Name: 全血からの超高感度のタンパク質検出のための全自動遠心マイクロ流体デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶ 全自動遠心マイクロ流体デバイスを用いた全血中タンパク質のフェモトモル級超高感度検出法。ナノファイバーとラボオンディスク技術により、わずか10µLの検体で30分で高精度な診断が可能となる革新的なELISA手法です。

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この作品は、韓国国立研究財団（NRF）の助成金（2013R1A2A2A05004314、2012R1A1A2043747）、韓国の医療技術のR＆Dプロジェクト、保健福祉省（A121994）と韓国政府が資金を提供し、IBS-R020-D1からの助成金によってサポートされていました。

注：血液は健康な個体から採取し、採血管に採取しました。書面によるインフォームドコンセントは、すべてのボランティアから得ました。 TiO 2のNFマットの1製作<ol><li> 前駆体溶液 22 の調製 <ol><li> 1.5エタノールの混合物中のチタンテトライソプロポキシド（TTIP）のグラム（99.9％、3mL）および氷酢酸（3ml）に溶解し、マグネチックスターラーで30分間、室温（25℃）で溶液を混合します。 </li><li>エタノール（99.9％）3.64gのポリビニルピロリドン（PVP）の11重量％を溶解し、ホットプレートマグネチックスターラーを用いて1時間、65℃で溶液を攪拌します。 </li><li>組み合わせると、ホットプレートマグネチックスターラーで4時間、65℃で2溶液をかき混ぜます。 </li></ol></li><li> エレクトロスピニング <ol><li> 200μmの内側ディアメのステンレス鋼針に接続されたシリンジに調製した溶液を読み込みター。プランジ​​ャーを除去した後、シリンジに直接ソリューションを注ぎます。 </li><li>高いDC電圧（15キロボルト）に接地された基板上に配置されたSiウェハ上に10分間0.3ミリリットル/ hrの流速（2 cmの×2センチ）で一定溶液を導入します。エレクトロスピニングの間、針10センチ接地された基板との間の距離を設定します。 </li></ol></li><li> NFマットの焼成 <ol><li>炉内でNFマットを置き、高真空状態（5×10 -5トール）下で3℃/分の傾斜速度で500℃まで温度を上昇させます。 </li><li> 3時間500℃に温度を維持します。炉内のRT（25℃）に、サンプルの温度をクールダウン。 </li></ol></li></ol>遠心マイクロ流体ディスクへのTiO 2の統合2 NFマット<ol><li> ディスクの作製 <ol><li> 3D設計ソフトウェア（ 例えば 、ソルを使用しますチャンバー、チャネル、またはディスクの各層のバルブを描写するidWorksまたは類似）。デザインファイルは、コード生成ソフトウェア（ 例えば 、EdgeCAMのまたは類似）を使用してコンピュータ数値制御（CNC）コードに変換します。指示に従ってソフトウェアを使用して手動23,24注：このデバイスで使用される典型的なチャネル寸法は、x 0.3ミリメートル（幅×奥行）1.0ミリメートルです。 </li><li> CNCフライス盤のオペレーティングソフトウェアを開きます（ 例えば 、 DeskCNCまたは類似の）およびオペレーティング・ソフトウェアにCNCコードをロードし、順番に以下をクリックしてください： &quot;AUTO&quot; - &gt; &quot;GコードOPENを&quot; - &gt;生成されたCNCコードを選択します。 </li><li> CNCフライス盤にPC板を取り付け：トップ層とディスク層のためのPC板5ミリメートルのために1ミリメートルのPC板を使用しています。 「START」ボタンをクリックすることで、ディスクの各層を切断するためにCNCフライス盤を実行します。 </li></ol></li><li> ディスクへ のTiO 2 NFマット の転送<ol><li> 30分間真空下で真空チャンバー内-1-トリクロロシランシリコン基板と（トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル）の40μLを含む小さなペトリ皿に置きます。フルオロシランは、気化し、基板上に塗布されます。 </li><li>真空チャンバ1の比率とドガ：10で硬化剤とポリジメチルシロキサン（PDMS）プレポリマーを混合します。スピンコート60秒間650 rpmでシリコン基板上にPDMS。 </li><li>付着状態を達成するために10分間65℃のオーブン中でシリコン基板上に塗布されたPDMSを硬化します。 注：硬化時間は、環境条件に応じて変えることができ、接着力は、レオメーターを用いてタック試験によって試験することができます。 </li><li>ピンセットを使用して、PDMS被覆シリコン上にエレクトロスピニングし、焼成することにより調製TiO 2のNFマットを転送します。その後、手動でフラットなオブジェクト（ 例えば 、ガラススライド）に移したTiO 2 NFのマットの上にコンフォーマルな圧力を適用し、オブジェクトを削除します。置きます4時間、65℃または1時間80℃のオーブン中でこのサンプルは、完全にPDMS層を硬化させました。 </li><li> 20μlのPDMS /硬化剤混合物と、ディスク内のコート結合反応室（10：1）、接着層として機能するディスク上にTiO 2のNFマットを接続します。 </li><li> PDMS層上のTiO 2 NFのマットの上にエタノール（99.9％）の50μLを分注し、直径6mmのパンチ穴とNFマットを切断し、20μlのでコーティングされた結合反応室にTiO 2のNFマットをカットを転送前のステップでPDMSの。 注：このステップでは、エタノールはSi基板からカットTiO 2のNFマットを取り外すために役立つであろう。 </li><li>完全にPDMSを硬化させる1時間4時間、または80℃で65℃のオーブン中のTiO 2 NFマット統合ディスクをインキュベートします。 </li></ol></li><li> ディスク上 のTiO 2 NFマット の表面改質 <ol><li> Pエタノール中の（3-グリシドキシプロピル）メチルジエトキシシラン（GPDES）（99.9％）のrepare 1％（v / v）の溶液。 </li><li> 140 W、180秒間50sccmの酸素流量で酸素プラズマでディスクを統合したTiO 2 NFマットを扱います。各ナノ繊維マットの上GPDES溶液100μlを分注し、2時間室温（25℃）でインキュベートします。 </li><li>洗浄瓶を使用して、エタノール（99.9％）を分配することによって基板を簡単に洗浄し、その後、ディスクを反転し、クリーンワイプに対してそれをブロッティングによりエタノールを完全に除去します。 1時間80℃で硬化します。上記のように物理的に吸着し、未結合GPDES分子を除去するために、同様にエタノール（99.9％）で2回洗浄します。 </li><li>ドライ真空下、窒素気流で乾燥ブロー。 注：ディスクは使用するまで室温（25℃）で密閉容器に保存することができます。 </li></ol></li><li> 表面上の抗体の固定化 <ol><li>捕捉抗体の200μg/ mlの溶液を作製（モノクローナルマウス抗ヒトのhsCRPまたはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液（pH7.4）で抗体を希釈したモノクローナルマウス抗のcTnI）。マイクロピペットを用いて、ディスク内の各NFマット上に溶液5μLを分注します。抗体の詳細については、材料のリストを参照してください。 </li><li>加湿チャンバー内のディスクを保持し、4時間37℃でインキュベートします。 0.1％BSA-PBS緩衝液でNFマットコーティングされた抗体を洗ってください。マイクロピペットを用いて洗浄バッファー100μlでチャンバーを埋める、吸引またはデカンテーションによってバッファを削除します。最後に、ディスクを反転し、クリーンワイプに対してそれをブロットして、[ディスクを組み立てます。 </li></ol></li><li> ディスクアセンブリ <ol><li> CADプログラム（ 例えば 、AutoCADのまたは類似）を使用した両面粘着テープ上のディスクのデザインを描画します。カッティングプロッタへのCAD設計をロードします。 </li><li>カッティングプロッタを使用して、両面粘着テープをカットします。両面接着テープの1の保護層をはがし、私を添付ディスク層の上にトン。他の保護層をはがし、ディスク層の上にトップ層を添付してください。 </li><li>プレス機であらかじめ組み立てられたディスクをロードし、正確に各バルブ、チャネル、およびチャンバを接続するために各層に整列マークを使用して、トップ/接着剤/ディスク層を合わせます。プレス機を使用してコンフォーマルな圧力を適用します。 </li></ol></li></ol> 3.イムノアッセイ<ol><li>マイクロピペットを用いて、1％BSA-PBS緩衝液でチャンバーを記入し、37℃で1時間ディスクをインキュベートします。マイクロピペットを用いて吸引によりバッファを削除してください。