全血からの超高感度のタンパク質検出のための全自動遠心マイクロ流体デバイス

この手順の全体的な目標は、天然紡績ナノファイバーを使用してELISAの検出感度を向上させることです。このビデオでは、10 マイクロリットルの全血サンプル中のタンパク質のフェムトモル検出感度を 30 分以内に達成する方法を示します。ラボ・オン・ア・ディスク・プラットフォームでは、遠心力を使用して液体をチャンバーに移送し、プロセス全体が完全に自動化されます。

検出感度は、ナノファイバーの集積化によって大幅に向上させることができる。しかし、ナノファイバーは非常に壊れやすく、取り扱いが難しいという問題がありました。この動画では、壊れやすい二酸化チタンナノファイバーマットをプラスチックディスクに貼り付ける簡単な手順をご紹介します。

エレクトロスピニングによりシリコーン基板上に二酸化チタンナノファイバーマットを製造するために、シリコーン基板を最初にシラン化し、PDMSでコーティングし、予備硬化します。次に、ナノファイバーマットをこの予備硬化PDMSに移し、この製品を打ち抜いて、取り付け用の円形ピースを作成します。反応チャンバーにPDMSを接着剤として一滴塗布し、チャンバーの底部に円形片を貼り付けます。

その後、PDMSをオーブンで硬化させます。最後に、ディスクレイヤーをELISA用の1つの完全なデバイスに組み立てます。このナノファイバー転写技術により、ナノファイバーの高い表面積をバイオアナリシスに活用することができます。

遠心式マイクロフィリティックデバイスは、ELISAに必要なすべてのプロセスの完全な統合と自動化を提供します。この技術が他の既存の方法よりも優れている点は、わずか10マイクロリットルの全血からタンパク質のフェムトモル濃度を検出できることです。付属の試験プロトコルに記載されているように、前駆体溶液を調製します。

次に、溶液をエレクトロスピナーにロードし、最適な条件を使用してエレクトロスピニングによってナノファイバーを作製します。ポリマーナノファイバーマットを調製したら、真空下で炉内で焼成します。焼成後、二酸化チタンナノファイバーマットが最終的に調製されます。

SOLIDWORKSなどの3D設計ソフトウェアを使用してマイクロフィリティックレイアウトを準備し、設計をCNCフライス盤に転送します。CNCフライス盤を操作して、チャネルとチャンバーを備えたディスクを製造します。これで、ディスクとナノファイバーマットを統合する準備が整いました。

真空チャンバー、シリコーン基板、フルオロシランを準備します。シリコーン基質をフルオロシランで真空下30分間シラン化します。硬化剤を使用してプレポリマーを10対1の比率で調製してゲストPDMSを調製し、シラン化シリコーン基板上に650 RPMで60秒間スピンコートします。

シラン処理されたウェーハにコーティングされたPDMSを摂氏65度で10分間硬化させ、接着性にします。次に、スライドガラスなどの平らな物体を使用して適切な圧力をかけ、これらのナノファイバーマットをPDMSコーティングされたシリコーンに移します。サンプルを摂氏80度で1時間焼き、接着剤PDMSを完全に硬化させます。

PDMS層に貼り付けたナノファイバーマットに数滴のエタノールを分注し、PunchItを使用して直径6ミリメートルの穴を開けます。次に、PDMSに貼り付けられたパンチングされたナノファイバーマットをシリコーン基板から剥がします。次に、ディスク内の結合反応チャンバーに約20μLのPDMS混合物をコーティングし、PDMS上に付着したナノファイバーをチャンバー内に入れます。

その後、ナノファイバーマット一体型ディスクを摂氏80度で1時間インキュベートします。エタノール中のGPDESの溶液1容量あたり1容量を調製します。次に、ディスク内のナノファイバーを酸素プラズマで処理します。

各ナノファイバーマットに100マイクロリットルのGPDES溶液を分注し、密閉容器内で室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、ディスクをワイパーで軽くたたいてGPDES溶液を取り出します。エタノールで洗い、取り出し、80°Cで1時間焼きます。

焼き上がったらエタノールで洗い、軽くたたいて取り除きます。このプロセスを繰り返し、窒素流でブロードライします。抗体の固定化には、捕捉した抗体溶液を希釈して分注してください。

ディスクを加湿チャンバーに保管し、37度で4時間インキュベートします。残りの溶液を洗浄バッファーで洗い流します。次に、両面粘着テープを使用してディスクを組み立てます。

適度な圧力を加えて、層を完全なディスクに組み立てます。結合反応チャンバーにブロッキングバッファーを充填し、摂氏37度で1時間インキュベートします。ウォッシングバッファーで2回洗い、使用するまでディスクを摂氏40度で保管します。

試薬、洗浄バッファー、10マイクロリットルの全血を試薬とサンプルチャンバーに入れます。ディスクをカスタムメイドの視覚化マシンにセットして、自動イムノアッセイを行います。可視化システムには、ディスクの自動操作のためにコンピューターに接続されたローターと、画像撮影用のストロボライトとCCDカメラが含まれています。

ディスクを3, 600 RPMで60秒間回転させて、赤血球を分離します。検出抗体とプラズマを混合します。混合物を二酸化チタンナノファイバーマットと一体化した反応チャンバーに移します。

免疫反応後、洗浄バッファーを反応チャンバーに移してナノファイバーを洗浄します。その後、化学発光基質溶液を結合反応チャンバーに移し、混合モードで1分間インキュベートします。最後に、反応した基板溶液を検出チャンバーに移します。

すべての反応が終了したら、ディスクを検出システムに移し、カスタムビルドのソフトウェアを使用して化学発光シグナルを読み取ります。ディスク操作と検出システムを1つのプラットフォームに統合することができます。電圧とフッ素酸塩を最適化することにより、このSEM画像に示すように均一なナノファイバーマットが得られました。

PDMSの硬化時間を最適化するために、接着力を測定しました。短すぎる場合は、ナノファイバーマットをPDMSに埋め込むか、長すぎる場合は剥がします。最適化後、ナノファイバーマットをPDMS上に安定して貼り付けました。

このグラフは、2つのプラットフォームからのC反応性タンパク質検出の線形範囲を示しています。ディスク上のナノファイバーインテグリティラボを使用すると、わずか10マイクロリットルの血清から30分以内にC反応性タンパク質の検出感度を大幅に向上させることができました。96ウェルプレートベースのELISAなど、現在利用可能なテクノロジーでは、サンプル量が多く、検出時間が長くなります。

全体として、ナノファイバー集積ディスクベースのELISAは、C反応性タンパク質の検出限界が6フェムトモールで、6桁の広いダイナミックレンジを示しました。この検出感度は、ディスクに統合されたナノファイバーによって提供される高い表面積によって支えられ、従来のELISAのそれを上回り、2, 000フェムトモルに制限されました。このビデオをご覧になった後、遠心マイクロフィリティックデバイスの調製方法、ファサルナノファイバーの組み込み方法、ELISAを使用したタンパク質検出の方法についてご理解いただければ幸

この手法は、非常に少量の生体サンプル中の低結合タンパク質を検出するのに役立ちます。