Name: ゲノム編集中アステュアナクスmexicanus使用して転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶ TALENsを用いたAstyanax mexicanusの遺伝子変異導入法。洞窟魚の形質進化の遺伝的基盤を解明し、進化生物学研究に貢献します。

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この作品は、遺伝学、開発および細胞生物学、アイオワ州立大学の学科によっておよびNIHのグラントEY024941（WJ）.DRによって賄われていました。ジェフリーEssnerは、原稿にコメントを提供しました。

<ol><li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).</li>
<li>Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+mutation+contributes+to+adaptive+beach+mouse+color+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern.</a> Science. 313 (5783), 101-104 (2006).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+means+of+an+easy+TALEN+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy.</a> J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).</li>
<li>Bannister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs+mediate+efficient+and+heritable+mutation+of+endogenous+genes+in+the+marine+annelid+Platynereis+dumerilii%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii.</a> Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).</li>
<li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+Xenopus+embryos+using+engineered+transcription+activator-like+effector+nucleases+%28TALENs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Ansai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+mutagenesis+in+medaka+using+custom-designed+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases.</a> Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+doublesex-+and+mab-3-related+transcription+factor+6+and+its+involvement+in+spermatogenesis+in+tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia.</a> Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+origin+of+Astyanax+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">The complex origin of Astyanax cavefish.</a> BMC Evol Biol. 12, 105(2012).</li>
<li>Wilkens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+genetics+of+epigean+and+cave+Astyanax+fasciatus+%28Characidae%2C+Pisces%29+-+support+for+the+neutral+mutation+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory.</a> Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).</li>
<li>Teyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differences+in+neuromasts+of+the+blind+cave+fish+Astyanax+hubbsi+and+the+sighted+river+fish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus.</a> Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetische+Untersuchungen+zur+Evolution+des+Geschmacksapparates+bei+cavernicolen+Fischen%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zool+Syst+Evolutionforsch%22%5BJournal%5D)">Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen.</a> Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).</li>
<li>Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggressive+behavior+of+an+epigean+population+of+Astyanax+mexicanus+%28Characidae%2C+Pisces%29+and+some+observations+of+three+subterranean+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Processes%22%5BJournal%5D)">Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations.</a> Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).</li>
<li>Parzefall, J., Fricke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarm+reaction+and+schooling+in+population+hybrids+of+Astyanax+fasciatus+%28Pisces%2C+Characidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoires+e+Biospeologie%22%5BJournal%5D)">Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae).</a> Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+Genetics+of+Feeding+Behavior+in+the+Cave+Fish+Astyanax+mexicanus+F.+anoptichthys%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Tierpsychol%22%5BJournal%5D)">Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys.</a> Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).</li>
<li>Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocortin+4+receptor+mutations+contribute+to+the+adaptation+of+cavefish+to+nutrient-poor+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).</li>
<li>Protas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-trait+evolution+in+a+cave+fish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Dev%22%5BJournal%5D)">Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus.</a> Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).</li>
<li>Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Mc1r+in+the+parallel+evolution+of+depigmentation+in+independent+populations+of+the+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).</li>
<li>Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+adaptive+behavior+and+its+sensory+receptors+promotes+eye+regression+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish.</a> BMC Biol. 10, 108(2012).</li>
<li>Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+of+retinal+degeneration+in+the+blind+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 8 (2), 57281(2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+in+feeding+posture+occurs+through+different+genetic+loci+in+independently+evolved+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Schooling+Behavior+in+Cavefish+through+Sight-Dependent+and+Sight-Independent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms.</a> Curr Biol. , (2013).</li>
<li>Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+craniofacial+changes+in+blind+cave-dwelling+fish+are+mediated+by+genetically+symmetric+and+asymmetric+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci.</a> Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signalling+controls+eye+degeneration+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish.</a> Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).</li>
<li>Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+benefit+of+albinism+in+Astyanax+cavefish%3A+downregulation+of+the+oca2+gene+increases+tyrosine+and+catecholamine+levels+as+an+alternative+to+melanin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis.</a> PLoS One. 8 (11), e80823(2013).</li>
<li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+Cavefish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).</li>
<li>Primer3 v. 0.4.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ ">http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ </a> (2015).</li>
<li>Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3- new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer3%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Enhancements and modifications of primer design program Primer3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).</li>
<li>Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf</a> (2011).</li>
<li>Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: <a target="_blank" href="http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf">http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf</a> (2012).</li>
<li>Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection">https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection</a> (2009).</li>
<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus+surface+fish+and+Pachon+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish.</a> Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FokI+dimerization+is+required+for+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FokI dimerization is required for DNA cleavage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).</li>
<li>Elipot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+enzyme+monoamine+oxidase+explains+part+of+the+Astyanax+cavefish+behavioural+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome.</a> Nat Commun. 5, 3647(2014).</li>
<li>McGaugh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cavefish+genome+reveals+candidate+genes+for+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss.</a> Nat Commun. 5, 5307(2014).</li>
<li>Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+behavioral+shift+mediated+by+superficial+neuromasts+helps+cavefish+find+food+in+darkness%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness.</a> Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).</li>
<li>Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+system--keeping+zebrafish+gene+targeting+fresh%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh.</a> Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).</li>
<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li>
<li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li>
<li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289 (5479), 631-633 (2000).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

