Name: 細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 学ぶ、ウイルス感染細胞上の細菌や真菌の接着を定量化する手法。Staphylococcus aureusやCandida albicansなどの日和見病原体のバイオフィルム形成初期段階を評価し、宿主マイクロバイオームの制御に関する知見を提供する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

>jove_content<このプロジェクトは、ミッドウェスタン大学、イリノイ州研究支援プログラム局(ORSP)、およびイリノイ州中西部大学歯科医学部(CDMI)の支援を受けました。

1. HSV株及び取扱い注：組換え非拡散HSV-1（KOS）gL86およびHSV-2（KOS）333gJを- V. Twiari 36,37によって提供された使用β-ガラクトシダーゼレポーター活性を有します。 <ol><li> 1で-80℃での単一のロットとストアからウイルスを使用してください：20％ウシ胎児血清（FBS）とダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の1の比率、使用するまでスキムミルク。ウイルスロット保存前、 入出力 -nitrophenyl-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（X-GAL）アッセイによりウイルス濃度を決定します。 </li><li>前述のように、レポーターウイルス侵入アッセイを使用して各実験アッセイの実行のためのX-Gal染色により、感染のウイルス生存率および多重度（MOI）を決定する（ 図1）14。 </li><li>希望のMOIに（オプトMEM）のウイルスを希釈します。染色の前に、単層（/ウェル0.5ミリリットルパラホルムアルデヒド）を修正しました。別々のmicroti中のウイルスの生存能力のコントロールを配置複数菌アッセイプレートと平行にタープレート。 </li></ol> 2.のHeLa 299細胞の取扱い<ol><li> 4.5g / Lグルコース、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、ゲンタマイシン（50μg/ ml）およびL-グルタミンを含むDMEM中で37℃、5％CO 2で成長します。トリプシン溶液で80％コンフルエンスで継代細胞（エチレンジアミン四酢酸、0.53 M EDTA、0.05％トリプシン; 5ミリリットル/フラスコ）。 </li></ol> 3. C.取り扱いアルビカンス 注：C.臨床検査源から得アルビカンス媒体約2倍のスキムミルクRemmelに-80℃で保存します。 <ol><li>文化はサブローデキストロース培地（37℃）に株式を凍結しました。 24時間のサブカルチャーC.後Fungisel媒体へアルビカンス （37°C、48時間）の使用のため。 </li><li>発芽管（GT）の形を生成（; 3ミリリットルFBSを、代表的なコロニーを選ぶ3時間、37℃、腹筋600、0.3）。インキュベーション後、GT洗浄（HBSSを、2倍、4,000×gでの）。 （37＆温めHBSSに洗浄GTを追加します。＃176; C; 0.32のAbs 600）。 GT形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。 </li><li>代表Fungiselコロニーピッキングによって酵母形（YF）株式懸濁液を作る（HBSS、3ミリリットルを、0.32のAbs 600）。 /微視的に血球計数器を使用して、mlのYFのフォームの数をカウントします。 YF形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。 </li><li>作業の真菌株（; 37℃; 10 5 CFU / mlの25ミリリットルHBSS中のGTまたはYF株式の250μl）を作ります</li></ol> 4. S.球菌取り扱い<ol><li>ストアS.黄色ブドウ球菌 ATCC 25923（-80°C; Remmelは牛乳の2倍を脱脂）。ヒツジ血液寒天培地（; 37℃、24時間、5％）上に培養。代表的なコロニーを選択し、株式のために2日以内に培地塩をマンニトールへの転送（37℃、18時間）。 </li><li> S.を作ります黄色ブドウ球菌ストック懸濁液（3ミリリットルHBSS; 1.32腹筋600; 10 8 CFU / ml）を<ol><li> S.作業してください黄色ブドウ球菌株（100μlの25ミリリットルのHBSSの株式の。 10 5 CFU / mlで）。 </li></ol></li></ol> 5. カンジダとS.球菌懸濁液<ol><li>メイク混合C.アルビカンスおよびS.黄色ブドウ球菌懸濁液（250μlのYFまたはGTの株式と25ミリリットルHBSS中の100μlの黄色ブドウ球菌株 ）。 </li></ol> 6.複数菌バイオフィルムアッセイ<ol><li> 2×10 5 HeLa細胞/ mlの200μlの（85％のコンフルエンスのレベル）でシード96ウェルプレート。