未反応部位をブロックするために、ディスク内のタンパク質の非特異的吸着を低減するために、この手順を実行します。 </li><li>マイクロピペットを用いて、チャンバーを充填し、吸引することにより、0.1％BSA-PBSで2回洗浄します。 注：この段階でディスクを使用するまで4℃で保存することができます。 </li><li>負荷micropipettを使用してディスク上のCRP検出のための抗原スパイク全血またはCRP無血清10μlの電子。較正グラフを作成するための、100 ng / mlで、1 pg / mlでのCRPの濃度を使用します。そして、のcTnI 10 pg / mlでの100 ng / mlで。 注：μMの範囲である全血におけるCRPの高いレベルに起因して、CRP無血清は、デバイスの低検出限界を示すために使用されました。 </li><li>赤血球を分離するために60秒間3600回転（391 XG）でディスクをスピン。 </li><li> 3秒間2,400 rpmでディスクを回転させることにより、HRPと結合した検出抗体の8μLを含むチャンバーにレーザー照射によるバルブ＃1、上清の血漿の転送4μlを開きます。 注：ディスク操作の弁作動および可視化のための一般的なプロセスは、以前の報告書に詳細に記載されている21。 </li><li>タンパク質および検出抗体の結合のために5秒間混合モード（15 Hzの秒-1、15°）を適用します。 </li><li>オープンバルブ＃2、および結合反応室にステップ6で調製した混合物を転送（2,400 rpmで、3秒）。その後、混合物とTiO 2のNF上の結合抗体間の免疫反応を達成するために20分間混合モード（60 Hzの秒-1、2°）を適用します。反応後、開弁＃3と廃棄室（2400 rpmで、10秒）に残留混合物を移します。 </li><li>バルブ＃4を開いて、ディスク（2400 rpmで、4秒）を回転させることにより結合反応室に洗浄緩衝液（600μl）を転送します。その後、チャンバー内でのTiO 2のNFを洗浄するために120秒間混合モード（30 Hzの秒-1、30°）を適用します。 </li><li>ステップ3.8の同じ条件に従うことによって、二回以上のTiO 2のNFを洗浄し、20秒間2,400 rpmでディスクを回転させることによって、完全に残留洗浄バッファーを削除します。そして、バルブ＃5を閉じます。 </li><li>化学発光反応のために、弁＃6及び紡糸を開くことによって、結合反応チャンバーに化学発光基質溶液を移送した後、1分間混合モード（30ヘルツ秒-1、2°）を適用その後10秒間、2400 rpmでディスク。 </li><li>バルブ＃7を開き、10秒間2,400 rpmでディスクを回転させることにより検出チャンバに反応した基質溶液を移します。 </li><li>光電子増倍管（PMT）モジュール装備検出システムを使用して、反応基質溶液からの化学発光シグナルを測定します。 注：ステップモータ、光学機械部品、並進ステージ、および市販のPMT：検出システムは、次の部品を使用して、カスタムビルドマシンです。光学機械部品やステップモータ装置を保持するように組み立てられ、モータは、ディスクを回転させることができます。検出は光学機械部品に固定されたPMTによって実行され、それは、デバイスの検出チャンバの上方に配置されています。ステップモータを操作することによって、検出チャンバは、右のPMTの検出ゾーンの下に並んでいます。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

TiO 2のNF統合ディスク上のアッセイは、血液の非常に低い量で存在する低豊富なタンパク質の超高感度検出のための、迅速、安価で便利な技術です。この技術は、少量の試料（10μL）を使用することの利点を有しており、同時に複数のサンプルの分析に適しています。これは、多重免疫測定装置として大きな可能性を提供します。デバイスは、従来のELISAに必要とされる血漿分離のような試料前処理工程を必要としないというさらなる利点を有します。また、デバイスが原因で事前に設計されたチャンバ、チャネル、およびバルブの全体イムノアッセイ手順（ 例えば 、混合、洗浄、結合など）を自動的に実行することができます。また、接着剤を使用して代わりに粉砕し、手動アセンブリの市販のディスク製造方法（ 例えば 、射出成形、UV /音波/熱接着）を用いて、分析装置製造の全体の手順とすることができます自動化されました。 また、ここで提示転写印刷法は、薄い接着PDMS層を利用して基板を対象とするドナーからのエレクトロNFの簡便な移動を示しています。一般的に、焼成工程後に得...