長足の進歩は、形質の進化の遺伝的基礎を理解することに向けて、近年で行われています。特徴の数の進化の基礎となる候補遺伝子が同定されたが、それが原因で最も進化興味深い種の遺伝的取り扱いやすさの欠如にインビボでこれらの遺伝子を試験するために困難なままです。ここでは、Aのゲノム編集のための方法を報告しますmexicanus、洞窟動物の進化を研究するために使用される種。遺伝的マッピング研究1,21,23と候補遺伝子19,40は、Aの洞窟の形での形質の進化のための候補遺伝子の数を同定している近づきますmexicanus。洞窟魚ゲノム41の最近の刊行物は、洞窟の形質の進化のための候補遺伝子を同定するための追加の強力なツールを提供します。これらの候補遺伝子の多くの機能をテストすることは、遺伝子発現を減少させるための技術が必要となります。研究のための唯一の現在のオプションA.でる減少した遺伝子発現mexicanusはモルフォリノの使用によるものです。しかし、モルホリ...

形質進化の遺伝的基礎を理解することは、進化の生物学者の重要な研究目標です。かなりの進歩は、形質の発生の根底にある遺伝子座を同定し、（実施例1-3の場合）、これらの遺伝子座内の候補遺伝子を特定してなされました。形質の進化を研究するために使用される多くの生物は現在、遺伝的に扱いやすいではありませんしかし、機能的にこれらの遺伝子の役割をテストすることは困難なままです。ゲノム編集技術の出現が大幅に広範囲の生物の遺伝的操作性を増加しています。転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）とクラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピート（CRISPRs）は、（例えば、4月11日のために）多数の生物の遺伝子の標的に変異を生成するために使用されてきました。進化的に関連したシステムに適用されるこれらのツールは、進化生物学者は進化の遺伝的基礎を勉強方法に革命をもたらす可能性を秘めています。 アステュアナクスのmexicanusは、2つの形態で存在する魚の種である：川に生息する表面形状（表面の魚）と複数の洞窟住居形態（洞窟魚）A. mexicanusの洞窟魚は（12に概説されている）表面の魚の祖先から進化しました。洞窟魚の集団味蕾と頭蓋neuromastsの数を増加させ、色素沈着の減少または損失を目の損失を含む形質の数を進化させてきた、そのような学校教育の行動の損失のような行動の変化は、給紙姿勢と過食症13の変化を侵略を増加しました-19。洞窟魚と表面の魚は異系交配できるであり、遺伝的マッピング実験は、洞窟の形質1,20-26のための遺伝子座および候補遺伝子を同定するために行われてきました。いくつかの候補遺伝子は、他の種21または過剰発現27または過渡ノックダウンUでのモデル生物で、細胞培養1,19で洞窟の特性に貢献する機能的役割のためにテストされていますA.でモルフォリノ28を歌いますmexicanus。しかしながら、これらの方法の各々には限界があります。 A.これらの遺伝子の変異対立遺伝子を生成する能力mexicanusは洞窟魚の進化にそれらの機能を理解するために重要です。したがって、A. mexicanusは、ゲノム編集技術の応用のための理想的な候補生物です。 ここでは、Aのゲノム編集のための方法を概説しますmexicanus TALENsを使用。この方法は、表現型および興味29の遺伝子で安定突然変異を有する魚の行を単離するためのモザイク注入創始魚を評価するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注入ステーション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲル装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注:私たちが知る限り、ゴールデン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲートTALENおよびTALエフェクターキット2.0</td><td>Addgene</td><td>キット#1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (粒状)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents 微生物学 培地: LB Broth, Miller</td><td></td><td>Fisher BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (Fisher を通じて注文)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin 二塩酸塩, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>スーパーアンピシリン (1,000xDNA</td> <td>Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Fisher を通じて注文)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>シャー</td>レ <td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England Biolabs (Fisher を通じて注文)</td><td>50-812-203</td><td>BsaI-HFではなくBsaIを使用してください（ゴールデンゲートTALENおよびTALエフェクターキットのプロトコルに記載されているように）制限</td></tr>酵素<tr><td>10x T4リガーゼ緩衝液Promegaを提供）BSA New England Biolabs 10x T4リガーゼ緩衝液</td><td>Promega（Fisherを通じて注文）</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> GoTaq Green Master mix Promega）(Fisherを通じて注文）PRM7123)他のTaqも使用できますが、それに応じて反応を調整する必要があります<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クイックライゲーションキット</td><td>ニューイングランドバイオラボ (フィッシャーを通じて注文)</td> <td>50-811-728</td><td>私たちはすべてのTALENアセンブリ反応にクイックリガーゼを使用します</td></tr><tr><td>ワンショットTOP10 ケミカルコンピテント大腸菌</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>他の化学的にコンピテントセルまたは自家製のコンピテントセルを使用できます</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (フィッシャーを通じて注文)</td> <td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>プラスミドセーフATP依存性DNase</td><td>エピセンター(フィッシャーを通じて注文)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Qiagenキットは、初期プラスミド調製に使用する必要があります（ゴールデンゲートTALENおよびTALエフェクターキットプロトコルに記載されているように)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (Fisher を通じて注文)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 転写キット</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute クリーンアップキット</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly サンプルローディング色素&nbsp;</td><td>アンビオン(フィッシャーを通じて注文)</td><td>AM8551</td><td></td></tr>エリ<tr><td>ミナーゼ</td><td>デコン(フィッシャーを通じて注文)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランド使い捨てソーダライムガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャー13-678-6B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>標準ガラスキャピ</td>ラリー<td>ワールド精密機器</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロキャップ</td><td>ドラモンドサイエンティフィックカンパニー1-000-0010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ Femtotips マイクロローダー Femtojet マイクロインジェクター</td><td>エッペンドルフ (フィッシャーを通じて注文)</td> <td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>トリス ベース</td><td>フィッシャー</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