ロックプレート（30から45分、37℃）インキュベーション前（37℃、5％CO 2インキュベーター; 18時間）。ウォッシュ単層（1×;オプトMEM）をHSVにシード（HSV-1（KOS）gL86またはHSV-2（KOS）33 GJ - 100μl中のOpt-MEM; MOI 50及び10）。プレートをインキュベート（3時間、37℃、5％CO 2）。 1日に1回だけウイルス株を使用してください。 </li><li>感染した単層（; Mgの2及びCa 2を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）;100μlの1×）で洗浄します。 25＆＃残し暖かいHBSSでPBSを交換してください181;各ウェルのリットル。 <ol><li> YF、GTおよび/ ​​またはSを追加します。 表1に示されるように平板培養する（静的に、30分間、37°C、5％CO 2） 黄色ブドウ球菌ワーキング懸濁液（N = 16; 1、100μlの細胞比の目標= 5）。 </li></ol></li><li>インキュベーション後、一度に吸引1列には、すぐにマグネシウム2およびCa +2で300μlのPBSで再充填します。ラジオ免疫沈降アッセイ溶解バッファー（;濾過滅菌; 1:50希釈の200μlのRIPA）を追加し二回、この手順を繰り返します。 </li><li>急速にHeLa細胞溶解物は、次いでマンニトール塩（MS）及び/又はFungisel（F）培地（ 図2）の上に50μlのを配置し粉砕します。 90°の角度でガラス棒を曲げを使用して溶解液を広げます。 （37℃で18時間）培養します。手動でプレートあたりのコロニー数をカウントします。コントロールは、Sから成り黄色ブドウ球菌および/ ​​またはC. HSV-非感染HeLa細胞へアルビカンス付着 。 </li></ol> 7.イメージング研究&lt;/ P&gt; <ol><li>各ラウンドガラスカバースリップを洗ってください（12ミリメートル、50ミリリットルのアセトンミリリットルビーカー100中）。乾燥及び滅菌カバースリップ（キムワイプ;ガラスシャーレ）。アルコール火炎滅菌鉗子で滅菌24ウェルプレートのウェルに、乾燥、滅菌カバースリップを置きます。 </li><li>洗浄滅菌ラウンドガラスカバースリップを含む24ウェルプレートのウェルに、HeLa細胞（96ウェルプレートに使用される5倍の体積1ミリリットル）を追加します。上記の手順6.4に6.2.1で説明したように、その後インキュベートし、プロセス、5×96ウェルプレートに使用する音量でテンプレート（表2）によれば、ウイルス、細菌および真菌を追加します。 </li><li>最終洗浄後、メタノールでスライドをフラッディングし、それを蒸発させることにより、顕微鏡検査のために細胞を固定します。染色まで室温でプレートを保管してください。 </li><li>明視野顕微鏡（1,000倍、最終的な元の倍率）のために脱イオン水でメタノール固定カバースリップを含むウェルを埋めます。すぐに水を吸引。グラムクリスタルバイオレットで各カバースリップをカバー。ウォッシュは、非結合染色（脱イオン水）の自由カバースリップ。 その場で乾燥したカバースリップは、その後、標識されたスライドにメディアをマウントハードセット（図3）とそれらを接着します。 </li><li>蛍光顕微鏡（100倍の対物; 1,000倍、最終的な元の倍率）のためにステップ7.4で説明したように、洗浄は、基本的にメタノールの自由カバースリップ。ウェル中のカバースリップを乾燥させます。 <ol><li>乾燥させた後、カバースリップを削除し、ラベルされたスライド上に置きます。 （ - 5μL1）次に、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合単純ヘルペスウイルスのタイプの1：20希釈のカバースリップをカバーするために1 + 2のgD抗体を十分な量を追加します。 </li><li> 30分間、37℃で湿気チャンバー内でスライドをインキュベートします。インキュベーション後、PBSの4変化​​でカバースリップを洗います。 </li><li>最終洗浄後、標識されたスライドにカバースリップを返します。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（;湿度室、30分間、37°C​​ DAPI）で染色。インキュベーション後4ちゃんにカバースリップを洗いますPBSのGESは、その後、メディアをマウントハードセットで標識されたスライドに貼り付けます。 </li><li>マウンティング培地は暗所で室温で24時間硬化させます。 FITCおよびDAPIカットオフフィルターで明視野顕微鏡や蛍光顕微鏡のいずれかで油浸対物レンズの下にカバースリップを調べます。共局在（ 図4）のために少なくとも50フィールド（生物ごとに最低100個の細胞）の写真を調べます。 </li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

