Name: 表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶ 慢性ウイルス感染マウスから単離した制御性T細胞のin vitro抑制機能評価法。表現型解析と免疫応答制御メカニズムの解明に役立つ技術です。

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この作業は、教育部の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)による基礎科学研究プログラム(2015R1A6A3A01020610からHJPへの資金提供)と、韓国の保健福祉家族省の韓国医療技術研究開発プロジェクトからの助成金(HI15C0493からSJHへの支援を受けました)によって支援されました。

本研究では、マウスは、延世大学の延世大学実験動物研究センターの特定病原体フリーの施設で維持しました。全ての動物実験は、延世大学で延世大学実験動物研究センターの国際動物実験委員会によって承認されたプロトコルを使用して、韓国の食品医薬品局（FDA）のガイドラインに従って行いました。 ソリューションの調製<ol><li> 2％RPMI培地は、RPMIで1％まで2％ペニシリン - ストレプトマイシンをウシ胎児血清（FBS）を希釈することにより調製します</li><li>完全RPMI培地を準備します。 RPMIへのメディアは、FBSの10％、ペニシリン - ストレプトマイシン1％、L-グルタミン1％、及び50μMの2-メルカプトエタノールを追加します。 </li><li>蛍光活性化細胞選別（FACS）バッファーを準備します。 FBSの2％そうするために、補助リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 </li><li> T細胞の分離バッファを準備します。これを行うには、FBSの2％および2mMのethylenediaminetetraaでPBSを補いますクジラの酸。 </li></ol>脾臓リンパ球の2の単離<ol><li>前述したように19ナイーブまたはLCMV CL13-感染マウスから脾臓を取り出して、2％RPMI培地の10ミリリットルを含む60ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿の中に置いて。 注：本研究の実験では、5〜6週齢のC57B1L / 6J雌マウスの尾静脈から静脈注射を介してLCMV CL13の2×10 6プラーク形成単位（PFU）を受けました。感染後（16 Dのパイ）25日16時マウスを生け贄に捧げます。同じ日にあったGE-マッチしたナイーブマウスを分析します。 </li><li> 50ミリリットルチューブにセルストレーナーを配置し、2％RPMI培地2mlでそれをすすいでください。 70μmのセルストレーナーに脾臓を置き、シリンジのプランジャーを使用して挽きます。 2％RPMI培地2mlで細胞ストレーナーを洗浄し、50 mlチューブから取り外します。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで2％RPMI培地と遠心分離機でチューブを埋めます。上清を捨て、再懸濁ACK溶解緩衝液1ml中の細胞ペレット。 5分間室温（RT）でサンプルをインキュベートします。 注：上記に示したACK溶解緩衝液の容量は、1脾臓のためです。プールされた脾臓サンプルに対して相応のボリュームをスケールアップ。 </li><li> 4℃で10分間300×gで2％RPMI培地と遠心分離機でチューブを埋めます。上清を廃棄し、完全RPMI培地中1×10 7細胞/ mlの密度で細胞を再懸濁します。 注：トリパンブルーで生細胞計数、染色細胞の場合と血球計数器を用いて染色していないだけで生きた細胞を数えます。 </li></ol>脾臓従来のT（TのCONV）細胞およびT reg細胞の3表現型注：T reg細胞の単離の前に、様々な抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーによってそれらを分析することによって、ナイーブまたは感染マウスから単離した脾臓リンパ球の表現型を調べます。 <ol><li> 50μlの細胞を移します新しいU底96ウェルプレートの各ウェルへの全脾臓リンパ球のうち、（5×10 5個の細胞）とは、ウェル当たりのFACS緩衝液150μlを添加します。 4°Cで2分間300×gで遠心分離します。 </li><li>上清を捨てます。細胞ペレットを攪拌し、ウェルあたりFACS緩衝液200μlを追加します。 4°C（2回）で2分間300×gで遠心分離します。 </li><li>以下の抗体および試薬でウェルあたりFACS緩衝液50μlに染色細胞表面マーカーに対する抗体のカクテルを準備します。抗CD4バイオレット染料、抗CD25緑色色素、抗PD-1紫色色素、抗CD8 PerCPを-のCy5.5色素及び細胞生存能力検出試薬、近赤外（IR）、蛍光反応性染料。 注：さらに、活性化T reg細胞の表現型を分析するために、抗CD103 23,25は、細胞表面マーカーの染色のために添加することができます。 </li><li>ウェル当たり抗体カクテル50μlの細胞ペレットを再懸濁します。 4℃の暗所で20分間インキュベートします。で細胞を2回洗浄4°Cで2分間300×gで遠心分離することによってFACSバッファー。 </li><li>最後の洗浄工程の後、上清をデカントし、製造業者のプロトコルに従って調製した固定用緩衝液100μlを用いて4℃で暗所で20分間、細胞を固定。 </li><li> 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって（製造業者のプロトコルに従って調製した）透過性の洗浄緩衝液で細胞を2回洗浄します。 </li><li>細胞内のFoxp3染色用抗体溶液を準備し、そして抗Foxp3の抗体溶液50μlで細胞ペレットを再懸濁します。 注：さらに、TのCONVとT reg細胞の表現型を分析するために、抗CTLAは、この段階で添加することができます。 </li><li> 4℃の暗所で20分間インキュベートし、ステップ3.6を繰り返します。最後の洗浄工程の後、FACS緩衝液200μl中に細胞ペレットを再懸濁し、25フローサイトメーターによる細胞の表現型を調べます。 </li><li>ゲート生細胞populaる。 CD4 +またはCD8 + T細胞のう ​​ち、PD-1 +細胞- LCMV CL13感染中のT CONV細胞の表現型を分析するために、Foxp3の頻度を調べます。 注：実験の結果に基づいて、のFoxp3の割合は- PD-1 + CD4 +およびLCMV CL13 16次元πにおけるCD8 + T細胞集団の両方で50％以上です。 <ol><li> T reg細胞の頻度と表現型を分析するために、CD4 + T細胞の中でのFoxp3 +またはのFoxp3 + PD-1 +細胞の頻度を調べます。 注：実験の結果に基づいて、のFoxp3 +またはのFoxp3 + PD-1 +細胞の割合は、それぞれ、CD4 + T細胞集団における20％以上です。 </li></ol></li></ol> CD4 + CD25 + T reg細胞の単離4 注：すべての試薬の体積は、以下に示すためのものです1×10 7総脾臓細胞の細胞数を開始します。 <ol><li>ナイーブおよびLCMV慢性的に感染したマウスを用いて、セクション2に記載されているように細胞を準備します。 T細胞単離緩衝液10mlを加えることによって細胞を洗浄します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を捨て、バッファの40μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>磁気細胞分離システムを使用して、CD4 + T細胞濃縮のために、ビオチン-抗体カクテルを10μl加え、よく混ぜます。 4℃で10分間インキュベートします。 </li><li>緩衝液30μl、非CD4 + T細胞の標識化のための抗ビオチンマイクロビーズを20μlおよびCD25 +細胞の蛍光標識のためのCD25-PE抗体の10μlのを追加します。よく混ぜ、暗所で15分間インキュベートします。 </li><li>バッファの2ミリリットルを追加し、細胞破片を除去し、新しい50ミリリットルチューブに40μmのセルストレーナーを介して細胞を渡します。 4℃で10分間、300×gでの遠心分離によって細胞を洗浄します。完全に上清を捨て、最大で1.25×10 8細胞の密度で500μlの緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>カラム上に細胞を適用し、カラムを通過する非標識細胞を収集します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離緩衝液を2mlを加えることにより、カラムを洗浄します。完全に上清を捨て、バッファー90μlの中で孤立したCD4 + T細胞を再懸濁します。 </li><li> CD25 +細胞の磁気標識のために、抗PEマイクロビーズの10μlを添加、よく混ぜ、4℃の暗所で15分間インキュベートします。 </li><li>緩衝液2 mlを加え、4℃で10分間、300×gでの遠心分離によって細胞を洗浄します。完全に上清を捨て、最大で1×10 8個の細胞の密度で緩衝液500μl中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> CD4 + CD25 + T reg細胞を豊かにするために、正の選択のためのカラム上に細胞を適用し、コラムを洗います緩衝液を2mlを添加することにより、N。洗浄を3回繰り返します。 </li><li>列が最後の洗浄工程の後に空になると、カラムに緩衝液1mlを追加し、磁気標識CD4 + CD25 +プランジャーを用いて細胞洗い流します。 </li><li>反復は、単離されたCD4 + CD25 + T reg細胞の純度を高めるために、4.8から4.9までステップ。 4℃で10分間、300×gで遠心分離することによってFACS緩衝液で細胞を洗浄します。