ゲノム編集中<em&gt;アステュアナクスmexicanus</em&gt;使用して転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（talens）

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

進化的変化の根底にある遺伝子の対立遺伝子を特定することは、進化がどのように、そしてなぜ起こるのかを理解するために不可欠です。 この目的のために、最近の多くの研究は、さまざまな種における形質の進化のための候補遺伝子を特定することに焦点を当てています。 しかし、最近まで、興味深い候補遺伝子を機能的に検証することは困難でした。 近年開発された遺伝子工学のツールにより、さまざまな生物の特定の遺伝子を操作することが可能になりました。 この技術を進化に関連する生物に応用することで、進化における候補遺伝子の役割について前例のない洞察が可能になります。 Astyanax mexicanus(A.mexicanus)は、表層生物と洞窟生物の両方の形態を持つ魚の一種です。 洞窟に生息する形態の複数の独立した系統は、互いに干渉し、表面の魚と干渉する祖先の表層魚から進化し、洞窟形質の遺伝的基盤の解明を可能にしました。 A. mexicanusは、多くの形質に関与する候補遺伝子を特定するための連鎖解析を含む、多くの進化研究に使用されてきました。 したがって、A. mexicanusは、候補遺伝子の役割をテストするためのゲノム編集の応用に理想的なシステムです。 ここでは、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(TALENs)を用いて、A. mexicanus表面の遺伝子を変異させる方法を報告する。 A. mexicanusのTALENを用いたゲノム編集は、色素沈着遺伝子の突然変異を生成するために利用されています。 この手法は、A. mexicanusの洞窟型で進化した他の多くの形質の候補遺伝子の役割を評価するためにも利用できます。

TALENペア注射は、非相同末端結合（NHEJ）を介して修復することができる二本鎖休憩39で、その結果、特定のDNAヌクレオチドとRVDSの結合、したがってのFokIドメインの二量体化につながります。 NHEJは、多くの場合、挿入または欠失（インデル）につながるエラーを導入しています。インデルはTALEN標的部位を囲む領域を増幅しTALENスペーサ領域内で切断する制限酵素を用いて得られたアンプリコンを消化することによって同定することができます。制限酵素標的配列を変更インデルを含む対立遺伝子を制限酵素耐性バンド（ 図2）を製造、消化し ​​ないだろうしながら、インデルのない対立遺伝子が消化されます。 TALEN注射はおそらくAの二対立遺伝子変異をもたらすことができますmexicanus 29。したがって、いくつかの表現型...