現在のところ情報は、原核生物、真核生物およびウイルスの複数の分類学上のドメイン、 すなわち 、交差ホストmicrobiomeの半永久的なメンバーに永久の間の複雑な相互作用に利用できません。したがって、我々はSでバイオフィルムの開始を研究するためのインビトロモデルシステムで小説を開発しましたaureusおよびC. HSV-1またはHSV-2上アルビカンスは、HeLa 229（HeLa細胞）の細胞38を感染させました。 HeLa細胞モデルシステムは、ユニークな利点を提供します。これは、両方のS.のための受容体として機能し、表面フィブロネクチン発現の欠如に起因していますaureusおよびC.アルビカンス 39-41。粘膜上皮の頂端42の表面は、通常より密接に自然感染と植民地化43-47で観察された模倣をフィブロネクチン、このシステムを欠いているので。したがって、我々はより直接的m...

<html>人間microbiomeは、体内の地理的領域を共有する複数の分類学上の王国からの多様な生物が含まれます。細胞表面への付着はmicrobiomeの植民地化プロセスの一部であるバイオフィルム形成に不可欠な最初のステップです。 microbiomeに含まれては、慢性かつ持続的な感染症を引き起こすウイルスであることができます。これらのウイルスによる慢性細胞感染は推定受容体の可用性における変化を引き起こす可能性があります。また1,2、細胞内病原体による細胞エントリも順番に細菌や真菌などの他のmicrobiomeメンバーの添付ファイルを、変更することができるホスト膜流動性/疎水性に影響を与える可能性があります。ヒト宿主の同じ地域に共局在これらの複数の病原体との間で発生する可能性があります相互作用を理解するために、我々は、粘膜表面に存在する分類学上の王国のスペクトルを表し、病原体の相互作用を研究することができなければなりません。 tは&quot;&gt;ヘルペスウイルスはmicrobiome 3,4の永久的なメンバーとしてのヒトの100％に存在する微生物のファミリーである。加えて、それらはまた、永続的両方の症状の存在下および非存在下で流すことができる。具体的には、単純ヘルペスウイルス1および単純ヘルペスウイルス2（HSV-1およびHSV-2、それぞれ）HSV-1およびHSV-2の原因の歯肉口内炎の両方、免疫適格個体で。oronasopharynx及び生殖管におけるmicrobiomeの永久的なメンバーであるだけでなく、性器ヘルペス5-8。これらのサイトでは、HSVは、慢性持続nectins、ヘパラン硫酸、脂質ラフトとヘルペスウイルスエントリーメディエーターの表面発現の変化における細胞の結果にHSVの9。エントリを流しウイルス無症候性/腫瘍壊死によって特徴づけ潜伏感染を引き起こします因子受容体（HVEM / TNFR）10月25日 。これらは、潜在的に日和見病原体ながら、いくつかの細菌および真菌のための共有の受容体を表す例えば黄色ブドウ球菌およびカンジダ・アルビカンス、これ、またoronasopharynx 26,27の粘膜microbiomeのメンバーとして常駐することができます。 oronasopharynx S.内aureusおよびC.アルビカンスは植民地化のの2つの異なる部位を占めます。天然歯を持つホストでは、口腔粘膜は、HSV-1およびCによって共有されていますアルビカンス、前部鼻鼻孔はS.によって占有されている間黄色ブドウ球菌 28。しかし、にもかかわらず、in vitroでの知見そのS.黄色ブドウ球菌は、口腔上皮細胞に付着し、29,30 S.正常組織29,30存在する場合球菌はまれ経口標本から単離されます。リトルは、臨床所見ものを超える生殖管の共同植民地化のニッチについて知られているS.黄色ブドウ球菌は C.ながら、性器の炎症、放電および性交疼痛症によって特徴づけられる、好気性膣炎に関連していますアルビカンスは、口腔31〜35で観察されたものと同様の粘膜の病変を生成します。このように、経口および生殖器microbiのこれらのメンバーが、分類学的王国少しOMEクロスは、宿主細胞表面5への接着を介してバイオフィルムの形成を開始することが影響能力としてのそれらの相互作用について知られています。このプロトコルは、効果的に、共コロニー形成/感染の機能的結果を判定するために適用されています。

