コロイド粒子の自己組織化プロセスを介して、PDMSマイクロ流体チップ内のサブ50 Nmのナノ流体ジャンクショ​​ンを作成します

このプロトコルは、ポリジメチルシロキサン中の2つのマイクロチャネル間にナノ流体接合部を作成するためのコロイドシリカナノ粒子の新規で単純な自己組織化技術を実証します。陽イオン選択膜として機能する孔径約45ナノメートルのビーズ膜は、DNAおよびタンパク質サンプルの動電濃縮に使用できます。概要:最初のステップでは、ナノトラップを備えたPDMSデバイスを二重成形プロセスで鋳造します。

デバイスをガラス基板にプラズマ接合した後、表面官能化シリカビーズをマイクロチャネルに注入して、自己組織化コロイド膜を形成します。最後に、ソースメーターと分圧器を使用して膜全体に電圧が印加されます。イオンの枯渇と濃度の増加は、CCDカメラを備えた倒立落射蛍光顕微鏡を使用して観察されます。

シリカコロイド粒子懸濁液の調製:300ナノメートルのシリカビーズから始めます。30秒間のボルテックスビーズストック。600マイクロリットルの懸濁液をエッペンドルフチューブに引き出し、2, 600gで1分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に取り除きます。ビーズを400マイクロリットルの1ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液で再懸濁し、15%の作業濃度に達します。

テックスして均質な懸濁液に到達します。同じ手順を繰り返して、500ナノメートルのシリカビーズを調製します。500ナノメートルのカルボン酸シリカビーズの場合、15ミリリットルのファルコンチューブで100ミリグラムを重くします。

次に、9.8ミリリットルの1モル塩化ナトリウムを移してビーズを再懸濁します。チューブを激しく渦にします。チューブを数回反転させて、底部に衝突したビーズを移動させます。

ビーズの表面電荷を修飾するために、PAHとPSSの2つの高分子電解質を調製します。0.9%PSSは、180ミリグラムのPSSを200ミリリットルの1モル塩化ナトリウムで溶解することによって調製されます。0.4%PAHは、300マイクロリットルの原液を15ミリリットルの1モル塩化ナトリウムに誘導することによって調製されます。

両方のソリューションをボルテックスして、完全に溶解するようにします。正に帯電したPAH層を堆積させるには、200マイクロリットルのPAH溶液をビーズ懸濁液に加えます。1分間ボルテックスし、懸濁液をローテーター内で室温で1時間インキュベートします。

結合していないPAHを洗い流すには、懸濁液を1, 801gで1分間遠心分離し、ビーズを沈殿させます。上清を取り除きます。1〜2ミリリットルの水をチューブにピペットで入れて、ビーズを破壊します。

残りの8ミリリットルの水を加えてからボルテックスします。洗濯手順をさらに4回繰り返します。5回目の洗浄と遠心分離の後、上清を廃棄し、9.8ミリリットルの1モル塩化ナトリウムでビーズを復元します。

負に帯電したPSS層を堆積させるには、200マイクロリットルのPSS溶液をビーズ懸濁液に加えます。1分間ボルテックスし、ローテーター内の懸濁液を室温で1時間インキュベートします。PAHコーティングの場合と同様に、ビーズをDI水で5回洗浄します。

最後の洗浄後、上清を廃棄し、650マイクロリットルの1ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液と0.05%トゥイーン20でビーズを再懸濁します。ビーズ懸濁液をエッペンドルフチューブに移します。500ナノメートルのアミンシリカビーズを調製するには、同じ手順を繰り返して、負に帯電した単一のPSS層を堆積させます。

PDMSマイクロ流体チップの製造:シリコンマスターを製造するには、まずシリコンウェーハ上に4, 000 RPMで1マイクロメートルの薄さのフォトレジストをスピンコートします。次に、プロジェクションリソグラフィーと反応性イオンエッチングを使用して、ビーズのナノトラップとして深さ700ナノメートル、幅2マイクロメートルの平面ナノチャネルを作成します。次に、2番目のフォトレジスト層を2, 000 RPMでスピンコートし、以前にパターン化されたナノトラップにアライメントを実行します。

接触リソグラフィーとシリコンのディープリアクションイオンエッチングによってマイクロチャネルを追加します。離型層を作成するには、シリコンマスターを50マイクロリットルのトリクロロシランを入れた真空ジャーで一晩シラン化します。PDMS金型を鋳造するには、PDMSベースと硬化剤を10:1の比率で混合します。

