RNA結合タンパク質の検出によって、インビトロ RNAプルダウン
July 22nd, 2016
RNAプルダウンプロトコルは、RNA結合タンパク質（RBPs）および非コードだけでなく、コーディングRNA間の相互作用の検出のためにここに最適化されています。アンドロゲン受容体（AR）からのRNA断片は、一次褐色脂肪細胞のlystateから、そのRBPを取得する方法を示すために例として使用しました。
この実験の全体的な目標は、褐色脂肪組織からRNA転写産物のRNA結合タンパク質を回収することです。この方法は、ロングライフコーディングRNAや関連するRNAタンパク質の制御メカニズムは何かなど、この分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この戦術の主な利点は、簡単に実行できることです。
この手順を実証するために用いたRNAは、抗原受容体3-Prime非翻訳領域の断片であり、以下、AR 3-Prime UTRと呼ぶ。まず、T7 AR オリゴと psiCHECK-2 プラスミド由来のホタルルシフェラーゼ DNA の部分配列を増幅します。使用するプライマーとパラメータについては、付属のドキュメントで詳しく説明しています。
増幅後、PCR産物をテンプレートとして使用し、製造元の指示に従って、in vitro転写キットを使用してビオチン化RNAを合成します。次に、混合物を摂氏37度で4時間インキュベートします。in vitro転写後、1マイクロリットルのDnaseを反応に加え、摂氏37度で15分間インキュベートしてテンプレートDNAを分解します。
次に、水で総容量を最大60マイクロリットルにします。ビオチン化RNAを精製カラムに適用して、塩と未取り込まれたヌクレオチドを除去します。次に、RNA濃度を測定した後、その後のプルダウンアッセイのためにRNaseを摂氏マイナス80度で保存します。
アッセイ当日は、凍結したビオチン化RNAを氷上で解凍します。次に、目的のRNAが適切な二次構造を持つことを確認するために、50マイクロリットルを摂氏90度で2分間加熱します。氷の上で2分間冷やします。
次に、50マイクロリットルの2X RNA構造バッファーを添加し、RNAを室温で30分間折り畳みます。次に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを元のバイアルに短時間ボルテックスして再懸濁します。次に、再懸濁したビーズ150マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移します。
チューブを磁気スタンドに1分間置き、磁気ビーズと上清を分離します。ピペットを使用して、上清を取り除き、廃棄します。ビーズペレットを保管します。
ビーズペレットをメーカー推奨の1X結合洗浄緩衝液の1ミリリットルに再懸濁してビーズを一度洗浄し、その後、チューブを室温で5分間回転子に置きます。緩衝液Aと緩衝液Bで2回洗浄します。インキュベーション後、上清を捨て、ビーズペレットを保管します。
次に、ビーズペレットを300マイクロリットルの2X洗浄結合緩衝液に再懸濁します。ビーズを3本の1.5ミリリットルチューブに均等に分割し、チューブあたり100マイクロリットルのビーズを使用します。100マイクロリットルのRNaseフリー水、100マイクロリットルのビオチン化ホタルルシフェラーゼRNA、100マイクロリットルのビオチン化AR 3-Prime UTR RNAを加えます。
各ビーズ混合物を室温で1時間、回転させてインキュベートします。次に、チューブを磁石に1分間置きます。上清を取り除き、廃棄します。
ビーズペレットを保管してください。次に、ビーズを2回洗浄し、毎回ビーズペレットを400マイクロリットルの1X洗浄結合緩衝液で再懸濁し、室温で5分間回転器に置きます。チューブを磁石に1分間置きます。
次に、すべての上清を取り除いて廃棄します。各ビーズペレットを50マイクロリットルの核分離バッファーに再懸濁します。プロトコルの次の部分に備えて、すべてのバッファーとダウンスガラスホモジナイザーが氷上で冷却されていることを確認してください。
細胞ライセートの調製は氷上で進める必要があります。実施する各 RNA プルダウンアッセイについて、3 週齢の C57 Black Six 野生型マウスの分化した前駆脂肪細胞の 15 cm ディッシュを 1 つ調製します。4〜5日後、細胞を採取するために、10〜15ミリリットルのPBFを追加し、セルスクレーパーを使用して皿から細胞を取り除きます。
50ミリリットルのチューブに移し、Gの200倍を常温で5分間遠心分離してペレット化します。スピン後、1ミリリットルのピペットを使用して上清を吸引し、廃棄します。次に、細胞ペレットを2ミリリットルの低張緩衝液に再懸濁し、細胞を氷上で15分間インキュベートします。
細胞を15ミリリットルのダウンスガラスホモジナイザーに移し、氷上で細胞を20回のストロークで機械的にせん断します。細胞核を3300倍Gで4°Cで15分間遠心分離することにより、細胞核をペレット化します。スピン後、上清を1.5ミリリットルのチューブに移し、後で使用するためにペレットを氷上に保ちます。
上清に3モルの塩化カリウムを加えて、最終濃度150ミリモルを得ます。Gの20, 000倍で、摂氏4度で15分間回転します。遠心分離後、上部に脂質層ができます。
1ミリリットルのピペットを使用して、慎重に取り外します。次に、シトプラム細胞溶解物上清を回収します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、核ペレットを1ミリリットルの核分離バッファーに再懸濁し、15ミリリットルのダウンスガラスホモジナイザーに移します。
