Name: マウス胚性造血内皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶマウス胚性造血内皮細胞の単離法。FACSを用いて造血幹細胞と前駆細胞を特定し、生存細胞を確実に分離する技術です。造血発生と細胞機能の研究に活用できます。

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

<ol><li>Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelium+during+development+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelium during development and beyond.</a> Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).</li>
<li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).</li>
<li>Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+hematopoietic+potential+of+side+population+cells+throughout+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development.</a> Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemogenic+endocardium+contributes+to+transient+definitive+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis.</a> Nat Commun. 4, 1564(2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+head+as+a+site+for+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li>
<li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li>
<li>de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoietic+stem+cells+first+develop+within+the+major+arterial+regions+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo.</a> Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).</li>
<li>Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+directing+the+formation+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+murine+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis.</a> Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).</li>
<li>Marcelo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelial+cell+specification+requires+c-Kit%2C+Notch+signaling%2C+and+p27-mediated+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control.</a> Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).</li>
<li>Tavian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta-associated+CD34%2B+hematopoietic+cells+in+the+early+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo.</a> Blood. 87 (1), 67-72 (1996).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+hematopoietic+cell+fate+of+human+embryonic+stem+cells+originates+from+primitive+endothelium+with+hemangioblastic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.</a> Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).</li>
<li>Kelly, M. A., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Hierarchy+Regulating+Human+Endothelial+Cell+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Takahashi, M., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+method+of+rodent+whole+embryo+culture+using+the+rotator-type+bottle+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+hierarchy+downstream+of+retinoic+acid+that+independently+regulates+vascular+remodeling+and+endothelial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation.</a> Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).</li>
