Name: 体細胞の再プログラミングの反応速度測定とリアルタイムの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぼう、体細胞の再プログラミングをリアルタイムで可視化する方法。フローサイトメトリーと細胞表面マーカーを用いて、iPSC生成の動態を追跡し、再プログラミング効率を評価する技術を解説します。

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著者らは、有用な議論のためにチャドマッカーサーに感謝します。

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+monitoring+of+hiPSC+generation+and+differentiation+using+differential+expression+of+endogenous+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs.</a> PLoS One. 5, e11834(2010).</li>
<li>Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+strategies+in+fluorescent+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Combinatorial strategies in fluorescent probe development.</a> Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+a+negative+cell+surface+marker+for+pluripotent+stem+cell+identification+during+human+fibroblast+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming.</a> PLoS One. 9, e85419(2014).</li>
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<li>Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+marker+mediated+purification+of+iPS+cell+intermediates+from+a+reprogrammable+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model.</a> J Vis Exp. , e51728(2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+fibroblast-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+support+undifferentiated+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth.</a> Stem Cells. 22, 972-980 (2004).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+live+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).</li>
<li>Naujok, O., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-evaluation+of+CD24-positivity+of+human+embryonic+stem+cells+differentiated+into+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).</li>
<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
</ol>

著者[RHQ、JSTA、KS、およびUL]の全ては、この記事で使用する試薬および器具の一部を生成サーモフィッシャーサイエンティフィック、の従業員です。

この研究は、フローサイトメトリーとリアルタイムイメージングベースの分析を使用して、再プログラミングプロセスを監視および追跡するための戦略を提供します。プロトコルの重要なステップは、再プログラミングの開始、マーカー発現に基づく再プログラミングの進行の測定、および再プログラミングのリアルタイムモニタリングです。任意のリプログラミング方法を使用できますが、ここでは仙台ベースのヒト線維芽細胞のリプログラミングに焦点を当てます。この方法の利点は、使いやすさと再プログラミングの一貫した高効率です。 
再プログラミングの進行を評価するために、細胞は再プログラミングの個別の段階で回収され、エンドポイントフローサイトメトリー分析にかけられます。陰性PSCマーカーCD44および陽性PSCマーカーSSEA4による再プログラミング培養物の二重染色により、再プログラミングの進行を評価できます6。より具体的には、再プログラミングの個別の段階でどちらか一方、どちらでもない、または両方のマーカーを発現する細胞の分布により、異なる条件下での再プログラミング動態の定量的比較が可能になります。この...

患者由来の人工多能性幹細胞（iPS細胞）を細胞療法及び薬物スクリーニングのための有望なツールです。彼らは、治療のための細胞の自家源を提供します。さらに、それらは、胚性幹細胞（ESC）の行ができるようになり、現在のものを超えて遺伝病の詳細なインビトロ分析を可能にする、遺伝的背景の非常に広いセットを包含する。最近の進歩は、センダイウイルス、エピソームプラスミドまたはmRNAを1,2と再プログラミングを含む、iPS細胞を生成するためのいくつかの方法の開発につながっています。特に、別の再プログラミング方法は、効率性と安全性のレベルを変化させることに関連しており、様々な用途のためのそれらの適切性に影響を与える他の方法で異なる可能性が高いされています。再プログラミング技術の種々の利用可能性によれば​​、再プログラミングプロセスを評価するための方法を開発することが重要になってきています。ほとんどの既存の方法は、形態または染色の定性的な検査に依存します幹細胞特異的色素と抗体を用いました。一つの最近開発された方法は、PSC-特異的miRNAまたは分化細胞特異的なmRNA 3に敏感であるレンチウイルスの蛍光レポーターを利用します。このような監視方法は、さまざまな状況のための技術を再プログラミングの選択および最適化を容易にします。例えば、CDy1は再プログラミング変調器4をスクリーニングするために、初期のiPS細胞用の蛍光プローブとして使用されています。異なる再プログラミング実験を観察し、比較する能力はまた、プロセス自体のより良い理解を得るために重要です。例えば、現在、いくつかの体細胞タイプは他の5よりも再プログラムが容易であることが知られており、細胞を6-8再プログラミングの間の中間状態を通過すること。残念ながら、再プログラミングプロセスの基礎となるメカニズムはまだ完全には理解されておらず、その結果、再プログラミングの方法との間の正確な違いはまた、dをされずに残っていますefined。このように、監視のための方法、評価、および再プログラミングイベントを比較するには、幹細胞分野のために重要であり続けます。 このプロトコールに記載された方法は、監視を可能にし、再プログラミングプロセスを評価し、これらの技術は、再プログラミング試薬の異なるセットを比較するために使用することができる方法を示します。第1のアプローチは、フローサイトメトリーを含む正および負の多能性幹細胞（PSC）のマーカーに対する抗体の組合せを使用して分析します。第二のアプローチカップルリアルタイムイメージング及び合計コンフルエンス（細胞によって覆われたパーセント面積）を測定し、マーカ信号の合流（蛍光シグナルによって覆わパーセント面積）。