疾患の診断のためのいくつかのプラットフォームでは、このようなナノワイヤー、3ナノ粒子、4ナノチューブ、5及びナノファイバー（NFS）6-8のようなナノスケール物質1,2に基づいて開発されてきました。これらのナノ材料は、その独特の物理化学的特性のために高感度のバイオアッセイのための新技術の設計で優れた展望を提供しています。例えば、メソ多孔性酸化亜鉛ナノファイバーは、乳癌バイオマーカーのフェムトモル感度検出のために使用されている。 図9は、最近、二酸化チタン（TiO 2）に基づくナノ材料は、その化学的安定性を考慮すると生体分析アプリケーション10のために検討されている、11無視できるタンパク質の変性、12および生体適合性。13また、TiO 2の表面上のヒドロキシル基が化学修飾および生体分子の共有結合を促進する。14,15柄のTiO 2 THInはフィルム16またはTiO2ナノチューブ17は、表面積を増大させることにより標的タンパク質の検出感度を向上させるために利用されています。しかし、製造工程はかなり複雑であり、高価な装置を必要とします。一方、エレクトロスピニングされたNFSが簡単かつ低コストの製造工程だけでなく、その高い表面積の注目を集めている; 18,19は、まだ、エレクトロスピニングされたTiO 2のNFマットの壊れやすいまたは緩い特性が処理することが困難になり、マイクロ流体デバイスと統合。6,20したがって、TiO 2のNFマットはほとんど生物分析アプリケーション、過酷な洗浄条件を必要特にで利用されませんでした。 この研究では、これらの制限を克服するために、我々は、薄いポリジメチルシロキサン（PDMS）、接着剤層を利用して任意の被処理基板の表面にNFがマット電界紡糸を転送するための新しい技術を開発しました。 Furthermore、我々は成功したTiO 2 NFは、ポリカーボネート（PC）製の遠心マイクロ流体デバイス上にマットエレクトロスピニングの統合を示しています。 C反応性蛋白（CRP）と同様に心筋トロポニンI（のcTnI）の完全に自動化され、敏感な高、および統合された検出は、全血のわずか10μLから30分以内に達成された、このデバイスを使用する。21により組み合わせにNFSおよび遠心プラットフォームの特性の利点は、アッセイは、検出下限で100 ng / mlで（〜0.8 PM）に1 pg / mlで（〜8 FM）から6桁の広いダイナミックレンジを示しCRPおよび37 pg / mlで（〜1.5 PM）の検出限界は100 ng / mlで（〜4 nm）に10 pg / mlで（〜0.4 PM）からダイナミックレンジの0.8 pg / mlで（〜6 FM）のcTnIのため。これらの検出限界は、対応する従来のELISAの結果と比較して〜300〜20倍低いです。この技術は、適切な抗体を用いて、任意の標的タンパク質を検出するために適用することができます。全体的に、このデバイスの共同例えば 、全血を10μl、それは生物学的試料の非常に少量からでも素晴らしい感度で標的タンパク質のまれな量を検出することができるので、ULDは、体外診断薬および生化学的ア ​​ッセイに大きく貢献します。我々は唯一の本研究でELISAを用いた血清タンパク質の検出を示しているが、マイクロ流体デバイスとエレクトロNFSプロトコルの転送と統合技術は、より広く、高い検出感度のための大きな表面積を必要とする他の生化学的反応に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>Siウェーハ</td><td>LG SILTRON</td><td>ポリッシュウェーハ、テストグレード</td><td>直径(mm)= 150、向き= <100>、ドーパント=ホウ素、RES(Ω・cm)= 1 - 30、厚さ(&mu;m) = 650 - 700</td></tr><tr><td>ポリカーボネート (PC)&nbsp;</td><td>大同プラスチック</td><td>PCS#6900</td><td>厚さ(mm)= 1および5&nbsp;</td></tr><tr><td>テトライソプロポキシドチタン、98%、</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン、Mw = 1,300,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)-1-トリクロロシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>PDMSと硬化剤</td><td>ダウ・コーニング</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>GPDES</td><td>Gelest Inc</td><td>SIG5832.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>J T Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FE-SEM</td><td>FEI</td><td>Nova NanoSEM</td><td></td></tr><tr><td>X線光電子分光</td><td>ThermoFisher</td><td>K-alpha</td><td></td></tr><tr><td>3Dモデリングマシン</td><td>M&I CNC Lab, Korea</td><td></td><td>CNC milling machine</td></tr><tr><td>ワックスディスペンシングマシン</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td><td></td><td>カスタマイズ</td></tr><tr><td>両面粘着テープ</td><td>FLEXcon, USA</td><td>DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95</td><td></td></tr><tr><td>カッティングプロッター</td><td>(株) グラフテック (株</td>) <td>グラフテック CE3000-60 MK2</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>MIDAS</td><td>SPIN-3000D</td><td></td></tr><tr><td>炉(焼成)</td><td>R. D. WEBB COMPANY</td><td>WEBB 99</td><td></td></tr><tr><td>Rheometer (Tack