<li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%3A+a+B+cell-specific+member+of+the+T200+glycoprotein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li>
<li>Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Ly-6G+on+myeloid+lineage+cells+in+mouse+bone+marrow.+RB6-8C5+mAb+to+granulocyte-differentiation+antigen+%28Gr-1%29+detects+members+of+the+Ly-6+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family.</a> J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).</li>
<li>Kina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monoclonal+antibody+TER-119+recognizes+a+molecule+associated+with+glycophorin+A+and+specifically+marks+the+late+stages+of+murine+erythroid+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage.</a> British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).</li>
<li>Jackson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+ischemic+cardiac+muscle+and+vascular+endothelium+by+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells.</a> J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).</li>
<li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li>
<li>Gomez Perdiguero,, E,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
</ol>

この作品は、助成金HL128064 byNIHサポートされていた、HL096360、EB017103、およびCTのイノベーションは、15 RMB-YALE-04 KKHに、およびNICHD / NIH T32HD007094を付与します。

特定の発達の窓の間にのみ出現する一過性および小細胞集団を研究に固有の技術的な問題に起因まだ揺籃期にあるフィールド - hematovascular開発の分野で多くの未解決の問題が残っています。上記で概説した技術は、ほとんどのラボで一般的に利用可能である試薬や機器を使用して、重要な発達の時点で胚組織における造血内皮細胞およびHSPC集団からでも単一細胞の単離を可能にすることにより、これらの問題の多くを改善します。我々のプロトコルは、独立した分析のために使用することができるYSおよびAGM由来の非造血内皮細胞分画の並列単離を可能にする、またはその後の分析における造血内皮細胞分画のためのコントロールとして。 この多色FACSベースの方法を用いて、造血内皮細胞の単離のキーポイントは、適切なスペクトル共同でmpensationと単色ゲートの正確な描画。このように、強く染色されていないと、単一色のコントロールは、すべての実験試行中に含まれることが推奨され、それらはこと - に沿ってアイソタイプ適合対照抗体で処理したサンプルと - 最初に適切なスペクトル補償及びゲートの図面を確立するために使用すること。しかし、非特異的な染色は、このように染色されていないと単色コントロールはFACS選別機の設定が最適化された後、ゲートの日常的検証のために十分であるこのプロトコルにより、最小限です。 不正確に描かれたSPのゲートは、このレポートに記載されたアプローチと特に懸念しています。以前の研究は、多能性幹細胞は、FACSによってSPにおけるそれらの出現のための生理学的基礎を形成する、ヘキスト赤色17の優先的な流出を示すことが示されています。我々は、造血、内皮細胞およびHSPCも同様SP細胞画分5,11内に見出されることが示されています。そのような中でカルシウムチャネルなどの薬物hibitorベラパミルは、膜貫通多剤耐性トランスポーターの様々な閉塞を経由してSP細胞におけるこのヘキスト染料流出の動作をブロックします。造血幹細胞および前駆細胞では、これは主に、ABCG2 / BCRP1トランス24を介して起こります。典型的には、ベラパミルSPの&gt; 50％の閉塞を誘発する、しかし、見ベラパミルによってヘキスト流出の全体的な程度とその後の閉塞は、おそらく、差動ヘキストで複数の多剤耐性トランスポータータイプの発現を変化させることに、発生のタイミングによって影響されることが示されています流出能力、およびベラパミル5に対する感度。したがって、強くベラパミル処置することが推奨され、ヘキスト染色陰性対照標準的に適切なSPゲーティングを確実にするために含まれる：SPゲートが正しく描画されている場合、SP細胞の数の顕著な減少がでヘキストで染色した試料中に検出されるべきベラパミルの存在。 