上清を廃棄し、完全RPMI培地中2×10 6細胞/ mlの濃度で単離されたCD4 + CD25 + T reg細胞を再懸濁します。 </li><li>孤立CD4 + CD25 + T reg細胞の純度を確認するには、合計孤立CD4 + CD25 + T reg細胞からの2×10 5個の細胞を使用しています。抗CD4 FITC試薬近赤外線蛍光反応性染料を検出する細胞の生存を含有するFACS緩衝液50μlで細胞を染色します。 注：CD25はすでに単離の間にPEで標識しました。 </li><li> 4℃の暗所で20分間インキュベートします。 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによってFACS緩衝液で細胞を洗浄。洗浄後、FACS緩衝液100μlに細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって純度を確認してください。 </li><li>ゲート生細胞集団。 T reg細胞の純度を分析するために、CD4 + CD25 +細胞の割合を確認します。 注：実験の結果に基づいて、精製された細胞間のCD4 + CD25 +細胞の割合は、約80％以上です。 </li></ol> CD8 + T細胞およびCD8 + T細胞の標識の5単離注：以下に示す全ての試薬 ​​の体積は、1×10 7総脾臓細胞の出発細胞数のためのものです。 <ol><li>ナイーブマウスを使用して、セクション2に記載されているように細胞を準備します。 T細胞単離バフを10mlを添加することによって細胞を洗浄えー。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を捨て、バッファの40μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>磁気細胞分離システムを用いてCD8 + T細胞の単離のために、非CD8 + T細胞の標識のためのビオチン抗体カクテルを10μl添加し、よく混合します。 4℃で5分間インキュベートします。 </li><li>緩衝液30μlと抗ビオチンマイクロビーズの20μlを添加します。よく混合し、4℃で10分間インキュベートします。 </li><li>カラム上に細胞を適用し、カラムを通過する非標識細胞を収集します。バッファの3回を2ミリリットルを追加することにより、カラムを洗浄。 </li><li> 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を捨て、2mlの緩衝液で単離したCD8 + T細胞を再懸濁します。 </li><li>単離された細胞の純度を確認するには、FACS緩衝液中の抗体溶液50μlを準備します。単離したCD8 + Tセルのうち、2×10 5個の細胞を再懸濁し抗体溶液の50μl中のls。 注：抗CD8 FITC追加し、抗体溶液を調製し、細胞生存率の検出試薬（近IR蛍光反応性染料）FACS緩衝液にします。 </li><li> 4℃の暗所で20分間インキュベートします。 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによってFACS緩衝液で細胞を洗浄。洗浄後、FACS緩衝液100μl中で細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって細胞の純度を確認してください。 </li><li>ゲート生細胞集団。 CD8 + T細胞の純度を確認するために、CD8 + T細胞の割合を確認します。 注：実験の結果に基づいて、精製された細胞のう ​​ちCD8 +細胞のパーセンテージは、約90％以上です。 </li><li>単離したCD8 + T細胞にPBSを追加します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。上清を捨てます。 PBS中の1×10 7細胞/ mlの濃度で単離されたCD8 + T細胞を再懸濁します。 </li><li> CD8 + TのCEを標識するためにインビトロ抑制アッセイのためのLLSは、室温で5μMの濃度を得るために、PBSで細胞増殖追跡バイオレット染料を希釈します。 注：この研究において使用される細胞増殖追跡バイオレット染料のおおよその励起および発光ピークは、それぞれ、405および450nmです。 </li><li> 15mlチューブに細胞増殖追跡バイオレット染料（5μM）と細胞懸濁液（CD8 + T細胞1×10 7細胞/ ml）をウェル等量混合し、37℃で20分間インキュベートします。チューブを10分ごとにボルテックス。 </li><li>冷たい完全RPMI培地でチューブを埋めるし、RTで10分間チューブを残します。 RTで10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を廃棄し、予め温めた完全RPMI培地で2×10 6細胞/ mlの濃度で細胞を再懸濁します。 RTで15分間細胞をインキュベートします。 </li></ol> 6. CD4 + CD25 + Tを用いたin vitroの抑制アッセイを設定します&lt;サブ&gt; REGおよびCD8 + T細胞<ol><li>抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズを製造するために、チューブの15ミリリットル（2.5マイクロリットル/ 1×10 5細胞）に磁気ビーズの適切な量を転送します。等量のPBSを加え、混合します。 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって洗浄し、上清を捨てます。 （50μL/ウェル）完全培地中の磁気ビーズを希釈します。 </li><li> CD4 + CD25 + T reg細胞のアリコート50μlを、U底96ウェルプレートのウェルあたり（1×10 5細胞/ウェル）。レスポンダーT（TのRESP）などのCD8 + T細胞細胞ウェルあたり（1×10 5細胞/ウェル）を50μLを加えます。ウェルあたりに希釈した抗CD3 / CD28被覆ビーズの50μlを添加。 注：このステップは、ラベルには、次のようにコントロールウェルを設定する：「未刺激のCD8 + T細胞のみ「ノー抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズで。 「CD8 + T細胞のみ「抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズで。 「CD8 + T細胞のみ「抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズで、「。」のみT reg細胞、抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズでT reg細胞は、Tの異なる比でのT RESP細胞を完全培地と共培養することによって希釈することができますRESP細胞 ：T reg細胞（1：0.25〜1：1）。 </li><li>総量200μlに、すべてのウェルに50μlのか、メディアの適切な量を追加します。ホイルでプレートをカバーし、72時間、37℃のCO 2インキュベーターでインキュベートします。 </li></ol> CD8 + T細胞増殖およびサイトカイン産生の7分析CD8 + T細胞から<ol><li>サイトカイン産生の分析のために、培養の3日後、ウェル別のプレートに各上清を分離し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を行います。 注：上清は-70℃でアリコートに分けて保存することができます。この実験では、抗マウスIFN-γ抗体でコーティングされたプレートは、IFN-γ産生協定を検出しました製造業者のプロトコールにる。単一細胞レベルでのCD8 + T細胞増殖のIFN-γ産生を決定するために、細胞内サイトカイン染色を行うことができます。 </li><li>各ウェルから上清を分離した後、4°C（3回）で2分間、300×gでFACS緩衝液および遠心分離で細胞を含むプレートを洗浄します。 </li><li>洗浄した後、上清を捨てます。増殖したCD8 + T細胞の染色のための抗体カクテルの50μlの細胞ペレットを再懸濁します。 4℃の暗所で20分間インキュベートします。 注：FACS緩衝液中に、抗CD4 FITC、抗CD8 PerCPを-のCy5.5、及び細胞生存能力検出試薬（近IR蛍光反応性染料）を追加し、抗体カクテルを調製しました。 注：そのようなCD44又はCD69のような種々のマーカーに対する抗体は、CD8 + T細胞の活性化を確認するために、他の抗体と組み合わせることができます。 CD8 + T細胞は、すでに細胞増殖トラッキングVで標識されていることを思い出してくださいステップ5.10でiolet染料。 </li><li> 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって二回洗浄します。最後の洗浄工程の後、上清を捨て、そして固定緩衝液100μlで4℃で暗所で20分間、細胞を固定。 </li><li> 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって二回洗浄します。 FACSバッファー200μlで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーによる細胞増殖追跡バイオレット色素で標識されたCD8 + T細胞の増殖を測定します。 <ol><li>ゲート生細胞のう ​​ちCD8 + T細胞集団。以下の式に従って細胞増殖追跡バイオレット染料及びCD8 + T細胞の希釈の希釈に応じて分割し、分割されていない細胞の割合を測定します。阻害％= [（T reg細胞の非存在下で増殖したCD8 + T細胞の％ - T reg細胞の存在下で増殖したCD8 + T細胞の％）/（％で増殖したCD8 + T細胞のT reg細胞の非存在下）]をX 100はまた、ソフトウェア25フローサイトメトリーを使用してデータを分析します。 </li></ol></li></ol>

