAPと2ナノモルのコレステロールを10ミリリットルの1対1のクロロホルム-メタノール溶液に混合します。.次に、窒素ガスを使用して9ミリリットルのクロロホルムとメタノール溶液を蒸発させます。
最後の1ミリリットルの溶剤をヒュームフードでガスなしで一晩蒸発させます。翌日、フラスコの底に薄い脂質膜が見えるはずです。このフラスコを脂質フィルムと10ミリリットルの10パーセントショ糖溶液の両方で摂氏55度に加熱します。
次に、加熱したショ糖溶液を薄い脂質フィルムにゆっくりとピペットで移し、フラスコを静かに渦巻かせます。次に、製造元の指示に従って、1ミクロンのフィルターを使用して押出機を組み立てます。次に、加熱したリポソーム懸濁液1ミリリットルを押出機のシリンジの1つに加えます。
次に、サスペンションを2つのシリンジの間に11回通過させます。リポソーム懸濁液を加熱してサイジングを容易にする一方で、45ミクロンと2ミクロンのフィルターでリポソームをサイジングします 大きな単層小胞を生成するには、次に、4ナノモルのリポソーム懸濁液の20マイクロリットルを20マイクロリットルのストックsiRNA溶液の200マイクロリットルに加え、室温で10分間インキュベートします。次に、500マイクロモルのRVG-9RターゲティングペプチドのストックをsiRNAリポソーム溶液に80マイクロリットル加え、室温で10分間インキュベートします。
2.2ナノモルのDSPEまたはDOTAPのいずれかを10ミリリットルの2対1のクロロホルムからメタノール溶液に1.6ナノモルのコレステロールと2ナノモルのDSPEペグで混合することにより、異物のリプソモー懸濁液を調製します。その後、窒素ガスを塗布し、ほとんどの溶媒が蒸発したら、フラスコをヒュームフードに一晩置いておきます。次に、摂氏75度に加熱した1X PBSの10ミリリットルを薄い脂質フィルムにゆっくりと加えます。
サイジングする前に、脂質を摂氏75度で少なくとも1時間再水和させます。前と同様に押出機を使用してリポソーム懸濁液をサイジングした後、4つのナノモルリポソーム懸濁液のそれぞれ20マイクロリットルを単回使用アリコートにピペットで移し、ベンチトップ凍結乾燥機を使用して30分間凍結乾燥します。次に、26.6マイクロモルの硫酸プロタミン溶液1.4マイクロリットルを20マイクロリットルの20マイクロモルストックsiRNA溶液に加え、室温で10分間インキュベートしてsiRNAを凝縮させます。
インキュベーション後、DSPEパレットを201.4マイクロリットルのsiRNAプロタミン溶液で再水和します。DOTAPパレットをsiRNAの異物動物ストック溶液200マイクロリットルで再水和します。.各リポソームsiRNA溶液を室温で10分間インキュベートします。
次に、再水和したリポソームの各チューブに10マイクロリットルの60ミリモルEDC溶液を加えます。次に、10マイクロリットルの150ミリモルスルホ-NHS溶液をリポソームsiRNA溶液に添加します。室温で2時間インキュベートします。
最後に、80マイクロリットルの500マイクロモルストックのRVG-9RペプチドをsiRNAリポソーム架橋溶液に加え、室温で10分間インキュベートします。酸素中の2〜3パーセントのイソフルランを使用してマウスに麻酔をかけた後、マウスの眼をアプタルミン酸軟膏で覆い、つま先をつまんで麻酔を確認します。反応がない場合にのみ続行してください。
麻酔を維持しながら、マウスを背中または横に置いて尾静脈にアクセスします。尾部を70%のエタノールで拭き、次に26ゲージのインスリン注射器を使用して、300マイクロリットルのLSPCまたは口蓋を尾静脈に注入します。遠位から注入を開始し、静脈が崩壊または破裂した場合は近位に移動します。
マウスが胸骨の横臥を維持するまで、マウスを清潔なケージに入れます。注射後数時間、動物を観察し、麻酔が切れ、治療による悪影響がないことを確認します。LSPCまたはパレットを少なくとも24時間循環させた後、マウスを安楽死させた後、脳の半球を半分解剖します。
次に、半球と2.5ミリリットルのファックスバッファーを40ミクロンメッシュのセルストレーナーに置き、シリンジのプランジャーを使用して、フィルターを通して組織をペトリ皿に押し込みます。セルストレーナーとシャーレをさらに2.5ミリリットルのファックスバッファーですすいでください。次に、単細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、氷の上に置きます。