我々は以前にソートすることが示されていますE9.5のマウス卵黄嚢からのSP細胞は〜80持っている- E9.5未分画の一致した数と比較した場合、メチルセルロースベースの造血培養でHSPCを生成するために90倍高い能力を、非ヘキストは全体YS組織細胞5を染色しました。 SPのさらなる特徴付けは、とのFlk-1 VE-カドヘリンE8.0で初期造血および血管発生時のマウス卵黄嚢で、かなりの表現があることが示されているが、幹の低発現（C-キット）および造血マーカー（CD45）。したがって、この発達時点、原始（非造血）EC、であるFlk-1 + / CD31 + / CD45 - 非SP細胞が優勢のように定義されました。内皮マーカーの発現は減少し、CD45およびc-kitの発現が増加し、E9.5とE11.5 5との間の in vitroで HSPCを生成するために増加する能力との併用としてこの発現プロファイル移行します。これはE9.5とE11.5の間で最も顕著になって、YS組織の造血活性は、SP内に含まれていることを示唆している、と回の出現内皮特性の時限損失および造血能力の段階的な買収を通じてる。このように、SP表現型を生じる多剤耐性輸送体の発現は、造血内皮5の重要な表現型マーカーです。実際には、AGMからの非SP細胞は、血液形成の可能性12を示しません。ヘキスト染色を経由してSPのこのように、成功した分離YSおよびAGMの両方は、細胞が与えられた組織の造血幹細胞区画から選別され、この分画内の細胞のその後の抗体染色は、造血の差別（のFlkできるようになることを保証するには-1 + /のc-kit + / CD45 - ）HSPC（Flk1- /のc-kit + / CD45 +）集団5,11,12対。また、以前になって卵黄嚢とAGM組織のSP内のCD41 +細胞は、メチルセルロースベースの培地11,12に多系列コロニー形成することができることを指摘しています。私たちは、のFlk1 +ののc-kit + CD45 - SP細胞などの造血内皮細胞を定義しますFlk1およびCD45の発現は5,11事実上相互に排他的であることを私たちの発見与えむしろCD41よりも、造血系の指定されたマーカーとしてCD45を使用しての。これは、両方の内皮細胞（FLK-1）を持つSP内の細胞の純粋な単離を可能にし、造血への遷移内皮のために必要な特性（C-Kit）を幹が、これらにCD45が存在しないことによって決定されるようにまだ、この変更を受けていないいます細胞。最近ゴメスらによって報告されたように、CSF1R +へのFlk-1 - /のc-kit + / CD45 + / SP細胞、（組織マクロファージ）とCsf1r-（HSC）割合として定義され、HSPC人口のサブ​​分画を考慮することが有用であろう25、これは組織マクロファージ前駆細胞集団に対する真のHSPCのより高い解像度を提供するであろうが、これは分離我々がCSF1R以来概説しているマクロファージ前駆細胞26のマーカーである造血内皮細胞画分の完全性に影響を与えるべきではないとして。 HemogENIC内皮細胞は、（1含ん - 内皮細胞の3％）YSおよびAGMの両方において稀亜集団であり、従って、それらの研究における大きな課題は、その後の用途のために不十分な細胞収率です。このプロトコルは、通常、10〜20％のみであっても最適な条件の下でわずか数百の細胞を生じ得るソートの時間、および複数の胚から得られたプールされた組織からの代表的な造血の内皮細胞ソートによって実行可能な残りのセル70〜80％において結果メチルセルロースの製造コロニーの中に埋め込まれた細胞を取り出しました。組織が急速に解剖し、プールされるべきであり、サンプルは可能な限り氷上に維持する必要があります。ソートされた細胞数を最大化するために、強く研究者は手順のすべてのステップを通して組織および細胞生存率を確保するための措置をとることをお勧めします。サンプルは、直前にFACSソーティングに新たに調製し、説明するようメチルセルロース文化に直接高血清コンテンツ、またはを含むコレクションチューブにソートしておく必要があります上記日間。生存能力の問題が解消されない場合は、収集管は、さらにソートされた細胞の生存を強化するために、血清で予めコーティングすることができます。造血内皮細胞の収率が低いままの場合、成人骨髄または市販のフルオロフォアコンジュゲートビーズは、本明細書に記載の胚組織由来の単一カラーコントロールの代わりにスペクトル補正のために使用することができます。選別された細胞を培養することを意図している場合は、造血内皮細胞およびHSPCは、組織培養ウェルに直接ソートしておく必要があります。選別された細胞は、DNAまたはRNAに関連する遺伝子発現解析のために意図されている場合は、造血および非造血、内皮細胞およびHSPC細胞の損失を最小限にするために、試料溶解緩衝液を含むコレクションチューブに直接にソートすることができます。 概説技術は成功した（と同時）造血および非造血内皮細胞の単離、ならびにHSPCと同じ胚組織から成熟血液細胞分画を可能にします。このアプローチは、別のスタッドを可能にします内皮細胞は、血液を生成するように発生する重要な遷移の分子基盤のy座標。洞察は、優勢な造血障害の治療のための幹細胞を、潜在的に自己次に多能性のヒト造血の内皮細胞及びHSPC子孫の生成を最適化するために使用することができ、これらの発達の研究から得られた、と。