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<li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5%2B+natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li>
</ol>

S.-J.H. は特許を取得しており、PD-1 経路に関連する特許ロイヤリティを受け取ります。他の著者には金銭的な利益相反はありません。

T reg細胞の少数が、マウスおよびヒトに存在するが、免疫応答を調節し、免疫寛容の維持において重要な役割を果たしているように、それらの機能を理解することが重要です。 T reg細胞の数と抑制機能は、慢性ウイルス感染15-20だけでなく、癌の進行13,14の間に増加します。これはおそらく、継続的な抗原刺激によるものです。抗原の永続性と病気の開発中のT reg細胞の機能を評価するために、それらの抑制活性を測定する必要があります。 ここでは、T reg細胞のex vivoでの表現型を分析し、CD8 + T細胞およびT reg細胞のin vitroでの共培養系を用いて、それらの抑制活性を測定するためのプロトコルを説明します。現在のプロトコルでの重要なステップは、T reg細胞の分析および分離されています。ライブと新たに単離したT <sub&gt; reg細胞...

調節性T（TのREG）細胞は、それらの発生と機能1用の転写因子としてフォークヘッドボックスP3（Foxp3の）を発現します。加えて、T reg細胞は、CD25 2、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3）3、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体4、および細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）5などの様々な他の分子を発現しますそれらの表面または細胞内領域に。このような強化された抑制機能を表示するウイルス6,7、細菌8,9、および寄生虫10-12、または癌発生13,14の過程で、T reg細胞が活性化された細胞に分化になる、などの病原体の様々な種類の慢性感染の間エフェクターCD4 +及びCD8 + T細胞を標的とします。論文の数は拡大し、活性化したT reg細胞が損なわCD8 + T細胞RESPONSに寄与することが示唆されています友人レトロウイルス（FV）感染15-17の間に電子。 FV誘発性T reg細胞は、IFN-γまたはグランザイムBの発現およびCD8 + T細胞の細胞傷害反応性15-17を阻害します 。また、単純ヘルペスウイルス感染モデルでは、ウイルス特異的CD8 + T細胞および免疫病原性CD4 + T細胞の18-20の浸潤によって深刻な組織損傷の拡大が生じたCD4 + CD25 + T reg細胞の枯渇が報告されました。 リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV CL13）のクローン13株を用いて慢性的に感染したマウス21〜24は、広く、慢性ウイルス感染の間にエフェクターT細胞（T effの）およびT reg細胞の表現型および機能を特徴づけるために使用されています。永続LCMV感染の間に、ウイルス特異的T effの細胞が次第に彼らのエフェクター機能を失い、疲れT（TのEXH）細胞になります。一方、Treg細胞は、ウイルス特異的T細胞応答25を抑制する能力を強化します。 T effは細胞の機能容量の低下は、T effは細胞上の阻害性受容体のアップレギュレーションは、抗原提示細胞の変化した機能、免疫調節性サイトカインの産生、および頻度の増加、またはT REGの強化機能など、いくつかの要因によって説明することができます細胞26。 T細胞の抑制に関与する因子の中でも、プログラムされた細胞死は、タンパク質1（PD-1）発現のT EXH細胞およびT reg細胞が広く、抗原の持続性および抑制性環境の特徴として考えられてきました。最近では、T reg細胞のPD-1経路及びアブレーションの遮断が強化されたT細胞の機能をもたらし、LCMV慢性感染27の間のウイルス負荷を減少させたことが報告されました。また、T reg細胞は、LCMV 23,25によるマウスの慢性感染の間に活性化されています</sアップ&gt;とその抑制機能は25強化されます。 PD-1は、高T reg細胞ならびにT EXH細胞上に発現し、T reg細胞によって発現されるPD-1のレベルは、T細胞増殖25を阻害するそれらの抑制機能の強さと相関します。 ここでは、LCMV CL13とナイーブマウスから単離された休止T reg細胞に感染したマウスから単離した活性化T reg細胞の特性を比較する方法を記載しています。さらに、我々は活性化T reg細胞を分離し、それらのex vivoでの表現型を調べるだけでなく、in vitroでのそれらの抑制活性を測定するための一連の処理を説明します。