遺伝子標的化突然変異誘発は、ゲノム編集の技術を使用して、生物の幅広いことが可能です。ここで、我々はアステュアナクスmexicanus、表面の魚や洞窟魚が含まれて魚の種におけるエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）などの転写活性化因子を用いて標的遺伝子の突然変異誘発のためのプロトコルを示しています。

ゲノム編集中<em&gt;アステュアナクスmexicanus</em&gt;使用して転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

本手順の全般的な目的は、洞窟魚である Astyanax mexicanus の特定遺伝子に突然変異を導入することです。この手法は、洞窟適応形質の進化における遺伝的基盤に関する、進化生物学分野の重要な疑問を解明するのに役立ちます。本技術の主な利点は、Astyanax mexicanus において、特定の遺伝子を欠損させた際の影響を検証できる点にあります。テキストプロトコルに従って転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を設計・構築した後、2 µLのSac1を用いて、配列確認済みのテンプレート4 µgを37 °Cで2時間消化します。Sac1で消化したプラスミド2 µLを1.5%アガロースゲルで電気泳動し、単一のバンドを確認して消化を検証します。T3 mRNA合成を行うには、標準的なプロトコルに従い、線状化したテンプレート0.5 µgを用いてハーフリアクションをセットアップします。37°Cで2時間インキュベートします。次に、0.4 µLのDNaseを加え、37°Cで15分間インキュベートします。mRNAを精製した後、品質を確認するために、RNase汚染を除去する製品を用いてゲル装置を洗浄してください。次に、1.2%のゲルを調製します。1 µLのmRNA、4 µLのヌクレアーゼフリー水、および5 µLのグリオキサルローディングダイを混合します。サンプルを50 °Cで30分間インキュベートします。その後、チューブを短時間遠心分離し、ゲル電気泳動を行う前に氷上に置きます。mRNAの濃度を確認した後、分注して-80°Cで保存します。詳細はテキストプロトコルを参照してください。テキストプロトコルに従って注入針とプレートを準備した後、繁殖の3〜4日前に魚に過剰給餌を行い、魚を新鮮な水に入れて A.mexicanus の産卵を誘発させます。水温を2度上げ、約76°Fにします。15分ごとに暗所で水面の魚卵を確認し、水面に付着するのを防ぐためにガラス製ボウルに移します。1組の表層魚から数百個の卵を得ることができます。顕微鏡下で単離した卵を分級し、1細胞期のものを新しいシステム水に移行させます。希釈したmRNAを針の後方に充填し、針をマイクロインジェクターに取り付けます。次に、ピンセットを用いて針を折ります。針を校正するために、10回注入し、得られた液滴をマイクロキャピラリーで回収します。1.5 nanoliterの注入につき0.5 mmとなるように、10 × 100の使い捨て1 microliter、32 mmマイクロキャピラリーを満たす必要があります。次に、針を単一細胞に挿入し、mRNAを注入します。注入した胚をガラスボウルで回収し、23から25 °Cでインキュベートします。注入後の数日間は、死滅した胚を定期的に取り除いてください。未注入のコントロール群および注入群のプレートから、死滅および奇形胚の数を記録してください。詳細はテキストプロトコルを参照してください。所属機関のIACUCプロトコルに従って魚を安楽死させた後、DNAを抽出するために、胚を100 µLの50 mM 水酸化ナトリウムに回収し、95 °Cで30分間インキュベートします。その後、4°Cまで冷却します。冷却した胚に、1 M Tris-HCl (pH 8) を全量の10分の1量加えます。次に、例えばoculocutaneous albinism two（眼皮膚白皮症2型）またはOCA2遺伝子などのプライマーを用いてPCRを行います。個々の胚につき、PCR反応には1 µLのDNAで十分です。OCA2遺伝子座のジェノタイピングを行うには、制限酵素DSR1を用いて得られたPCR産物を消化させます。具体的には、完了したPCR反応液12.5 µLに0.5 µLの酵素を直接添加します。65 °Cで2時間インキュベートした後、この反応液および未消化のPCR産物サンプルを1.5%アガロースゲルで電気泳動します。テキストプロトコルに従って追加分析を行ってください。TALENの注入は、非相同末端結合によって修復可能なDNA二本鎖切断を引き起こしますが、これにより挿入または欠失（INDELs）が導入されることもあります。TALENスペーサー領域のINDELsを標的としたPCR末端制限酵素消化を用いることで、制限酵素耐性バンドの有無によりINDELsを同定できます。TALEN注入により、A.mexicanusにおいてバイアレリックな遺伝子変異を誘導できるため、一部の表現型はファウンダー魚で評価することが可能です。例えば、洞窟魚のアルビノの原因と推測される遺伝子であるOCA2について評価を行いました。ここで示すように、OCA2 TALENを注入した魚では、非注入個体には見られないアルビノパッチが確認されました。このゲル画像では、注入された親魚から得られた10匹のF1魚のプールにおいて、A.mexicanusのOCA2エキソン9から増幅された306 bpのPCR産物を解析し、制限酵素部位の消失を検討しています。コントロール胚のアンプリコンは消化されていますが、注入魚由来のF1胚のアンプリコンの一部は制限酵素消化に耐性を示しています。さらに、制限酵素消化耐性を持つバンドにはINDELが含まれていることが示されています。習熟すれば、適切に行うことでこれらの注入は数時間以内に完了させることができます。この手順を行う際は、RNAの分解を防ぐために慎重に取り扱うこと、および1細胞期に注入することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続き、表現型解析を行うことで、表面魚において特定の遺伝子を変異させた際に、それが主要な魚の表現型の基盤となっているかなど、さらなる疑問を明らかにすることができます。本手法は、進化生物学分野の研究者が、洞窟魚 Astyanax mexicanus の進化における候補遺伝子の役割を解明するための道を開くものです。このビデオを視聴することで、Astyanax mexicanus の胚に TALEN mRNA を注入する方法について深く理解できるはずです。