機能的な循環系は、血管や血液細胞の並行開発が必要となります。血液の開発（原始造血）の初期段階では、赤芽球の起源を激しく1を議論まま。これとは対照的に、血液細胞の発達（決定的な造血）の後期段階で、それは卵黄嚢、胎盤、およびAGM内で多系列HSPCは、潜在的な（造血内皮細胞）を形成し、血液を取得する特殊な血管内皮細胞から生じることが次第に明らかになってきました2-5と同様に、卵黄と臍帯血管、胚性心内膜6、および頭部血管系7インチこれらの異なる組織内造血の内皮細胞の仕様は、開発の特定の段階で発生します。例えば、〜E8.25で卵黄嚢内と〜E10 8-12でAGM内。それにもかかわらず、あってもこれらの特定の発生の窓、造血エンドの人口中11,12 - （卵黄嚢とAGMの内皮細胞の3％1）thelial細胞は、すべての内皮細胞の小さな割合を表します。造血内皮細胞「仕様」のプロセスは、マウス、ならびにヒト、造血のために重要です。造血細胞は、卵黄嚢の血管の内皮細胞およびヒト胚13における大動脈から出芽することが示されており、いくつかの研究室は、ヒト多能性幹細胞からの血液細胞産生は14-16中間内皮細胞が必要であることを実証しました。このように、マウスの造血内皮細胞の表現型を定義し、ヒト多能性幹細胞から造血内皮細胞の生成のためのin vitro技術の追求を促進すべきであるこの動物モデルでの開発につながる分子事象を理解します。今度は、多系列HSPCから分化した血液細胞型の大規模な生成のためのアプローチの最終的な開発 - 自体はDERI中間生理学的に関連する造血内皮細胞を介したヒト多能性幹細胞からVEDは - 血液学、腫瘍学および再生医療のための信じられないほどの治療可能性を持っているでしょう。この目標に向かって、我々は、マウスの卵黄嚢11とAGM 12、胚発生の間に決定的なHSPC生産の2の主要なサイト内で、クローンレベルで、造血内皮細胞の表現型を定義しています。 HSPCのような成人の骨髄17、胚性造血内皮細胞およびHSPCの展示内のヘキスト染料流出特性、したがって、FACSプロット5,11,12上の細胞の「サイドポピュレーション」（SP）（ 図3に示すように）内に表示されます。また、我々はまた、造血内皮細胞が両方の内皮細胞のマーカーを発現し、（それぞれのFlk1とCKIT、）幹細胞が示されているが、造血系マーカー、CD45 5,11,12を発現しません 。したがって、造血内皮細胞は、identをすることができますifiedとのFlk1 + / CKIT + / CD45 - SP細胞としてFACSによって単離し、そして我々は、これらの細胞が卵黄嚢とAGM細胞5,11,12のFlk1- / CKIT + / CD45 + SP画分内に含まれるHSPCを生じさせることが示されています。造血内皮細胞およびHSPCは、または（ 図1に示されるように）ex vivoでの胚培養で最大48時間培養した胚から同定され、卵黄嚢や新鮮に安楽死させた胚のいずれかから収穫AGM組織から単離することができる。 エクスビボ文化が選択可能になります薬理学的薬剤との個々の胚の前処理は、そしてまた、所望の導入遺伝子（ すなわち、レンチウイルス形質導入によって）の一過性発現を可能にします。本明細書に記載の方法により造血、内皮細胞およびHSPCのFACS同定は、遺伝子操作マウスモデルにおける決定的造血発達の定量的尺度として使用することができます。細胞は、血液-FOを含むその後の実験的なアプリケーションのために取得することができますrmingアッセイ、発現解析、および移植。 動物対象：を使用して倫理的配慮 文学の成長体は、胚発生の決定的な造血段階中HSPC形成に対する造血内皮細胞の重要な貢献を確立しています。しかし、造血運命に向かって内皮細胞の亜集団の仕様を促進する生理的条件及び信号はよくわかっていないままであり、したがって、まだインビトロの設定で模倣することはできません。実際、この論文に記載された技術は、ex vivo造血内皮細胞の仕様とHSPCの生産のためのアプローチは、1日が開発されるかもしれないようにhematovascular開発の分野の理解を改善するための我々の研究室や他のグループによって現在使用されています。そのような時まで、ただし、フィールドは、プライマリ、野生型由来の組織（および遺伝子に依存したままtically修正された）マウス胚は、さらなる研究のために造血内皮細胞およびHSPCを指定し得ました。造血内皮細胞およびHSPCを確実に識別し、いずれかE8.5から単離することができる（10から12体節対）卵黄嚢またはE10.5（35から40体節対）11,12 AGM。複数の組織のプール- （これらの組織内の総内皮細胞11,12の3％、典型的には1を表す）造血内皮細胞の相対的な希少性のために（〜8から10）は、単一のサンプルに同腹子強くするために推奨されますその後の実験のために十分な細胞を得ます。造血内皮細胞およびHSPCが正しく同定され単離されたことを検証は、造血分化を誘導する条件下で取得された細胞を培養することによって達成することができます。これらの条件下では、造血の内皮細胞及びHSPCはERYを含むコロニーの出現をもたらす、多系統の造血性分化を示すことになりますthroid前駆細胞（BFU-E）、顆粒球およびマクロファージ前駆細胞（CFU-GM）、および顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球前駆細胞コロニー（CFU-GEMM）。

<table><tbody><tr><td>DAPT (N-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル)</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td>有毒刺激物:取り扱いの際は、目の保護具、マスク、手袋を着用してください。</td></tr><tr><td>吸収性ベンチアンダーパッド</td><td>Covidien</td><td>7134</td><td></td></tr><tr><td>#5 ストレート鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>8.5 cm ストレートハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン (アイソセシア)</td><td>ヘンリー・シャイン&nbsp;</td><td>50033</td><td>有毒吸入剤:ドラフト内で使用します。