氷上で原子核を100回のストロークで機械的にせん断します。核デブリを20, 000倍Gで遠心分離し、摂氏4度で15分間ペレット化します。上清を核細胞溶解物として収集します。
これらは、以前に収集した細胞質溶解物と組み合わせることも、後のアプリケーションのために分離して保管することもできます。ここでは、サンプルを1対1の比率で組み合わせます。RNase阻害剤を未分画細胞ライセートに添加して、最終濃度0.5単位/マイクロリットルを得ます。
次に、ウェスタンブロッティングの入力コントロールとして、100マイクロリットルの細胞溶解物を氷上に置いておきます。細胞ライセートを3等分に分割し、各1.5ミリリットルチューブに1ミリリットルの細胞ライセートを入れ、ブランクホタルルシフェラーゼRNA標識ビーズおよびAR 3-Prime UTR標識ビーズとそれぞれ4°Cで回転しながら3時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを磁石に1分間置きます。
1ミリリットルのピペットを使用して上清を採取し、次にRNAを単離し、添付の文書に記載されているようにRNAの無傷性を評価します。ビーズペレットを氷の上に置きます。磁気ビーズを6回洗います。
毎回、ビーズペレットを40ユニットのRNase阻害剤と0.25%のイゲパールを含む1ミリリットルの核分離バッファーに再懸濁します。チューブを室温で2分間回転させます。チューブを磁気スタンドに入れて、磁気ビーズと上清を分離します。
1分後、上清を吸引して捨て、ビーズペレットを氷の上に置きます。ウェスタンブロッティング用のビーズからRNAタンパク質複合体を溶出するには、まず、各ビーズペレットを75マイクロリットルの核分離バッファーに再懸濁します。次に、25マイクロリットルの4Xウェスタンブロットローディングバッファーを添加します。
SDSを含み、総容量100マイクロリットルを得る。最後に、この100マイクロリットルの溶液でビーズを摂氏95度で5分間煮ます。添付文書に記載されているように、RBPの検証のためにウェスタンブロッティングを実施します。
この実験では、抗原受容体RNAフラグメントを餌として、その結合タンパク質であるHuRを捕捉しました。HuRタンパク質とは無関係のホタルルシフェラーゼRNAベイトと、未抱合ブランクストレプトアビジンビーズのアリコートの両方がネガティブコントロールとして機能しました。RNAタンパク質の相互作用は、核または細胞質のいずれかで発生する可能性があり、このプルダウンプロトコルは、総または分画された核細胞または細胞質細胞のライセートに適用できます。
ウェスタンブロッティングによる解析では、モノクローナル抗体を用いて、未分画細胞ライセートまたはインプット中にHuRタンパク質が示されました。抗原受容体RNAのとらえどころ画分も陽性の結果をもたらし、RNAプルダウンアッセイ用の抗原受容体RNA標識ビーズを使用して、脂肪細胞溶解物中にHuRタンパク質が存在することを示しました。ホタルのルシフェラーゼRNA溶出画分とブランクビーズサンプルの両方で陰性の結果が得られ、このアプローチでは非特異的な相互作用が検出されなかったことが示されました。
以上のことから、これらの結果は、抗原受容体RNAフラグメントとHuRタンパク質との間の相互作用が特異的であったことを示唆しています。このビデオを見れば、褐色脂肪組織からRNA転写産物からRNA結合タンパク質を回収する方法を十分に理解できるはずです。一度マスターすれば、適切に実行すれば、24時間でこれを行うことができます。
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概要
この記事では、RNA結合タンパク質（RBP）と非コーディングおよびコーディングRNAの相互作用を検出するための最適化されたRNAプルダウンプロトコルを紹介します。この方法は、一次的な褐色脂肪細胞の溶解物からそのRBPを回収するために、アンドロゲン受容体（AR）のフラグメントを使用した例を示しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 分子生物学
背景
- RNA結合タンパク質は、RNA機能の調節において重要な役割を果たします。
- RBP相互作用を理解することで、様々な生物学的プロセスにおける調節メカニズムを解明することができます。
- この研究は、代謝調節に重要な褐色脂肪組織に焦点を当てています。
- AR 3'UTRは、RBP相互作用の研究のためのモデルとして機能します。
研究の目的
- 特定のRNA転写物に関連するRNA結合タンパク質を回収すること。
- 長寿命コーディングRNAおよび関連RNAタンパク質の調節メカニズムを調査すること。
- RBP相互作用を研究するための簡単な方法を提供すること。
使用された方法
- T7 ARオリゴとホタルのルシフェラーゼDNAの部分的な配列の増幅。
- RNAフラグメントの実証のためのpsiCHECK-2プラスミドの使用。
- 詳細なパラメータとプライマーは付随文書に記載されています。
- RBPを分離するためのRNAプルダウン技術の適用。
主な結果
- 褐色脂肪細胞溶解物からのRBPの成功的な回収。
- AR 3'UTRを使用した方法の有効性の実証。
- RBPとRNA転写物の相互作用に関する洞察。
- 代謝調節の理解への潜在的な影響。
結論
- 最適化されたRNAプルダウンプロトコルは、RBP相互作用の研究に効果的です。
- この方法は、RNA調節メカニズムのさらなる研究を促進する可能性があります。
- 結果は、褐色脂肪組織における代謝プロセスの理解に貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