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)におけるジンクフィンガーヌクレアーゼベースのゲノム編集の技術を示しています。hPSCはさまざまな細胞タイプに分化できる可能性があるため、この技術は患者固有の方法でin...

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing:二本鎖ホモロジー依存性修復機構によるヒト多能性幹細胞のゲノム改変技術

このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）などのデザイナーヌクレアーゼは非相同エンド入社（NHEJ）と相同組換え（HR）経路の両方をトリガすることによって、マウスの着床前胚のゲノムを変更するために使用することができます。これらの進歩は、正確な遺伝子改変マウスの迅速な生成を可能にする。...

デザイナーヌクレアーゼを用いてマウスゲノムエンジニアリング

トランスジェニック操作およびゲノムの編集は、機能的遺伝子とシス -regulatory要素の役割をテストするために重要です。ここでは、ゲノム（Tol2の媒介蛍光レポーター導入遺伝子構築物を含む、TALENs、およびCRISPRs）の変更を生成するための詳細なマイクロインジェクションプロトコルが緊急モデルの魚のために提示され、イトヨ。...

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

組立 Cas9 を利用した複雑なリボ核タンパク質 (RNP)...

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos...

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

ここに提示されるプロトコルは、CAS9-gRNA複合体を脊髄中央管に注入し、続いてエレクトロポレーションを行うことによって、軸総便脊髄の時間および空間制限遺伝子ノックアウトを行うプロトコルである。...

CAS9タンパク質-gRNA複合体のエレクトロポレーションによるアクソロトル脊髄神経幹細胞の直接遺伝子ノックアウト

このプロトコルの目的は、組み立てられたリボヌクレオタンパク質複合体とスクリーニングのためのdpy-10コクリスピーマーカーを使用して、C.エレガンスゲノムのシームレスなCRISPR /...

CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

このプロトコルは、zSpRY-ABE8eを使用して正確なゼブラフィッシュ病モデルを構築するために、PAMの制限なしに効率的なアデニン塩基編集を実行する方法について説明します。...

zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集

卵管核酸送達 による 改良ゲノム編集 (I-GONAD) 法の効率は、ドナーの女性から接合子を採取し、偽妊娠中の女性に移植する必要がある従来のマイクロインジェクションに匹敵します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9 誘発変異を染色体 6 上の ROSA26...

ノックアウトマウス生成のための卵管核酸送達に基づくin vivoエレクトロポレーション技術によるゲノム編集の改善

RNAとしてゲノム編集者を送達することは、一次哺乳類の細胞や細胞株のゲノム改変において特に強力な手段です。このプロトコルの目的は、ゲノム編集者をmRNAとして一次哺乳類の細胞および細胞株に届け、その後、Illuminaの標的シーケンスと解析を行って編集結果を定量化することです。...

一次哺乳類細胞におけるエディタRNAのエレクトロポレーションによるゲノム編集

学ぶ TALENsを用いたAstyanax mexicanusの遺伝子変異導入法。洞窟魚の形質進化の遺伝的基盤を解明し、進化生物学研究に貢献します。

ゲノム編集中

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