<table><tbody><tr><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAXサプリメント、ピルビン酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、胚性幹細胞認定、米国原産</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>マウス(ICR)不活化胚性線維芽細胞</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>付着因子タンパク質 (1x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、IV型、粉末</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x)、フェノールレッドなし&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウムなし&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 ミディアム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-ベーシック (AA 1-155) 組換えヒトタンパク質</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイエン</td>ティフィック PHG0264 <td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>ウシアルブミンフラクションV(7.5%溶液)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(1 m)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/ml)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution, Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS仙台リプログラミングキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS2.0仙台リプログラミングキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自動セルカウンター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>カウンテスセルカウンティングチャンバースライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC ヒト包皮線維芽細胞、新生児</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 成人ヒト皮膚線維芽細胞</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG 細胞 バリアント hESC hOct4-GFP レポーター細胞</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>エッセンバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 抗体、Alexa Fluor 647 コンジュゲート (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 抗体、Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 抗体 (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 抗体 (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 ラット抗ヒト/マウスモノクローナル抗体(クローンIM7)、PE-Cy5コンジュゲート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 ライブセルイメージング用コンジュゲートキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 ラット抗ヒト/マウスモノクローナル抗体(クローンIM7)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>RM-5700(販売終了)</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>&nbsp;A-11029</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 594標識</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>&nbsp;A-11007</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ生塩</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 コンジュゲートキット ライブセルイメージング用</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 マウス抗ヒト mAb (クローン SN3), FITC コンジュゲート</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>β-2 Microglobulin Antibody, FITC コンジュゲート (B2M-01)</td><td>サーモフィッシャーScientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E 抗体 (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1 顕微鏡&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo データ解析ソフトウェア</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Use Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ セルソーター (488/561 nm)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Cell Strainer Cap Corning</td><td></td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 Flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-well dish</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 ローリングインキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>ノンスティック、RNaseフリー マイクロチューブ、1.5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer サンプルミキサー</td><td></td><td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

体細胞の再プログラミングの反応速度測定とリアルタイムの可視化

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

体細胞のリプログラミングは、多様な遺伝的背景と疾患の表現型から成体細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に変換することを可能にしました。最近の進歩により、リプログラミング因子の導入のためのより効率的で安全な方法が特定されました。ただし、再プログラミングの進行状況を監視および追跡するツールはほとんどありません。現在のリプログラミングのモニタリング方法は、形態の定性検査や幹細胞特異的色素や抗体による染色に依存しています。iPS細胞の作製進行を解剖するツールは、さまざまな細胞源からさまざまな条件下でのプロセスをよりよく理解するのに役立ちます。
この研究は、フローサイトメトリーを使用したリプログラミング進行の速度論的測定と、イメージングによるリアルタイムモニタリングのための主要なアプローチを提示します。リプログラミングの動力学を測定するために、陽性および陰性の多能性幹細胞マーカーに対する抗体を使用して、離散的な時点でフロー分析を行いました。リアルタイムの可視化とフロー解析の組み合わせにより、さまざまな段階でのリプログラミングの定量的研究が可能になり、さまざまなシステムやメソッドをより正確に比較できます。リアルタイムの画像ベースの分析は、フィーダーフリー培地システムで再プログラムされる線維芽細胞の連続モニタリングに使用されました。コロニー形成の動態は、生アルカリホスファターゼ色素またはSSEA4またはTRA-1-60に対する抗体で染色した後の位相差または蛍光チャネルのコンフルエンスに基づいて測定されました。その結果、コンフルエンスの測定は、リプログラミングの進行を監視するための半定量的な指標を提供することが示されました。