<table><tbody><tr><td>C.albicans</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL サブロー デキストロース</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>菌類寒天</td><td>ドット Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>S.aureus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マンニトール塩寒天 Troy</td><td>Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>羊の血液寒天</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>Hela cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium、4.5 g/L グルコースと L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムなし</td><td>) Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &micro;完全なDMEM</td></tr><tr><td>トリプシンEDTA(0.05%トリプシン、0.53 M EDTA)溶液中の</td>g / ml最終濃度 1x <td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S11150</td><td>完全なDMEM</td></tr><<tr><td>strong>その他の培地および試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr>の最終濃度<td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)</td> <td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td><強>染色</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1&2、gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>グラムクリスタルバイオレット</td><td>トロイ生物製剤</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿100 x 15</td><td>ドット科学</td><td>用229693&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>エバーグリーンサイエンティフィック</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>エバーグリーンサイエンティフィック</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>培養チューブ 100 x 13</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップサークル、12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

真菌、細菌やウイルスを含む分類学上の王国全体で複数菌相互作用の研究は、以前microbiomeのウイルスのメンバーは、これらのウイルスに感染した宿主細胞とそれに続く微生物相互作用をどのように影響するかに関して検討されていません。細菌および真菌とのウイルスの共居住は、主に口腔及び生殖管の粘膜表面上に存在します。粘膜細胞、持続性の慢性または持続性ウイルス潜伏感染症、特にものは、発現された受容体の数とタイプでウイルス改変を通じてmicrobiomeのメンバーに重大な影響を与える可能性があります。宿主細胞膜のアーキテクチャの変更は、バイオフィルム形成の最初のステップを開始するための正常細菌叢と日和見病原体のその後のメンバーの変更された能力、 すなわち 、密着性をもたらすであろう。この研究は、biofilの開始時にHSVの効果の定量化および目視検査のための方法を説明しS.のm個の形成（付着） aureusおよびC.アルビカンス 。

このレポートに記載されているシステムから得られるデータの堅牢性のレベルは、 図2のaf 38に示されています。このシステムを使用することによりウイルス感染細胞や互いの密着性に及ぼす影響とブドウ球菌と真菌の相互作用の変調が描写することができます。多菌相互作用が同じ細胞で発生しているかどうかを決定するために、 図3および4 38に示すように、研究のこれらのタイプは、相互作用の顕微鏡検査を必要とします。この研究では、差動細胞の相互作用は、特定のウイルス種であるブドウ球菌および真菌付着のHSV-変調の結果として観察されます。 黄色ブドウ球菌およびC.アルビカンス （GTおよびYF）は、同じHSV非感染HeLa細胞の対照細胞に付着しました。細胞上のこの共局在は、物理ポートが不足して...