</td></tr><tr><td>100x ペニシリン ストレプトマイシン グルタミン (10,000 U/ml ペニシリン、10,000 mg/ml ストレプトマイシン、29.2 mg/ml L-グルタミン)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Type II Collagenas</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &#956;Mナイロン細胞ストレーナー</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31 - PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>561259</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td>有毒:刺激性。取り扱うときは、目の保護具と手袋を着用してください。蒸留H2Oに25 mg / mlの原液を調製し、アリコートを-20&#176で保存します。使用する準備ができるまでC。</td></tr><tr><td>ベラパミル塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>1711202&nbsp;</td><td>有毒:刺激性。取り扱う際は、目の保護具、マスク、手袋を着用してください。&nbsp;&nbsp;95%エタノールに5 mM(100x)の原液を調製します。-20&#176で保存します。Cは使用できるようになるまで&nbsp;</td></tr><tr><td>ファルコン5ml丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナースナップキャップ</td>付き <td>コーニング</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>幹細胞技術</td><td>3434</td><td>メーカーの指示に従って解凍し、アリコート 修正</td></tr>ギ<tr><td>ムサステイン</td><td>シグマ</td><td>GS500</td><td>有毒:メタノールが含まれています-ヒュームフードで使用し、取り扱いのある手袋を着用してください。蒸留水で0.02%溶液に希釈します。</td></tr><tr><td>Cytospin遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Clippped Funnel Starter Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120110</td><td>Cytospin遠心分離機用サイトファンネル、フィルターペーパー、サイトスライド、サイトクリップが含まれています</td></tr><tr><td>Anti-Mouse B-220 - FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Gr-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-85</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MouseTer-119-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル培地 (4.5 g/L)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス緩衝塩溶液</td><td>ライフテクノロジー&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン被覆 24 ウェル組織培養プレート</td><td>EMD ミリポア</td><td>PIFB24P05</td><td></td></tr><tr><td>IgG2A-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>IgG2B-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>556923</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス胚性造血内皮細胞の単離

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

胚の血管内皮からの造血内皮細胞の仕様が明確な組織内の短い発達期間中に発生し、マウスの胚体外の卵黄嚢、胎盤、臍帯血管、および胚の大動脈 - 生殖腺 - 中腎（から決定的なHSPCの出現のために必要ですAGM）領域。この細胞集団の一時的な性質および小さいサイズは慎重に定量化し、実験的な用途のために、その再現性の分離が技術的に困難にします。私たちは、卵黄嚢とAGMにおけるそれらのピーク発生時間中に造血内皮細胞およびHSPCの同時単離するための蛍光活性化セルソーティング（FACS）ベースのプロトコルを確立しました。我々は、マウス胚から卵黄嚢とAGM組織の切開のための方法を実証する、と私たちは前にFACSを介して識別と検索に最大細胞生存のために最適化された組織消化および抗体共役条件を提示します。代表的FACS ANA溶解プロットは、それは造血内皮細胞およびHSPCの表現型を特定し、クローンレベルで彼らの血形成の可能性を評価するためのメチルセルロースベースのアッセイを記載して示されています。