フローサイトメトリーを使用したリプログラミング速度論を監視 SSEA4はPSCマーカー6,10であるが、CD44は、線維芽細胞のマーカーです。この発現パターンから予想されるように、BJ線維芽細胞のフローサイトメトリーSSEA4を示している-非染色サンプルと組み合わせて象限ゲートの作成 ​​を容易にCD44 +集団 。 SSEA4はゆっくりと表現している間にセンダイウイルスのDF1線維芽細胞の再プログラミング時には、CD44が徐々に失われます。 CD44 +細胞および7日目（ 図1）で、より明確なになるSSEA4 + CD44 +細胞の小集団-仙台ウイルスによる形質導入後3日目では、SSEA4の大集団が存在します。状態- 13...

この研究で提示されたプロトコルは、フローサイトメトリー分析を使用して、正および負の多能性幹細胞マーカーの動的測定によって再プログラミングの進行をリアルタイムでモニタリングするための方法を記載しています。プロトコルは、IPSCの生成時形態、およびマーカーまたはレポーター発現のイメージングに基づく評価を含みます。

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

これらの手順の全体的な目的は、体細胞が人工多能性幹細胞（iPSC）へとリプログラミングされる過程を可視化し、追跡することです。この手法は、使用する体細胞の種類、適用するリプログラミング技術、および併用するマトリックスと培地の組み合わせによって、リプログラミングの速度論（キネティクス）や効率がどのように変化するかといった、iPSC分野における重要な疑問を解決するために利用できます。本手法の主な利点は、細胞表面マーカーを利用して体細胞からiPSCへの移行を観察できるため、リプログラミングイベントをリアルタイムでモニタリングできる点にあります。導入後7日目に、各ウェルの線維芽細胞を2 mLのDPBSで洗浄し、0.5 mLの37 °C 0.5% EDTAを各ウェルに添加して、37 °Cで3〜5分間インキュベートします。細胞が丸くなったら、各ウェルに2 mLの37 °C線維芽細胞用培地を加えて反応を停止させ、培地をウェル底面にそっとピペッティングして細胞を剥離させます。各ウェルの線維芽細胞を個別の15 mLコニカルチューブに移し、遠心分離により回収します。ペレットを2 mLの新鮮な37 °Cの線維芽細胞用培地で再懸濁し、各培養条件の細胞数をカウントします。次に、1 × 10⁵個の細胞を、あらかじめ準備した6ウェル組織培養プレートのフィーダー不要のコンディショニング済みウェルに播種し、導入された細胞を細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、各ウェルの培地を細胞アプリケーションに適した培地に交換します。次にプレートをイメージング装置にセットし、今後14日間にわたり、各ウェルの全視野における位相差像および蛍光像を6〜8時間ごとに連続してキャプチャするようにソフトウェアを設定します。リプログラミング実験の終了後、各ウェルを37 °CのDMEM/F12培地 2 mLで1回洗浄します。洗浄液を廃棄し、新鮮なDMEM/F12培地で調製した適切な一次抗体を1ウェルあたり1 mL加え、インキュベーター内にて37 °Cで45分間細胞をラベルします。インキュベーション終了後、細胞を37 °CのDMEM/F12培地で2回洗浄します。その後、洗浄液を除去し、37 °CのDMEM/F12培地に溶解した適切な二次抗体1 mLを用いて、37 °Cで30分間細胞をラベルします。インキュベーション終了後、細胞をDMEM/F12培地でさらに2回洗浄します。次に、各ウェルの洗浄液を2 mLの新しい37 °CのDMEM/F12培地と交換します。ディッシュをイメージャーにセットし、イメージングソフトウェアを起動します。イメージングシステムのソフトウェアでスキャンを設定するには、まず使用するトレイの位置を選択し、スキャンするディッシュの種類を選択します。次に、Whole Well Imagingを選択し、スキャンしたいウェルのパターンと、目的の表面マーカーをリアルタイムで同定するために適切な蛍光チャンネルを選択します。その後、スキャンする実験にラベルを付け、毎日スキャンするサンプルのタイムポイントと間隔を設定します。スキャン済みの実験セットを解析するには、目的の実験を選択し、Launch New Analysis Jobを選択してください。