ウイルス感染HeLa細胞単層への付着に対する王国間の関連性と競争(細菌および真菌)を決定するための方法がここに記載されています。このプロトコルは、原核生物、真核生物、およびウイルスの複数の組み合わせに拡張できます。

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

この実験の全体的な目的は、HSVに事前感染させた細胞が、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）やカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）などの細菌および真菌の日和見病原体のその後の付着に及ぼす影響を測定することです。この手法は、慢性ウイルス感染がホストのマイクロバイオームの各構成員の調節において果たす役割に関する重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、バイオフィルム形成の開始段階、すなわち付着における複数の生物の相互作用を検証し、定量化できることです。この手法の意義は、日和見的な病原体の定着制御にまで及びます。なぜなら、無症状の排出を伴うHSV感染という前提条件は、人類の大多数に見られるためです。この方法は、その後の微生物の付着に対するHSVの制御に関する知見を提供できるだけでなく、CMV感染やアデノウイルス感染などの他の系にも適用可能です。まず、レポーターウイルス侵入アッセイを用いて、各実験アッセイの実行時にx-gal染色によりHSV1またはHSV2ウイルスの生存能および感染多重度（MOI）を決定します。ウイルスを目的のMOIまで希釈し、多菌種アッセイプレートと並行して、ウイルス生存能コントロールを別のマイクロタイタープレートに配置します。次に、100 µLのパラホルムアルデヒド・グルタルアルデヒド緩衝液を用いて、染色の前に単層細胞を固定します。HeLa細胞を維持するためには、4.5 g/Lのグルコース、10%熱不活化FBS、50 µg/LのゲンタマイシンおよびL-グルタミンを含むDMEMで培養してください。細胞が80%コンフルエンスに達した時点で、トリプシン溶液を用いて継代します。C.albicansを扱う場合は、凍結ストックをdexterous培地で37°Cで培養します。24時間後、C.albicansをfungicell培地に継代し、使用前に48時間インキュベートします。代表的なfungicellコロニーをピックアップし、3 mLのFPSを用いて37 °Cで3時間培養することで、C.albicansの胚芽管（GT）を形成させます。インキュベーション後、培養液を4,000 ×gで10分間遠心分離します。その後、HBSSを用いて細胞を2回洗浄します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした後、洗浄したGTを37 °CのHBSSに加え、OD 600を0.32に調整します。酵母形（YF）ストック懸濁液を作製するには、代表的なfungicellコロニーをピックアップし、3 mLのHBSSに接種します。ヘモサイトメーターを用いてOD 600が0.32になるまで培養し、1 mLあたりのYF形の数をカウントします。このとき、顕微鏡下で観察される細胞の99%がYF形である必要があります。GTまたはYFストック250 µLを37 °CのHBSS 25 mLに転移し、菌類調製液を作成します。これにより、1 mLあたり10⁵ CFUとなります。SRES ATCC 25923を調製するには、凍結ストックを5%羊血寒天培地にストリークし、37 °Cで24時間培養します。2日以内に代表的なコロニーを選別し、マンニトール塩培地に移植して37 degrees celsiusで18時間培養します。SRESストックを作成するには、代表的なコロニーを3 millilitersの37 degrees celsius HBSSに懸濁し、OD 600を0.132または10⁸ CFU/mLに調整します。ワーキングストックを調製するには、ストック懸濁液100 microlitersを25 millilitersのHBSSに転移します。これにより、1 mLあたり10⁵ CFUとなります。この方法を他の生物や微生物の株に適用する際の最初の重要なステップは、カウント可能な十分な数のコロニーを確保するために、添加すべき細菌および真菌の正確な数を決定することです。ポリミクロバイアル・バイオフィルムアッセイを行うには、96ウェルプレートに2×10¹⁵ cells/mLのHeLa細胞を200 µL分播種してください。プレートを37 °Cで30〜45分間ロッキングし、その後、5% 二酸化炭素 atmosphere下の37 °Cで18時間インキュベートします。One X optimumを用いて単層を洗浄し、単一株のHSVを播種します。一度にテストするのは1株のみとしてください。プレートを37 °C、5% CO2条件下で3時間インキュベートします。