test)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Haake MARS&nbsp;III - ORM パッケージ</td><td></td></tr><tr><td>酸素プラズマシステム</td><td>FEMTO</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナルマウス anti-human hsCRP</td><td>Hytest Ltd., Finland</td><td>4C28</td><td>(clone # C5)</td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-cTnI</td><td>Hytest Ltd., Finland</td><td>4T21</td><td>(clone # 19C7)</td></tr><tr><td>HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab19175</td><td></td></tr><tr><td>HRP標識マウスモノクローナル抗cTnI</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab24460</td><td>(クローン#16A11)</td></tr><tr><td>hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab111647</td><td></td></tr><tr><td>cTnI</td><td>Fitzgerald, MA</td><td>30-AT43</td><td></td></tr><tr><td>ウシアルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Amresco Inc</td><td>E404</td><td></td></tr><tr><td>採血チューブ</td><td>BDバキュテナー</td><td>367844</td><td>K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes</td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA femto</td><td>Invitrogen</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>モジュール式マルチラベルプレートリーダー</td><td>Perkin Elmer</td><td>Envision 2104</td><td></td></tr><tr><td>ディスク操作機</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td><td></td><td>カスタマイズ</td></tr><tr><td>光電子増倍管(PMT)</td><td>浜松ホトニクス</td><td>H1189-210</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk</td><td>バージョン2012</td><td>設計ソフト</td></tr><tr><td>SolidWorks 3D CADソフト&nbsp;</td><td>SOLIDWORKS株式会社</td><td>バージョン2013</td><td>3D設計ソフトウェア、</td></tr><tr><td>Edgecam</td><td>Veroソフトウェア</td><td>バージョン2009.01.06928</td><td>コード生成ソフトウェア</td></tr><tr><td>DeskCNC</td><td>Carken Co.</td><td>バージョン2.0.2.18CNC</td><td>フライス盤ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

全血からの超高感度のタンパク質検出のための全自動遠心マイクロ流体デバイス

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)は、生体サンプル中の少量のタンパク質を検出するための有望な方法です。サンプル量とアッセイ時間を削減し、完全自動化を実現するためのプラットフォームを提供するデバイスは、ポイントオブケア診断での潜在的な使用に必要です。最近では、TiO2ナノファイバー(NF)マットで構成されたラボ・オン・ア・ディスクを用いて、血清タンパク質、C反応性タンパク質(CRP)、心筋トロポニンI(cTnI)の超高感度検出を実証しました。これは、フェムトモル(fM)検出感度で、30分間で少量の全血から広いダイナミックレンジを示しました。この装置は、血液の分離、計量、混合、洗浄のためのいくつかのコンポーネントで構成されており、少量のサンプルからの感度を向上させるために自動化されています。ここでは、ビデオデモンストレーションでは、NFとディスクの製造、それらの統合、および操作のための実験プロトコルとノウハウを次の順序で示します。TiO2 NFマットのディスクへの転写印刷。免疫反応、ディスクの組み立ておよび操作のための表面改質。イムノアッセイのディスク上での検出と代表的な結果。この装置を使用することで、サンプルや試薬の消費を最小限に抑えたマルチプレックス分析が可能になります。これらの利点を考えると、このデバイスはさまざまなアプリケーションで使用され、存在量が少ないタンパク質の分析を容易にするのに有益であることが証明されるはずです。

高感度で全血から、このプロトコルは、タンパク質の検出のための完全に自動化された遠心マイクロ流体デバイスを使用することで調製しました。 TiO 2のNFマットは、エレクトロスピニング及び焼成の方法により調製しました。所望の直径、形態、及び厚さのNFSを製造するために、そのような流量、電圧、紡糸時のような電界紡糸条件を最適化しました。条件が最適化されていなかった場合には、形成されたのNFの品質が劣っていました。具体的には、NFSが低電圧（5キロボルト）でポリマー溶液から紡糸されなかった、電圧が高い場合（&gt; 20キロボルト）を破壊しました。同様に、回転時間が適切な密度、あまりにも疎ではない（1分）または密度が高すぎる（30分）でのNFの製造に重要でした。また、高流量に起因するビーズの形成を回避するために、流量を操作しました。そのように、15 kVでの印加電圧、10分の時間および0.3 mlの時の流量をエレクトロスピニング<suP&gt; -1形態および結果として得られるのNFの厚み（ 図1）に基づいて、NF製造のため...