<table><tbody><tr><td>FITC ラット抗マウス CD4</td><td>RM4-5</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td></tr><tr><td>U底組織培養プレート</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>353077</td></tr><tr><td>固定バッファー</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td></tr><tr><td>FITC ラット抗マウス CD25</td><td>7D4</td><td>BD Biosciences</td><td>553072</td></tr><tr><td>セルストレーナー、70 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td></tr><tr><td>セルストレーナー、40 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td></tr><tr><td>ブリリアントバイオレット 421 アンチマウスCD279 (PD-1)</td><td>29F.1A12</td><td>バイオレジェンド</td><td>135217</td></tr><tr><td>ブリリアントバイオレット 605 アンチマウスCD4</td><td>RM4-5</td><td>バイオレジェンド</td><td>100547</td></tr><tr><td>APC アンチマウス/ラット Foxp3&nbsp;</td><td>FJK-16s</td><td>eBioscience</td><td>17-5773</td></tr><tr><td>Foxp3/転写因子染色バッファーセット</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-5223</td></tr><tr><td>PerCP-Cyanine5.5 抗マウス CD8a</td><td>53-6.7</td><td>eBiosicence</td><td>45-0081</td></tr><tr><td>マウス IFN-γ Platinum ELISA</td><td></td><td>eBiosicence</td><td>BMS606</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30256</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td></td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td></tr><tr><td>L-グルタミン、200 mM 溶液</td><td></td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25030</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン、10,000 U/ml</td><td></td><td>Gibco&nbsp;</td><td>〒10378-016</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 固定可能な近赤外死細胞染色キット</td><td></td><td>Life technologies</td><td>L-34975</td></tr><tr><td>CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-104-075</td></tr><tr><td>CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-091-041</td></tr><tr><td>MACS Separation Columns, LD columns</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-901</td></tr><tr><td>MACS 分離カラム、LS カラム</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-401</td></tr><tr><td>EDTA、0.5 M (pH 8.0)</td><td></td><td>Promega</td><td>V4231</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td></td><td>Sigma Life Science</td><td>M7522</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30919.03</td></tr><tr><td>CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td><td></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C34557</td></tr><tr><td>BD Canto II フローサイトメーター</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td></td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Hematocytomer</td><td></td><td>Marienfeld superior</td><td></td></tr></tbody></table>

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性t細胞の機能解析

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

転写因子としてのFoxp3を発現する調節性T（T REG）細胞、CD4 + T細胞のサブセットです。 T reg細胞は、免疫応答を調節することによって免疫寛容と恒常性の維持に重要な役割を果たしています。 T reg細胞の主な役割は、エフェクターT（T effの）細胞の増殖ならびにIFN-γ、TNF-α、およびIL-2などのサイトカインの産生を抑制することです。 T effは 、細胞の機能を阻害するT reg細胞の能力は、永続的な病原体感染および癌の発生の間に増強されることが実証されています。休止または炎症条件下でT reg細胞の機能を明確にするために、マウスまたはヒトT reg細胞を使用して、種々のインビトロ抑制アッセイが考案されています。本研究の主な目的は、休止および活性化T regの間の表現型および抑制機能の違いを比較するための方法を開発することです細胞。活性化T reg細胞を単離するために、マウスを、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）クローン13（CL13）、LCMVの慢性株に感染させました。 LCMV CL13感染マウスの脾臓から単離されたT reg細胞は、ナイーブマウスから単離されたT reg細胞を休止期と比較して活性化された表現型および強化された抑制活性の両方を示しました。ここでは、T reg細胞を休止期から活性化したT reg細胞を区別するためのex vivoでの表現型分析のための基本的なプロトコルを記述します。さらに、我々は、完全に活性化したT reg細胞の抑制活性の測定のためのプロトコルを説明します。

私たちは、静脈内にLCMV CL13の2×10 6 PFUでそれらを注入することにより、持続的なウイルス感染マウスを作製しました。 T reg細胞および慢性ウイルス感染の間にT CONV細胞における表現型の変化を調べるために、ナイーブ、感染マウスから得られた脾臓リンパ球を、種々の抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析しました。 CD4 + Tのコンバージョン （ 図1A、上段パネル）とのFoxp3 - - CD8 + Tのコンバージョン （ 図1B、上パネル）セル16 DのPIでは、PD-1は、Foxp3の両方でアップレギュレートされました。 Foxp3 + CD4 + T reg細胞の頻度は、未処理マウス（ 図1A）</s...