MgおよびCa含有の37 °C PBS 100 µLを用いて、感染させた単層細胞を洗浄します。その後、PBSを37 °CのHBSSに置換します。各ウェルに25 µLのHBSSを残します。次に、YF、GT、および/またはSRESの作動懸濁液を加え、5% CO2濃度の37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートの列ごとに吸引します。直ちに、マグネシウムおよびカルシウム含有PBS 300 µLをウェルに満たします。この洗浄工程を2回繰り返した後、フィルター滅菌したRIPA溶解バッファーを1:50に希釈したものを200 µLずつ各ウェルに加えます。他の細菌株または真菌株を使用する場合は、使用するRIPAの濃度が細胞溶解に十分であり、かつ微生物の生存率試験に影響を与えないものであることを確認してください。HeLa細胞溶解液を迅速にトリチュレートし、マンニトール塩培地またはFungicell培地に50 µLをピペットで分注する。次に、90度に曲げたガラス棒を用いて、溶解液をプレート表面に塗り広げる。プレートを18時間インキュベートした後、プレートあたりのコロニー数を手動でカウントする。コントロールには、HSV非感染のHeLa細胞に付着させたSRESおよびC.albicansを用います。イメージング解析を行う前に、各ラウンドガラスカバースリップをアセトンで洗浄し、滅菌します。その後、アルコールと火炎で滅菌したピンセットを用いて、乾燥した滅菌済みカバースリップを滅菌済み24ウェルプレートの各ウェルに配置します。カバーガラスを入れたプレートのウェルにHeLa細胞を播種します。次に、細胞にウイルスを感染させます。感染後、テンプレートに従って細菌および真菌を添加し、先に96ウェルプレートで示した方法で細胞をインキュベートし、処理します。最終洗浄後、カバーガラスにメタノールを満たし、その後蒸発させることで、顕微鏡観察用に細胞を固定します。明視野顕微鏡観察を行う場合は、固定済みカバーガラスが入ったウェルに脱イオン水を満たしてください。すぐに水を吸引し、各カバーガラスを覆うのに十分な量のcrystal violetを添加します。クリスタルバイオレットで染色したカバーガラスを脱イオン水で洗浄した後、C2で乾燥させ、ハードセット封入剤を用いてラベル付きスライドガラスに貼り付けます。蛍光顕微鏡観察の場合、メタノールを洗浄した後のカバーガラスをウェル内で乾燥させ、ハードセット封入剤を用いてラベル付きスライドガラスに封入します。FITC標識HSV1 plus 2GD抗体を1:20に希釈したものを、カバーガラスを十分に覆う量だけ加えます。スライドを保湿室に入れ、37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、PBSを用いてカバーガラスを4回洗浄します。最後の洗浄後、スライドを保湿室に戻します。dab Bを加え、37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBSで4回洗浄します。封入剤を室温・暗所で24時間静置して硬化させます。次に、明視野または蛍光顕微鏡の油浸対物レンズを用いて、共局在性を確認するために少なくとも50視野を観察します。Staphylococcusおよび/またはCandida albicansの付着に対するHSVの影響の代表的な結果をここに示します。HSV1の存在により、HeLa細胞へのStaphylococcalの付着が抑制されました。Candidaの酵母形ではなく胚芽管形が存在することで、ブドウ球菌の付着レベルが回復しました。HSV2に感染したHeLa細胞においても同様の結果が測定されました。この図に示されているように、Candida胚芽管形の付着レベルは、HSV1感染細胞よりもHSV2感染細胞において有意に高くなっています。Candida酵母形態に対するHSV1とHSV2の逆転効果を測定しました。細菌と真菌の相互作用を可視化するため、単層のクリスタルバイオレット染色を用いて付着パターンを決定しました。その後、蛍光顕微鏡を用いて、他の微生物に対するHSVの存在を特定しました。HSVが存在しない場合、スタフィロコッカス属菌、およびカンジダの酵母型と菌糸管型の両方がHeLa細胞上に共局在していました。しかし、HSVに感染した細胞では、カンジダのみが観察されました。この手法に習熟し、適切に実施できれば、8〜9時間で完了させることができます。この手順に続いて、ウイルスが細胞に進入した後に存在する表面受容体の分化発現など、さらなる疑問を解決するために、分化蛍光抗体染色などの他の手法を実施することが可能です。この技術の開発により、ヒトマイクロバイオーム分野の研究者は、組織培養だけでなく器官培養システムにおける微生物相互作用後の解析を行う道が開かれました。このビデオを視聴することで、分類学的界をまたぐポリマイクロバイオーム相互作用モデルを構築する方法について、十分に理解できるはずです。病原体を扱うことは極めて危険であるため、非拡散性ウイルス株の使用やバリア技術などの予防策が必要であることに留意してください。