このプロトコルは、全血10μL中のタンパク質のフェムトモル検出感度を30分以内に達成する方法を示しています。これは、ラボ・オン・ア・ディスクに統合されたエレクトロスピニング・ナノファイバー・マットを使用することで達成でき、高い表面積と効果的な混合・洗浄によりS/N比が向上します。

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

この手順の全体的な目標は、天然紡績ナノファイバーを使用してELISAの検出感度を向上させることです。このビデオでは、10 マイクロリットルの全血サンプル中のタンパク質のフェムトモル検出感度を 30 分以内に達成する方法を示します。ラボ・オン・ア・ディスク・プラットフォームでは、遠心力を使用して液体をチャンバーに移送し、プロセス全体が完全に自動化されます。検出感度は、ナノファイバーの集積化によって大幅に向上させることができる。しかし、ナノファイバーは非常に壊れやすく、取り扱いが難しいという問題がありました。この動画では、壊れやすい二酸化チタンナノファイバーマットをプラスチックディスクに貼り付ける簡単な手順をご紹介します。エレクトロスピニングによりシリコーン基板上に二酸化チタンナノファイバーマットを製造するために、シリコーン基板を最初にシラン化し、PDMSでコーティングし、予備硬化します。次に、ナノファイバーマットをこの予備硬化PDMSに移し、この製品を打ち抜いて、取り付け用の円形ピースを作成します。反応チャンバーにPDMSを接着剤として一滴塗布し、チャンバーの底部に円形片を貼り付けます。その後、PDMSをオーブンで硬化させます。最後に、ディスクレイヤーをELISA用の1つの完全なデバイスに組み立てます。このナノファイバー転写技術により、ナノファイバーの高い表面積をバイオアナリシスに活用することができます。遠心式マイクロフィリティックデバイスは、ELISAに必要なすべてのプロセスの完全な統合と自動化を提供します。この技術が他の既存の方法よりも優れている点は、わずか10マイクロリットルの全血からタンパク質のフェムトモル濃度を検出できることです。付属の試験プロトコルに記載されているように、前駆体溶液を調製します。次に、溶液をエレクトロスピナーにロードし、最適な条件を使用してエレクトロスピニングによってナノファイバーを作製します。ポリマーナノファイバーマットを調製したら、真空下で炉内で焼成します。焼成後、二酸化チタンナノファイバーマットが最終的に調製されます。SOLIDWORKSなどの3D設計ソフトウェアを使用してマイクロフィリティックレイアウトを準備し、設計をCNCフライス盤に転送します。CNCフライス盤を操作して、チャネルとチャンバーを備えたディスクを製造します。これで、ディスクとナノファイバーマットを統合する準備が整いました。真空チャンバー、シリコーン基板、フルオロシランを準備します。シリコーン基質をフルオロシランで真空下30分間シラン化します。硬化剤を使用してプレポリマーを10対1の比率で調製してゲストPDMSを調製し、シラン化シリコーン基板上に650 RPMで60秒間スピンコートします。シラン処理されたウェーハにコーティングされたPDMSを摂氏65度で10分間硬化させ、接着性にします。次に、スライドガラスなどの平らな物体を使用して適切な圧力をかけ、これらのナノファイバーマットをPDMSコーティングされたシリコーンに移します。サンプルを摂氏80度で1時間焼き、接着剤PDMSを完全に硬化させます。PDMS層に貼り付けたナノファイバーマットに数滴のエタノールを分注し、PunchItを使用して直径6ミリメートルの穴を開けます。次に、PDMSに貼り付けられたパンチングされたナノファイバーマットをシリコーン基板から剥がします。次に、ディスク内の結合反応チャンバーに約20μLのPDMS混合物をコーティングし、PDMS上に付着したナノファイバーをチャンバー内に入れます。その後、ナノファイバーマット一体型ディスクを摂氏80度で1時間インキュベートします。エタノール中のGPDESの溶液1容量あたり1容量を調製します。次に、ディスク内のナノファイバーを酸素プラズマで処理します。