次に、イメージングに使用したチャネルに応じて、分析の種類に適切な処理定義（例：PSC Phase Colony Count）を選択します。分析ジョブに名前を付け、分析対象とする時間範囲とウェルを選択してください。その後、解析ジョブを開始します。個々のウェルから目的のリプログラミング時点を測定するには、対象のウェルを2 mLのDPBSで1回洗浄します。次に、洗浄液を37 °Cに予熱した0.5% trypsin-EDTA溶液1 mLに置換します。37 °Cで5分間後、ウェルの底に向けてトリプシンを吹き付け、細胞を単一細胞懸濁液に解離させ、15 mLコニカルチューブに回収します。3 mLのDPBSを用いて、ウェルに残っている細胞を洗浄し、15 mLチューブに回収してください。さらに10 mLのDPBSを細胞に加え、遠心分離機で遠心分離します。細胞数を計測するため、ペレットを1 mLのDMEM/F12培地で再懸濁します。次に、細胞懸濁液を1 × 10⁶ cells/mLの濃度の1/10に希釈し、適切なサンプル数に合わせて1本あたり1 mLずつチューブに分注します。続いて、1 mLのDMEM/F12培地中で、目的の一次抗体を用いて細胞を室温で30〜45分間、混合しながら標識します。インキュベーション終了後、37 °CのDMEM/F12培地で細胞を2回洗浄します。ペレットを1 mLのDPBSで再懸濁し、サンプルを個別のFACSチューブに移します。リプログラミングしたプレートのフローサイトメトリープロファイルを測定します。次に、FCSファイルをコンピューターに転送し、適切な解析ソフトウェアにインポートします。最初のコントロールファイルを前方散乱光（FSC）対側散乱光（SSC）プロットで開き、y軸を対数スケールに設定します。その後、生存細胞集団を囲むポリゴナルゲートを作成します。次に、生存細胞を用いてサイドスキャッター（SSC-A）対サイドスキャッター（SSC-H）のプロットを作成し、ダブレットを除去するために矩形ゲートを設定します。その後、これらのゲートを用いて、適切な蛍光チャネルで実験サンプルのファイルを解析し、各クアドラントにおける目的の細胞集団を特定します。Sendaiリプログラミングウイルスを用いてBJ線維芽細胞をリプログラミングすると、DF1線維芽細胞をリプログラミングした場合とは異なる速度でSSEA4+CD44-細胞が生成されます。これは、多能性幹細胞様のSSEA4+CD44-細胞の割合を早期に比較することで、リプログラミングの進行状況を追跡できることを示しています。フローサイトメトリーの時間経過解析において、CD24-CD44+およびEpCAM陰性のCD44+線維芽細胞はダブルネガティブ集団を形成し、その後それぞれCD24+CD44-およびEpCAM陽性のCD44-多能性幹細胞様細胞へと移行して、リプログラミングの進行過程をさらに明らかにします。再播種後のリプログラミング培養液のリアルタイムイメージングでは、コンフルエンスの対数的な増加に対応してコロニーが徐々に形成され、リプログラミング完了時に最終的な多能性陽性マーカーおよび線維芽細胞陰性マーカーの発現が示されます。さらに、レポーター遺伝子を用いることで、位相差顕微鏡下でコンフルエンスの測定が可能となり、全コンフルエンスと比較してGFPコンフルエンスの増加がより緩やかであることが観察されました。実際に、この代表的な実験において、19日目のGFPコンフルエンスは、完全なリプログラミングに対応する全コンフルエンスの半分以下でした。この手法を習得すれば、リプログラミング現象に関する情報の解明や、ヒト線維芽細胞のリプログラミングにおけるキネティクスの追跡に利用できる可能性があります。また、本手法は、異なる出発点の体細胞組織、使用するリプログラミング技術、および培地・マトリックスの組み合わせを検討し、リプログラミング現象を解明するためにも活用できると考えられます。このビデオを視聴することで、リアルタイムモニタリングと細胞表面マーカーの発現を利用して、ヒト線維芽細胞からiPSCへのリプログラミングを追跡する方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

FIMは、Cなどの小さな移動物体を追跡するために設計された新規、費用効果的なイメージングシステムである虫、プラナリアやショウジョウバエの幼虫。添付FIMTrackプログラムが高速で効率的なデータ分析を提供するように設計されている。一緒に、これらのツールは、行動特性の高スループット分析を可能にする。...