成功した胚YSまたはAGMからの造血内皮細胞およびHSPCのラベリング、図3に示す代表的なプロットと類似のFACS散布図を生成しますが。（図示せず）が、前方および側方散乱によって標準生細胞とダブレット差別に続いて、サイドポピュレーション（SP）イベントは「肩」としてベラパミル非存在下での線形ヘキストレッドヘキスト対ブルー差プロットで可視化されている（非SP）イベント（ 図3A）の過半数から左にシフト。総生存YS細胞の3％3 - - 総生存AGMイベントの5％SPゲートが正しく描画されたときに、SP細胞は、約1を表します。ベラパミルの処理にかかわらず、組織源のSPイベントの&gt; 50％阻害（ 図3A、上部パネル）をもたらすはずです。我々は以前のSP肩の外に現れるだけでなく、ベラパミルによってブロックされている他の集団は、TER119陽性erythrであることを決定しましたoblasts、およびしたがって、当社のSP人口5から除外されています。 SPと比較して、非SP細胞は、SP「肩」（ 図3A）に隣接するセルの密集クラスタとして識別されます。この集団は、CD31 + / CD45 -イベントとして、CD45-FITCの娘プロット（ 図3B）対CD31-PEを使用して区別することができる非造血ECが含まれています。バック比較的容易に選別することができるAGM（ 図3B）または卵黄嚢（ 図示せず ）、およびこれらの細胞の高い数から非SP細胞の5％ -非造血ECは、典型的には2です。 HSPCおよび造血ECの同定のために、娘のゲートは、CD45 +およびCD45 -細胞を同定、SP画分から描かれている。ここで、CD45 +細胞は、&lt;通常、AGM（ 図3C）またはYS（ 図示せず ）の両方における全イベントの20％です。造血ECは、その後のFlk1-PECy7の娘のp対の差動CKIT-APCでCD45 - 細胞から同定されています多くの二重陽性事象として、典型的には1表す- AGM（ 図 3 D）またはYSのいずれかから単離された場合CD45-事象の3％（ 図示せず ）。 HSPCはFlk1- / CKIT +細胞としてのFlk1-PECy7娘プロット対別々 CKIT-APCでCD45 +画分から同定され、また、典型的には約25表している-のいずれかYSから得られたとき（CD45 +細胞の小集団の30％をありません示されている ）またはAGM（ 図3 E）。したがって、造血EC及びHSPCの両方が（全細胞事象の〜0.01％）、非常にまれであり、このプロトコルは、複数の胚からの組織をプールした場合でも、各細胞型の数百を返すことが典型的です。娘プロットでゲイツは、陰性対照群を参照して確立されるべきです。特異的および非特異的抗体染色を区別するために、ゲートが最初に両方の非染色コントロール（ 図3を参照して描画します蛍光コンジュゲートアイソタイプ一致（のIgG2aまたはIgG2bの）コントロール抗体（ 図示せず ）で処理されたC）、ならびにサンプル。この後者の制御は、非特異的な染色は、我々はアイソタイプ適合対照抗体（ 例えば 、IgG2aの-PEまたはIgG2bの-FITC）は、最初にFACSソーター設定を最適化し、ゲートの境界を決定するために使用することをお勧めします、したがってながら、このプロトコルによって最小限であることを示しました、我々はまた、未染色のコントロールがソートルーチンFACS時にゲート境界と実験の品質を確認するのに十分であることがわかります。ゲートが適切に描画される場合は、未染色またはアイソタイプ適合対照から録音するとき、最小の正の散布は、単一または二重陽性ゲートで観察する必要があります。 AGMとHSPCから造血内皮細胞はメチルセルロース（ 図4A）での培養の14日間の造血分化を受けます。コロニータイプの相対的な割合は、典型的には、これらの中で観察され培養物を組織源に依存します。 E10.5 AGMから単離された造血内皮細胞は、主にCFUを生じるのに対し、BFU-EにE8.5-E9.5の所与の上昇、CFU-GM、およびいくつかのCFU-GEMM 5で卵黄嚢組織から単離された造血内皮細胞-GEMM 12、 図4B（左上のパネル）に示すように、他の系統はまだ観察されているが。 HSPCは、これらの細胞はまた、同様に他の造血コロニー型に分化するが、また、メチルセルロース培養の際にCFU-GEMMに主に上昇する（ 図4B、上部中央のパネル）を得E10.5 AGMから単離されました。非造血内皮細胞（CD31 + / CD45 -非SP）も（ 図4B、右上のパネル）メッキされています。これらの細胞は、14日後の造血文化の中で全く成長を示しません。 造血aの発現をせずに細胞を含む細胞型を発現する個々の表面マーカーの造血能力のアッセイ、ND内皮マーカーはCD31、のFlk1、C-Kitは、VE-CAD E10.5でのAGMのSP画分内で、CD41、およびCD45を制限されて実行され、E10.5 AGMでその多系列コロニー形成活性を実証​​されてきましたCD31 +に、VEカドヘリン+、c-キット+、CD41 +およびCD45 + SP細胞の12。興味深いことに、コロニー形成活性は、両方のFlk-1 +およびFLK-1 - SP細胞で認められたが、唯一のFlk1 +ののc-kit + CD45 - SP細胞は、両方の「石畳によって特徴づけ中間内皮単層を介して、多系列コロニーを生じさせました「内皮細胞の形態（ 図4B、左下パネル）とのDil-AcLDLの取り込み12による。また、C-kitの発現はAGM SPセル12の造血活性のために必要です。 造血の内皮細胞と比較した場合、いくつかの骨髄前駆細胞に類似した形態学的特性を有することが示されているが、骨髄性前駆細胞がCD45を発現し、多系列コロニーを生成することができません<ein vitroでのメートル&gt;。 HSPCはまた、多系列コロニーを生成しますが、これらの細胞が、CD45は、彼らがFLK-1発現12,23を欠き、根本的な内皮単層（ 図4B、右下のパネル）することなく、丸みを帯びた細胞クラスターを生じます。したがって、人口は我々は、SCLのよう造血内皮を定義する（または、FLK-1 + /のc-kit + / CD45-SP細胞）血液はGATA-1/2、LMO2含む可能性と堅牢hematoendothelial遺伝子発現を、形成して内皮細胞を表します/造血幹細胞および前駆細胞、ならびにそれらの非造血内皮細胞の対応は異なっているタル-1、ランクス-1、C-キット、CD34、CD41、およびCD45 11。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig1.jpg" /> 図1. ワークフロー全体を。簡単に言えば、胚は妊娠中のダムから除去され、YSまたはAGM組織が ​​収穫されます。胚は、オプション2のために培養することができます<html> 4から48時間のex vivoでの組織の収穫の前に。収穫YSまたはAGM組織は、対照およびサンプルチューブに分注し、単一細胞懸濁液に消化し、Hoechst色素および/または蛍光標識抗体の存在下でインキュベートされます。