ここでは、ナイーブおよび慢性リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス感染マウスから分離された制御性T（Treg）細胞の表現型を分析するためのプロトコルについて説明します。さらに、Treg細胞の抑制活性を評価するプロセスを提供します。

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

本手順の全体的な目的は、慢性ウイルス感染マウスから単離した制御性T細胞のin vitroにおける抑制機能を評価することです。この手法は、慢性ウイルス感染時における活性化制御性T細胞の表現型およびin vitro抑制機能に関する疑問を解決するのに役立ちます。また、本技術を用いることで、in vitroでT細胞に対して陽性反応を示す個体に対する制御性T細胞の直接的な影響を評価することが可能です。これは本手法の大きな利点です。まず、5×10⁵個の脾臓総リンパ球を50 µLのfacs bufferに懸濁し、新しいU底96ウェルプレートの各ウェルに分注し、続いて150 µLのfacs bufferを加えます。プレートを遠心分離し、上清を除去します。次に、細胞ペレットを撹拌し、1ウェルあたり200 µLのfacs bufferで細胞をさらに2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットを1ウェルあたり50 µLの抗体カクテルに再懸濁し、4 °Cの暗所で20分間静置します。その後、細胞をfacs bufferで2回洗浄し、上清をデカンテーションで除きます。次に、100 µLの固定緩衝液を用い、4 °Cの暗所にて20分間細胞を固定し、続いて透過化洗浄緩衝液で2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞を50 µLのanti-FOXP3抗体で再懸濁します。anti-CD3 CD28コートビーズを調製するには、適切な量の磁気ビーズを15 mLチューブに移し、同量のPPSを加えます。ピペッティングにより溶液を穏やかに混合し、磁気ビーズを遠心分離します。洗浄の最後に上清を捨て、1ウェルあたり50 µLの完全培地でビーズを希釈します。次に、96ウェルU底プレートに、1ウェルあたり1×10⁵個のCD4陽性CD25陽性調節性T細胞を50 µL分播種し、続いて1ウェルあたり1×10⁵個のCD8陽性レスポンダーT細胞を50 µL分播種します。すべての細胞の播種が完了したら、希釈したanti CD3 CD28コートビーズを各ウェルに50 µLずつ加え、さらに培地を最大50 µL加えて、各ウェルの総量を200 µLにします。その後、プレートをアルミホイルで覆い、二酸化炭素インキュベーターにて37 °Cで72時間培養します。CD8陽性T細胞のサイトカイン産生を解析するため、3日間の培養後、上清を別の96ウェルプレートに移し、製造元の指示に従ってELISAで解析します。CD8陽性T細胞の増殖を解析するために、細胞が入ったプレートをfacs bufferで3回洗浄します。次に、ペレットを増殖したCD8陽性T細胞に対する適切な抗体カクテル50 microlitersに再懸濁し、4 degrees Celsiusの暗所で20分間静置します。インキュベーション終了後、細胞をfacs bufferで2回洗浄し、固定化バッファー100 microlitersを用いて4 degrees Celsiusの暗所で20分間固定します。最後に、細胞をfacs bufferでさらに2回洗浄し、ペレットを200 microlitersのfacs bufferで再懸濁します。その後、フローサイトメトリーを用いて、phylateで二重標識したCD8陽性T細胞の増殖率を測定します。ナイーブマウスおよび感染マウスから得られた脾臓リンパ球において、LCMV clone 13感染マウスの通常のFOXP3陰性CD4陽性細胞およびFOXP3陰性CD8陽性細胞の両方で、PD-1が特異的にアップレギュレートされています。LCMV clone 13感染マウスにおけるFOXP3陽性CD4陽性制御性T細胞の頻度は、未感染マウスよりも2倍高く、FOXP3陽性CD4陽性細胞の大部分は活性化PD-1高発現表現型も示します。CD8陽性レスポンダーT細胞は、他の免疫細胞による顕著な混入なく、正常に分離することが可能です。制御性T細胞の単離後、80%以上の純度でCD25陽性CD4陽性T細胞の主要な集団を得ることができます。anti CD3 CD28コーティングビーズによる単離した調節性T細胞およびレスポンダーT細胞の刺激は、CD8陽性レスポンダーT細胞の抑制を用量依存的に引き起こします。実際に、CD8陽性レスポンダーT細胞を慢性期の調節性T細胞と1:1の比率で共培養すると、CD8陽性レスポンダーT細胞の増殖は有意に抑制されます。また、ナイーブマウス由来の休止状態の調節性T細胞との共培養と比較して、慢性感染マウス由来の活性化調節性T細胞と共培養した場合、CD8陽性レスポンダー細胞によるインターフェロンγの産生も有意に抑制されます。この手法は、適切に実施すれば80時間で完了できることがわかりました。本手順を行う際は、分離直後の新鮮な制御性T細胞をすぐに使用することが重要です。この開発により、医学分野の研究者が慢性炎症性疾患における制御性T細胞の機能を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、制御性T細胞とレスポンダーT細胞の共培養システムを用いた、in vitro制御性T細胞抑制アッセイのセットアップ方法について十分に理解できるはずです。