FIMイメージングとFIMtrack：高スループットとコスト効果的な歩行分析を可能に二つの新しいツール

経頭蓋磁気刺激、筋電図、および3Dモーションキャプチャは、人間の神経筋機能を調査するために一般的に使用される非侵襲的技術です。このホワイトペーパーでは、これら3つのツールすべてによって生成されたデータを同期的にサンプリングするプロトコルと、仮想現実刺激のプレゼンテーションとフィードバックの独自の追加について説明します。...

経頭蓋磁気刺激、電、モーションキャプチャ、およびバーチャルリアリティを用いたヒトモータ制御研究のための多機能のセットアップ

ソフトウェア ベースの後処理に続いてタイムラプス ビデオ顕微鏡による神経の人口を監視するための堅牢なプロトコルを説明します。このメソッドは、ライブ...

ライブ イメージング モニター細胞生物学および複数の神経集団の血統で、進行を追跡 1 つのセルに続いて

小説を提案する行動を組み合わせるし、ニューロ イメージング...

幻肢痛に対する鏡治療に関連付けられている関連する神経基盤の特性のため、MRI でリアルタイム映像投影

タンパク質キナーゼAの活動を可視化する手順を提示し、マウスの頭部固定、振る舞いをする。改良されたA-キナーゼ活性レポーターtAKARαは皮質ニューロンで発現され、頭蓋の窓を通してイメージングのためにアクセス可能にされる。2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡は、強制移動中の生体内でのPKA活性を可視化するために使用されます。...

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

私たちは、密接なループで人体と心臓の信号をストリーミング、パラメータ化、分析、および変更する共適応インターフェースを構築するためのプロトコルと分析方法を提示します。このセットアップは、外部感覚入力を持つ人の末梢および中枢神経系から導き出された信号をインターフェースし、生物物理学的変化を追跡するのに役立ちます。...

クローズループインタフェースを用いた再パラメータ化周辺信号のリアルタイムプロキシ制御

本稿は、収縮力やカルシウム処理分析を含む機能の機能アッセイにおいて、3Dヒト骨格筋微小組織および低侵襲下流部のアレイを生成するための詳細なプロトコルを記述する。...

ヒト骨格筋微小組織における骨格筋の健康の機能指標の評価

光学的透明度は、ゼブラフィッシュの細胞生物学的および生理学的研究にとって大きな利点です。骨格筋および隣接組織の成長が全身の成長とどのように統合されるかについての新しい洞察を可能にする、個々の動物の細胞増殖を測定するための堅牢な方法が説明されています。...

電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

ここでは、光学系プラットフォームを用いてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において収縮性およびカルシウム測定を行う確立された方法について説明する。このプラットフォームにより、研究者は突然変異の影響とさまざまな刺激に対する応答を迅速かつ再現性のある方法で研究できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞におけるカルシウムおよび収縮性パラメータのリアルタイム測定

ここでは、神経幹細胞および/またはそれらに隣接する上衣細胞の長期的な遺伝子改変のためのレンチウイルス粒子の使用に基づく手順を、成体の心室-心室下神経原性ニッチにおける長期的な遺伝子組み換えのために説明すると、神経幹細胞に対する細胞の自律的および非自律的な、ニッチ依存性の影響を別々に分析することができます。...

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

学ぼう、体細胞の再プログラミングをリアルタイムで可視化する方法。フローサイトメトリーと細胞表面マーカーを用いて、iPSC生成の動態を追跡し、再プログラミング効率を評価する技術を解説します。

体細胞の再プログラミングの反応速度測定とリアルタイムの可視化

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