ベラパミル、カルシウムチャネル阻害剤は、また、SP画分の正確なゲーティングの検証のための本質的なネガティブコントロールを生成するために使用されます。造血内皮細胞をFACSによって識別されているようなのFlk1 + / CKIT + / CD45 - SP細胞、HSPCは、細胞のFlk1- / CKIT + / CD45 + SP画分の中に含まれている間、両方の細胞型は、造血ポテンシャルの確認のためメチルセルロース上にソートされています。 （必要であれば、検索された）また、非造血内皮細胞は、CD31 + / CD45 -非SP細胞と識別することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> igure 2 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg &quot;/&gt; YSおよびAGM組織の 図2. 解剖。 A）YSは、E10.5胚のトランクの両方前肢及び後肢芽下水平カットすることによって単離される）E8.5胚から離れて切開、およびその後の消化。Bのための無菌のHBSS +中に全体が配置されます。 AGMは、その後、肢芽や鉗子を使用して、腹側の組織から分離されている。C）明視野画像は、E10.5胚= 1ミリメートル（スケール）からYSとAGMの両方の解剖を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig2large.jpg" target="_blank">の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig3.jpg" /> 差別 のためのゲートの階層を実証する 図3. 代表的 プロットE8.5 YSから FACSによる 造血内皮細胞 の（のFlk1 + / CKIT + / CD45 - SP細胞）、HSPC（Flk1- / CKIT + / CD45 + SP細胞）、および非造血内皮細胞（CD31 + / CD45 -非SP） の またはE10.5 AGM。（ 図示せず ）、前方および側方散乱によってYS（左パネル）またはAGM（右パネル）のいずれかからの細胞の生細胞とダブレット差別に続いて、A）サイドポピュレーション（SP）ゲートが描かれ、検証されますベラパミル処理したネガティブコントロールでSP画分の有意な減少によって。非SP集団は、SPに隣接するセルの密集クラスタとして識別されます。 20,000のイベントが表示されている提示プロットの各B）非造血の内皮細胞は、非SP画分内CD31 + / CD45-細胞として同定され、そして2表す- AGMから得られたかどうか、非SP細胞の5％（図示）またはYS（ 図示せず ）。 discriへminate造血ECまたはHSPC、C）娘ゲートは、CD45 +およびCD45-細胞を同定するために、SP画分から引き出されている。D）AGM（図示）またはYS（ 図示せず ）のいずれかからの造血の内皮細胞の同定のためには、追加のドーターゲートが描かれていますCD45-画分からCKIT +（cKit-対）及び（Flk1-対）のFlk1 +細胞を区別するために。 YSまたはAGMのいずれかから造血EC通常、〜1である- 。CD45-イベントの3％E）HSPCはCKIT +とFlk1-としてCD45 +画分から同定され、そして典型的には20表している- AGMから選別するかどうかをCD45 +細胞の30％を（図示します）またはYS（ 図示せず ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig4.jpg" /> 図4. Visuaメチルセルロース 。A）メチルセルロース上にメッキの7日以内にソートされた個々の細胞からコロニーをフォーム上の造血内皮細胞の培養および HSPCを以下の造血分化のlization。多系統の造血の可能性は明確なコロニーの形態11の評価によって識別され、複数の造血コロニーの種類を観察することにより確認することができる。 図示していない AGM（またはYSからソートされた造血ECおよびHSPCのB）位相顕微鏡イメージング、）多系列の造血を表示メチルセルロース培地中での培養の7日後にコロニー形成。 （ 図示していないか、YS、）AGMから非造血ECは、これらの条件下で成長を示すものではありません。より高い倍率では、古典的な「丸石」内皮細胞の形態（白矢印）を有する接着細胞をCULに造血細胞のクラスターを生じる分かります造血ECのトゥーレス。そのような内皮細胞がソートされたHSPC（スケール= 100ミクロン）の培養で観察されない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）は、まだ少しはいくつかの内皮細胞は、血液が形成になることを指定するプロセスについて知られている、開発中に特殊な（造血）内皮細胞に由来します。我々は、マウス胚組織から造血内皮細胞およびHSPCの同時分離を可能にするフローサイトメトリーベースの方法を示しています。

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

この手順の全体的な目的は、フローサイトメトリー（FACS）を用いて、マウスの胚組織から一次造血内皮細胞を単離することです。この手法の主な利点は、胚の造血組織から生存した造血内皮細胞を、信頼性高く特異的に単離できることです。これにより、これらの細胞をその後の解析や培養に使用することが可能になります。本手法を用いて単離される造血内皮細胞および造血幹・前駆細胞は、それらの発生と機能の調節に関する重要な疑問を解明するために利用されます。一般的に、この手法に不慣れな方は、造血内皮細胞や造血幹・前駆細胞を含むサイドポピュレーション（side population）の同定に苦労することがあります。胚組織の摘出およびスキャン手順については、当研究室の元大学院生であるKat Marceloが実演します。Emily Grits（現臨床研究フェロー）およびJen Fang（現ポストドク）と共に。まず、すべての作業面を70% ethanolで拭き上げ、ラボベンチの表面に吸収性のアンダーパッドを敷きます。