次に、細胞懸濁液100マイクロリットルをマイクロ遠心チューブにピペットで注入し、上清を350倍Gで5分間遠心分離する。次に、さらにミリリットルのファックスバッファーを追加し、セル懸濁液を氷の上に置きます。次に、100マイクロリットルのラット抗マウスFcブロックの細胞をファックスバッファーに入れて、氷上で30〜60分間インキュベー
トします。前回と同様にペレット化して洗浄した後、100マイクロリットルの蛍光一次抗体溶液を加え、氷上に30〜60分間置く。最終洗浄後、細胞を1ミリリットルのRVC溶解緩衝液に1分間再懸濁します。次に、細胞をペレット化します。
バッファーを廃棄した後、1ミリリットルのファックスバッファーに再懸濁し、氷の上に置きます。これで、セルを FAX 分析する準備が整いました。LSPCを介して導入したsiRNAで処理したマウスは、PBSコントロールと比較して、細胞のプリオンタンパク質レベルが有意に低下しました。
LSPCを処理したマウスは、プリオンタンパク質ノックアウトマウスに近い細胞プリオンタンパク質レベルを示しました。3つの実験で、LSPCで処理したマウスは、タイプコントロールのPBSと比較して、細胞のプリオンタンパク質レベルが有意に減少しました。この手順を試行する際、リポソームは冷蔵庫で数か月間保存できるが、完全なLSPCは組み立て後24時間以内に使用する必要があることを覚えておくことが重要です。
その開発後、LSPCまたはパレットの生成は、研究者が神経変性疾患の分野でより多くの治療オプションを探求するための道を開くでしょう。
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概要
本プロトコルでは、血液脳関門（BBB）を通過してsiRNAを輸送させるため、神経標的ペプチドを用いたカチオン性/アニオン性リポソームによるデリバリーシステムの開発を目的としています。この進展により、プリオン病やその他の神経変性疾患に対する治療選択肢が拡大することが期待されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- ドラッグデリバリーシステム
- 神経変性疾患
背景
- 神経変性疾患の多くは、タンパク質のミスフォールディングを伴います。
- siRNAは、これらの疾患に対する治療選択肢としての可能性を秘めています。
- 現在のデリバリー手法は、ニューロンに損傷を与える可能性があります。
- 効果的な治療には、特定のニューロンへの標的デリバリーが不可欠です。
研究目的
- 脳へのsiRNA送達のための信頼性の高いドラッグデリバリーシステムを構築すること。
- タンパク質折り畳み異常疾患の治療法としてのsiRNAの生存可能性を探索すること。
- 薬剤送達時の神経細胞への損傷を最小限に抑えること。
使用された手法
- 神経標的ペプチドを用いたカチオン性/アニオン性リポソームの設計。
- 静脈内投与によるsiRNAの投与。
- 教育目的の技術的な視覚的デモンストレーション。
- デリバリー効率を検証するためのマウスモデルの利用。
主要な結果
- リポソームシステムを用いた血液脳関門（BBB）を介するsiRNAの輸送に成功。
- 直接注入法と比較して、神経細胞の損傷が軽減されることが実証された。
- アセチルコリン発現神経細胞への標的輸送の可能性。
- 可視化技術により、輸送プロセスの理解が向上した。
結論
- 開発されたリポソームシステムは、神経変性疾患の治療に有望です。
- デリバリー方法を最適化するために、さらなる研究が必要です。
- この技術は、患者に対する新たな治療選択肢につながる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
血液脳関門を通過する信頼性の高いsiRNAデリバリーシステムの開発は、神経変性疾患治療における重大なボトルネックを解消します。このアプローチにより、細胞性プリオンタンパク質などの疾患関連タンパク質の標的特異的な調節が可能となり、初期探索段階におけるメカニズムのリスク低減が促進されます。リポソームを用いた静脈内投与は、処置の侵襲性と神経損傷を軽減し、中枢神経系（CNS）を標的としたパイプラインのトランスレーショナルな実現可能性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 神経細胞におけるPrPCノックダウン効果の解析を可能にし、治療仮説の検証に寄与する。
