表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

この手順の全体的な目標は、慢性ウイルス感染マウスから単離された制御性T細胞のin vitro抑制機能を評価することです。この方法は、慢性ウイルス感染時の活性化制御性T細胞の表現型とin vitro抑制機能に関する疑問に答えるのに役立ちます。この手法は、in vitroでT細胞に対して肯定的な反応を示す個人に対する制御性T細胞の直接的な影響を評価できます。

これは、この手法の大きな利点です。まず、50マイクロリットルのfacsバッファー中の5倍10から5番目の総脾臓リンパ球を新しいUボトム96ウェルプレートの各ウェルに移し、続いて150マイクロリットルのfacsバッファーに移します。プレートを遠心分離し、上清を捨てます。

次に、細胞ペレットを撹拌し、ウェルあたり200マイクロリットルのfacsバッファーで細胞をさらに2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットをウェルあたり50マイクロリットルの抗体カクテルに再懸濁し、暗所で摂氏4度で20分間。次に、細胞をfacsバッファーで2回洗浄し、上清をデカントします。

次に、100マイクロリットルの固定緩衝液を用いて、4°Cの暗所で細胞を20分間固定し、続いて透過化洗浄緩衝液を用いて2回の洗浄を行う。2回目の洗浄後、細胞を50マイクロリットルの抗FOXP3抗体に再懸濁します。抗CD3 CD28コーティングビーズを調製するには、適切な量の磁気ビーズを15ミリリットルのチューブに移し、等量のPPSを追加します。

ピペッティングで溶液を穏やかに混合し、磁気ビーズを遠心分離します。洗浄が終わったら、上清を捨て、ビーズをウェルあたり50マイクロリットルの完全な培地で希釈します。次に、96ウェルU底板に1ウェルあたり1回10〜5番目のCD4陽性CD25陽性制御T細胞を50マイクロリットル播種し、続いて1ウェルあたり1回10〜5番目のCD8陽性応答T細胞を50マイクロリットル播種する。

すべての細胞がプレーティングされたら、希釈した抗CD3 CD28コーティングビーズを各ウェルに50マイクロリットル加え、最大50マイクロリットルの培地を加えて、各ウェルの総容量を最大200マイクロリットルにします。次に、プレートをホイルで覆い、摂氏37度で二酸化炭素インキュベーターに72時間置きます。CD8陽性T細胞サイトカイン産生を解析するには、3日間の培養後、上清を別の96ウェルプレートに移し、製造元の指示に従ってELISAで上清を分析します。

CD8陽性T細胞の増殖を解析するには、細胞のプレートをfacsバッファーで3回洗浄します。次いで、増殖したCD8陽性T細胞に対する適切な抗体カクテル50マイクロリットルにペレットを4°Cの暗所で20分間再懸濁する。インキュベーションの終了時に、細胞をfacsバッファーで2回洗浄し、100マイクロリットルの固定バッファーを使用して、摂氏4度の暗闇で20分間固定します。

最後に、細胞をfacsバッファーでさらに2回洗浄し、ペレットを200マイクロリットルのfacsバッファーに再懸濁します。次に、フローサイトメトリーにより、フラレート二標識CD8陽性T細胞の増殖の割合を測定します。ナイーブマウスおよび感染マウスから得られた脾臓リンパ球では、PD-1は、LCMVクローン13感染マウスの従来のFOXP3陰性CD4陽性細胞およびFOXP3陰性CD8陽性細胞の両方で特異的にアップレギュレーションされています。

FOXP3陽性CD4陽性制御性T細胞の頻度は、LCMVクローン13感染マウスではナイーブマウスの2倍であり、FOXP3陽性CD4陽性細胞のほとんどが活性化されたPD-1の高い表現型も示しています。CD8ポジティブレスポンダーT細胞は、他の免疫細胞による著しい汚染なしに、首尾よく分離することができます。制御性T細胞の単離後、80%を超える純度のCD25陽性CD4陽性T細胞の優性集団を得ることができる。

抗CD3 CD28コーティングビーズによる単離された制御T細胞およびレスポンダーT細胞の刺激は、CD8陽性レスポンダーT細胞の用量依存的な方法で阻害をもたらす。実際、CD8陽性レスポンダーT細胞を慢性制御性T細胞と1対1の比率で共培養すると、CD8陽性レスポンダーT細胞の増殖が著しく阻害されます。CD8陽性応答者T細胞を慢性感染マウスの活性化制御性T細胞と共培養すると、ナイーブマウスの休眠制御性T細胞と共培養した場合と比較して、CD8陽性応答者T細胞によるインターフェロンγ産生も有意に阻害されます。

この手法は、適切に実行すれば80時間で完了できることがわかりました。この手順を試みている間は、分離した直後に新たに分離された制御性T細胞を使用することを忘れないでください。この開発後、この技術は、医学分野の研究者が慢性炎症性疾患における制御性T細胞の機能を調査する道を開きました。

このビデオを見れば、調節性およびレスポンダー型T細胞共培養システムを使用して、in vitro制御性T細胞抑制手順を設定する方法について十分に理解できるはずです。