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

アッセイは、細菌および真菌の早期のバイオフィルム形成を測定する迅速な手段を説明します。このメソッドは、微生物のバイオフィルム形成のための基層としてのマイクロタイタープレートを使用し、バイオフィルムは、クリスタルバイオレットの菌株を用いて可視化です。アッセイは、どちらかの初期のバイオフィルム形成のための定性的または定量的なアッセイを提供する。...

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

出典:Tay, S. B.ら。工学的クォーラムクエンチングラクトナーゼを用いた病原性バイオフィルムの抗病原性破壊。 J. Vis.

病原性細菌における酵素誘発バイオフィルム抑制の定量化

出典: Schlafer, S, および Frost Kristensen, M. 共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHモニタリング。 J. Vis. Exp. (2020年)このビデオは、口頭条件下で Streptococcus mutans と Candida albicans...

口腔病因研究のための細菌–真菌クロスキングダムバイオフィルムの確立

出典: ミケル・グエノック、C. ら共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いたフィラメント性菌類コロニー上の細菌バイオフィルムの定性的多スケール解析の新手法。 J. Vis. Exp.

バイオフィルム形成のための菌類-細菌共培養の確立

このビデオは、細菌や真菌によるウイルス感染細胞への多微生物バイオフィルム形成の開始を示しています。単純ヘルペスウイルス感染は、細胞への細菌の付着を妨げ、細菌と真菌の共局在を防ぎます。対照的に、感染していない細胞は、細菌と真菌の共局在とバイオフィルム形成の開始を示します。...

ウイルス感染細胞における多微生物バイオフィルムの開始を決定するためのアッセイ

このビデオでは、顕微鏡を使用して真菌菌糸上の細菌バイオフィルムを成長させ、定性的に分析する方法について説明しています。細菌のバイオフィルムは、真菌の表面に頻繁に形成され、代謝協力、競争、捕食など、多数の細菌と真菌の相互作用プロセスを伴います。...

菌糸上のバイオフィルム形成細菌を可視化するための試料調製法

このプロトコルは、成長し、質的に、共焦点顕微鏡および電子顕微鏡により真菌の菌糸上の細菌のバイオフィルムを分析するための新しい方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

このプロトコルでは、ホストの生理学的な条件の下でカンジダ菌のバイオ...

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

このプロトコルにより、腸管病原体の付着、細胞外高分子物質マトリックス形成を評価することによって細菌のバイオ フィルムの動的な性質をキャプチャする多面的なアプローチを使用しての胆汁酸塩によるバイオ...

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

学ぶ、ウイルス感染細胞上の細菌や真菌の接着を定量化する手法。Staphylococcus aureusやCandida albicansなどの日和見病原体のバイオフィルム形成初期段階を評価し、宿主マイクロバイオームの制御に関する知見を提供する。

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

さらに動画を探す