シリコンマスターの上にミックスを注ぎます。PDMS入りマスターを真空ジャーに入れて気泡を取り除き、70°Cのオーブンで焼いてPDMSを架橋します。2時間焼いた後、シリコンマスターからPDMSスラブを慎重に取り外します。

表面をプラズマで処理して、ブランクシリコンウェーハに永久的な結合を作成します。端に沿ってテープを貼り付けて、次の PDMS キャスト ステップのパーティション ラインをマークします。離型層を作成するには、PDMS金型を真空ジャーで一晩シラン化します。

PDMS金型の上にPDMSを鋳造し、真空ジャーに移して脱気します。その後、オーブンで焼きます。硬化したPDMSスラブを、テープでマークされた仕切り線に沿ってPDMSモールドから剥がします。

デバイスを慎重に切り取り、リザーバーに1.5ミリメートルの生検パンチで穴を開けます。テープとIPAで表面を洗浄した後、PDMSデバイスを25mm×75mmの顕微鏡スライドガラスにプラズマボンディングします。プラズマ結合の直後に、10マイクロリットルの懸濁液をビーズデリバリーチャネルの4番と6番の入口に注入します。

ビーズ送達チャネルを満たした後、ビーズ送達チャネルのアウトレット 1 と 9 を除くすべてのリザーバーを覆います。デバイスを室温で3時間自然乾燥させ、使用前に4°Cで保管してください。デバイスの顕微鏡写真は、コロイド粒子が上部と下部のビーズ送達チャネル内で集合していることを示しています。

SEM画像は、サンプルとバッファーチャネルの間に、ナノトラップアレイでトラップされた自己組織化された300ナノメートルのシリカコロイド粒子を示しています。緩衝液チャネルの3番目と7番目の入口に、10マイクロリットルの1ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液を入れます。サンプルチャネル入口5に10マイクロリットルの10ナノモルDNAサンプルを入れます。

すべての出口に逆ピペットチップで穏やかな負圧を加え、気泡のない溶液でチャネルを満たします。10マイクロリットルのリン酸ナトリウム緩衝液をリザーバー2と8に、10マイクロリットルのDNAサンプルをリザーバー10に加えて、圧力を5分間安定させます。DNAの動電濃度の実験:マイクロ流体チップをソースメーターに接続された分圧器に接続します。

PTワイヤーをリザーバー3、7、5、10に挿入します。ナノ流体接合部に電圧を印加します。まず、リザーバー5と10に30ボルトを塗布し、リザーバー3と7に接地します。

約 25 秒後にリザーバー 10 の電圧を 30 ボルトに下げます。動電予備濃縮の結果:マイクロ流体チャネルはDNAで満たされており、初期濃度は10ナノモルです。タイムラプス顕微鏡写真は、ナノ流体コロイド接合部のいずれかのイオン枯渇領域の形成を示しています。

イオン枯渇領域は10秒で開始されました。バッファーチャネルが接地されている間に、サンプルチャネルに電圧が印加されると、濃縮DNAプラグが生成されました。点線は、水路の壁を強調するために使用されています。

300ナノメートルのコロイド膜を使用して、約1, 700倍の濃度係数を15分以内に達成します。DNAの平均蛍光強度は、ナノ多孔質膜膜の時間の関数として増加しています。点線は、10ナノモル、17マイクロモル、2マイクロモル、および10マイクロモルのDNAのシグナルレベルを表します。

濃縮プラグは、300ナノメートルのシリカビーズのナノ多孔質膜で生成されます。500ナノメートルのシリカビーズ。PSSの単層でコーティングされた500ナノメートルのシリカアミンビーズ。PAHとPSSの2層でコーティングされた500ナノメートルのシリカカルボキシルビーズ。結論:推定細孔径45ナノメートルの自己組織化コロイドシリカ膜を用いて、ナノ流体接合部付近のイオン濃度分極を実証し、DNAサンプルを15分以内に1700倍濃縮した。シリコンベースのナノチャネルと比較して、自己組織化コロイド膜の主な利点は、密閉されたマイクロ流体デバイスの外側、別のバイアル内で表面機能化を実行できることです。

このアプローチは、10〜100ナノメートルの範囲でイオンおよび分子輸送を研究するために、緩衝液のビーズサイズ、イオン強度、またはpH値を制御することにより、容易に調整可能な孔径を持つマイクロナノ流体プラットフォームを迅速に作製する可能性を開くと考えています。