RNA-binding protein (RBP) interactions represent a critical regulatory layer in adipocyte biology, impacting gene expression and metabolic function. The optimized in vitro RNA pull-down protocol enables precise identification of RBP partners in lipid-rich adipocyte systems, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This capability enhances predictive confidence for portfolio decisions involving RNA-centric targets and pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RBP–RNA interactions to clarify regulatory mechanisms in adipocyte models.
- Supports functional target validation by confirming specific protein–RNA binding events.
- Facilitates mechanistic de-risking for RNA and RBP targets in metabolic research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated adipocyte lysates for downstream screening of RBP modulators.
- Standardizes pull-down and detection workflows for reproducible quantitative outputs.
- Enables reliable assessment of compound effects on RBP–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant adipocyte systems for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of RBP targets.
- Supports risk-adjusted advancement of RNA-targeted programs in metabolic disease portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This RNA pull-down protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in adipocyte models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of RBP–RNA regulatory mechanisms in adipose tissue.
- Screening: Provides assay-ready lysates and standardized workflows for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative western blot outputs for comparative analysis of binding specificity.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant adipocyte biology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to diverse RNA and RBP targets in metabolic research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RBP target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for RNA–protein interaction studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target engagement early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA and RBP targets in metabolic disease pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, adipocyte culture, and western blot analysis.
- Needs access to magnetic bead-based pull-down systems and quantitative detection infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility across experiments.
- Adaptable to both coding and noncoding RNA targets in various adipocyte models.
- High lipid content in adipocytes necessitates optimized lysate preparation and purification steps.