次に、安楽死させた個体をアンダーパッドの上に仰向けに置き、下腹部を70% ethanolで十分に噴霧します。下腹壁の中線に対して垂直に、長い水平切開を加えます。続いて、その水平切開の中点から上下に向かって、1インチの水平切開をさらに2箇所加えます。次に、腹壁を切開し、複数の胚が妊娠している左右の子宮角を完全に露出させます。ピンセットで2つの子宮角のいずれかをつかみ、はさみとピンセットを用いて子宮を周囲の子宮筋層から分離します。そして、両方の子宮角を氷上の滅菌済み60 millimeterポリスチレン組織培養プレートに移します。プレートを標準的な光学解剖顕微鏡の下に置き、ピンセットを用いて各胎児胎盤ユニットを分離します。各ユニットについて、各子宮嚢の筋層を解剖して取り除き、その下にある妊娠嚢と脱落膜を露出させます。卵黄嚢を単離するために、囲まれた胚から嚢を可能な限り慎重に除去します。必要に応じて、卵黄管血管の胚側起始部において、胚本体から残りの卵黄嚢組織を除去します。大動脈・生殖腺・中腎（AGM）を単離するため、心臓と前肢の下方で胚を切断し、胸部と頭部領域を廃棄します。次に、後肢の直下で胚を切断し、尾部組織を取り除いて廃棄します。その後、AGMを含む残りの部位から後肢と過剰な腹側組織を除去します。卵黄嚢またはAGMを回収するたびに、胚組織を1.5 mLチューブに入れたHPSS+にまとめ、氷上に置きます。単一細胞懸濁液を作成するため、胚組織を遠心分離し、HPSS+で希釈した1 mLのCollagenase type twoに組織ペレットを再懸濁させます。チューブを37 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。5分ごとに転倒混和します。インキュベーションの終了後、P1000ピペットでサンプルを10回ピペッティングし、組織を穏やかに機械的に解離させます。その後、サンプルを再度遠心分離し、ペレットを1 mLの氷冷HPSSで再懸濁します。次に、サンプルを70 µmのセルストレーナーでろ過し、細胞数をカウントします。カウント後、遠心分離によって細胞を再度回収します。そして、ペレットを37 °CのDMN+に再懸濁し、濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。FACSソーティング用に細胞をラベルするため、1.5 mLチューブに少なくとも100 µLの細胞を分注し、「Hoechstのみ」および「Hoechst＋ベラパミル」のコントロールチューブに、95%エタノールで希釈したベラパミルを最終濃度50 µMとなるように添加します。すべてのチューブを37 °Cで5分間置きます。次に、Hoechst単独コントロールチューブ、HoechstおよびVerapamil併用コントロールチューブ、およびサンプルチューブに、最終濃度5 µg/mLとなるようにHoechstを添加し、遮光した状態で37 °Cで1時間戻します。その間、15分ごとにチューブを緩やかに転倒混和させます。インキュベーション終了後、すべてのサンプルを遠心分離し、ペレットを冷たいHPSSで1 × 10⁵ cells/mLの濃度に希釈します。続いて、適切な抗体単独コントロールチューブおよびサンプルチューブに、蛍光標識抗体を最終濃度2 µg/mLとなるように添加し、遮光した状態で氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを遠心分離し、ペレットを500 µLの氷冷HPSSで再懸濁します。5 mL ラウンドボトムポリスチレン FACSチューブのメッシュフィルターキャップを用いてサンプルをろ過し、遮光して氷上に置きます。その後、直ちにフローサイトメトリーで細胞を解析します。前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）による標準的な生細胞およびダブレットの除外後、サイドポピュレーション（SP）イベントをHoechst Red対Hoechst Blueの線形ドットプロットで可視化すると、非SPイベントから左側にシフトしたショルダー状に現れます。このSPは、ベラパミル処理によって著しく減少します。非SP細胞は、SPに隣接する細胞の高密度クラスターとして同定されます。non side population細胞分画には、さらにCD31+CD45-イベントとして区別される非造血系内皮細胞が含まれています。造血幹・前駆細胞および造血系内皮細胞を同定するため、side population分画からCD45+細胞およびCD45-細胞を明らかにする娘ゲートを設定します。その後、CD45-細胞の中から、cKit対Flk1の分画プロットにおけるダブルポジティブイベントとして造血系内皮細胞を同定します。造血幹細胞および前駆細胞は、別のドータープロットにおいてCD45+画分中のFlk1-cKit+細胞として同定されます。この手順に続き、メチルセルロースベースの培養系を構築して、単離した細胞の造血能を機能的に評価するか、あるいは直ちに遺伝子およびタンパク質発現解析に供することができます。この手法に習熟し、適切に実施すれば、約4〜5時間で完了させることが可能です。この手順を実施する際は、細胞生存率を最大限に高めるため、特に指示がない限り、サンプルを遮光し氷上で保持することを忘れないでください。この手法により、血液血管生物学分野の研究者は、胚発生過程における血管内皮細胞の造血系への分化能（hemogenic specification）および造血幹・前駆細胞の産生について探究することが可能となりました。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリーを用いてマウス胚組織から造血内皮細胞を単離する方法について、十分に理解できるはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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Research

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