各ナノファイバーマットに100マイクロリットルのGPDES溶液を分注し、密閉容器内で室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、ディスクをワイパーで軽くたたいてGPDES溶液を取り出します。エタノールで洗い、取り出し、80°Cで1時間焼きます。焼き上がったらエタノールで洗い、軽くたたいて取り除きます。このプロセスを繰り返し、窒素流でブロードライします。抗体の固定化には、捕捉した抗体溶液を希釈して分注してください。ディスクを加湿チャンバーに保管し、37度で4時間インキュベートします。残りの溶液を洗浄バッファーで洗い流します。次に、両面粘着テープを使用してディスクを組み立てます。適度な圧力を加えて、層を完全なディスクに組み立てます。結合反応チャンバーにブロッキングバッファーを充填し、摂氏37度で1時間インキュベートします。ウォッシングバッファーで2回洗い、使用するまでディスクを摂氏40度で保管します。試薬、洗浄バッファー、10マイクロリットルの全血を試薬とサンプルチャンバーに入れます。ディスクをカスタムメイドの視覚化マシンにセットして、自動イムノアッセイを行います。可視化システムには、ディスクの自動操作のためにコンピューターに接続されたローターと、画像撮影用のストロボライトとCCDカメラが含まれています。ディスクを3, 600 RPMで60秒間回転させて、赤血球を分離します。検出抗体とプラズマを混合します。混合物を二酸化チタンナノファイバーマットと一体化した反応チャンバーに移します。免疫反応後、洗浄バッファーを反応チャンバーに移してナノファイバーを洗浄します。その後、化学発光基質溶液を結合反応チャンバーに移し、混合モードで1分間インキュベートします。最後に、反応した基板溶液を検出チャンバーに移します。すべての反応が終了したら、ディスクを検出システムに移し、カスタムビルドのソフトウェアを使用して化学発光シグナルを読み取ります。ディスク操作と検出システムを1つのプラットフォームに統合することができます。電圧とフッ素酸塩を最適化することにより、このSEM画像に示すように均一なナノファイバーマットが得られました。PDMSの硬化時間を最適化するために、接着力を測定しました。短すぎる場合は、ナノファイバーマットをPDMSに埋め込むか、長すぎる場合は剥がします。最適化後、ナノファイバーマットをPDMS上に安定して貼り付けました。このグラフは、2つのプラットフォームからのC反応性タンパク質検出の線形範囲を示しています。ディスク上のナノファイバーインテグリティラボを使用すると、わずか10マイクロリットルの血清から30分以内にC反応性タンパク質の検出感度を大幅に向上させることができました。96ウェルプレートベースのELISAなど、現在利用可能なテクノロジーでは、サンプル量が多く、検出時間が長くなります。全体として、ナノファイバー集積ディスクベースのELISAは、C反応性タンパク質の検出限界が6フェムトモールで、6桁の広いダイナミックレンジを示しました。この検出感度は、ディスクに統合されたナノファイバーによって提供される高い表面積によって支えられ、従来のELISAのそれを上回り、2, 000フェムトモルに制限されました。このビデオをご覧になった後、遠心マイクロフィリティックデバイスの調製方法、ファサルナノファイバーの組み込み方法、ELISAを使用したタンパク質検出の方法についてご理解いただければ幸いです。この手法は、非常に少量の生体サンプル中の低結合タンパク質を検出するのに役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶ 全自動遠心マイクロ流体デバイスを用いた全血中タンパク質のフェモトモル級超高感度検出法。ナノファイバーとラボオンディスク技術により、わずか10µLの検体で30分で高精度な診断が可能となる革新的なELISA手法です。

全血からの超高感度のタンパク質検出のための全自動遠心マイクロ流体デバイス

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