- 運用的価値： 静脈内投与による中枢神経系（CNS）組織におけるターゲットエンゲージメントを評価するための再現性のある手法を提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 化合物スクリーニングのために、AChR発現ニューロンにおけるPrPC減少の定量的な読み取り値を生成する。
- 運用的価値： 一貫した血液脳関門透過性アッセイのための、リポソームsiRNA製剤の標準化を支援する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：疾患に関連する神経細胞集団における標的変調を実証し、前臨床的な概念実証を裏付ける。
- 運用的価値：神経変性疾患モデルにおける他のsiRNA標的にも適応可能なデリバリープラットフォームを確立する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、中枢神経系（CNS）疾患モデルにおけるターゲットバリデーションおよびメカニズムスクリーニングを可能にすることで、初期探索から前臨床に至るワークフローに適合します。
- 探索生物学： ニューロン特異的なsiRNAデリバリーを通じて、神経変性におけるPrPCの役割に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 再現性のあるリポソームsiRNA封入と血液脳関門（BBB）透過により、アッセイの準備を容易にします。
- 分析： 分離されたニューロン集団における標的タンパク質のダウンレギュレーションの定量的な測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： ニューロンにおけるsiRNAの有効性を、神経変性標的に対する前臨床段階の推進判断へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用： 様々なsiRNA配列やターゲティングリガンドに適応可能なモジュール式リポソームシステムを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ニューロン特異的なノックダウンにより、治療標的としてのPrPCのメカニズム的なリスク低減を実現する。
- 運用上の価値：標準化されたリポソーム製造および静脈内投与により、研究間での再現性を向上させる。
- 戦略的価値：侵襲的な処置を行うことなく、中枢神経系（CNS）標的へのエンゲージメントに基づいたgo/no-go判断を可能にする。
- ポートフォリオへの影響：CNS標的核酸治療薬のリスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- 脂質ベシクルの調製、エクストルージョン、およびsiRNAの取り扱いに関する専門知識が必要です。
- 使用機器には、ミクロンフィルターを備えたエクストルーダー、凍結乾燥機、およびフローサイトメトリー（FACS）装置が含まれます。
- リポソームの処方、ペプチド結合、およびin vivo投与プロトコルについて、チーム間での標準化が必要です。
- 適応上の検討事項には、脂質組成（カチオン性/アニオン性）、siRNA配列、および異なる神経細胞集団に対する標的リガンドの選択が含まれます。
- 実用上の制限として、構築したLSPCの安定性保持期間が24時間であること、およびマウス尾静脈注射の技術的な困難さが挙げられます。
バイオファーマよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Preparation of Cationic Liposome-siRNA-Peptide Complexes (LSPCs)
3:25
Preparation of Peptide Addressed Liposome Encapsulated Therapeutic siRNA (PALETS)
6:03
Tail-vein Injection of LSPCs or PALETS
7:09
Analysis of Protein Expression by Flow Cytometry
9:14
Results: Representative Flow Cytometric Analysis of Brian Cell Suspensions 24 hr After Treatment with LSPCs
9:56
Conclusion