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

の世代のための迅速、簡単かつコスト効率の良いプロトコルドナー由来のCMV、前売またはEBV感染症を発症する危険性がある同種造血幹細胞移植（HSCT）の受信者に注入するためmultivirus特異的CTL（rctlを）。この製造プロセスはGMPに準拠しており、専門センターを超えてT細胞免疫療法の広範な実施を確保すべきである。...

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

ナイーブCD4コクサッキーアデノウイルス受容体のトランスジェニック発現とT細胞へのアデノウイルス遺伝子導入は、制御性T細胞分化の分子解析を可能に...

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

我々は、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌の調節における免疫調節経路の役割を調査するためのインビトロアッセイを開発した。...

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

マクロファージは、防御免疫およびホメオスタシスにおいて決定的な役割を果たす造血系のプラスチック細胞である。この報告では、寛容原性条件下で移植臓器に蓄積する移植片浸潤調節マクロファージの表現型および機能的特徴付けのための最適化されたインビトロ技術を記載する。...

グラフト反応性免疫を阻害する調節性マクロファージの機能的特徴付け

リンパ球は、適応免疫応答の主要なプレーヤーです。ここでは、in vitroおよびin...

単離とマウスリンパ球の活性化

多くの実験系は、免疫応答におけるT細胞の発達および機能を調節するメカニズムを理解するために利用されています。ここではレトロウイルス形質導入を用いた遺伝子アプローチは、調節経路を同定することに、経済的、時間効率的な、そして最も重要なのは、非常に有益である、記載されています。...

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

本論文では、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおけるTfhおよびGC...

マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価

この論文では、脳、脊髄、髄膜など、中枢神経系内の常在免疫細胞および末梢由来の免疫細胞を調べるための2つの最適化されたプロトコルを紹介します。これらの各プロトコルは、定常状態および炎症状態下でこれらのコンパートメントを占める細胞の機能と組成を確認するのに役立ちます。...

免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

現在の研究では、ウイルス特異的TFH...

急性LCMV感染マウスにおけるウイルス特異的濾胞性ヘルパーCD4+ T細胞の早期分化へのアクセス

この研究は、皮外(EC)免疫を通じてマウスの免疫応答を調節する皮膚の役割を示しています。タンパク質抗原によるEC免疫は、接触過敏症の免疫応答を抑制したり、病原体に関連する分子パターンと組み合わせることで皮膚誘発性の抑制を逆転させることができます。EC免疫は、針を使わない効果的な免疫療法として有望視されています。...

上皮誘導免疫調節のマウスモデル

このプロトコルは、調節T細胞がエフェクターT細胞の増殖および分化に与える影響を調査するための in vitro...

in vitro 調節T細胞の機能分析:増殖と分化に焦点を当てる

学ぶ 慢性ウイルス感染マウスから単離した制御性T細胞のin vitro抑制機能評価法。表現型解析と免疫応答制御メカニズムの解明に役立つ技術です。

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

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