Name: RNA結合タンパク質の検出によって、インビトロ RNAプルダウン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶRNAプルダウン法を用いて、褐色脂肪組織由来のRNA結合タンパク質を検出する方法です。AR 3-Prime UTRフラグメントを用いて、RBP相互作用のメカニズム解明に役立ちます。

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この作品は、シンガポールNRFの交わり（NRF-2011NRF-NRFF001-025）ならびにCBRG（NMRC / CBRGは/ 0070/2014）によって賄われていました。

注：この研究の文脈で目的のRNAは、AR 3&#39;UTRの断片です。 ビオチン標識RNAの調製<ol><li> RNAを得るために、市販のキットを用い、製造業者の指示11を以下のインビトロ転写に続いて、PCRによってT7-AR-オリゴを増幅します。 注：PCR用プライマーは、表4に記載されています：T7-AR-FおよびT7-AR-R。 </li><li>非特異的結合を制御するために、 インビトロ転写、続いpsiCHECK-2プラスミドからPCRによってホタルルシフェラーゼ（FL）、DNAの部分配列を増幅します。 注：PCR用プライマーは、表4に記載されています：hluc（+） - T7-プローブ-Fとhluc（+） -プローブ-R 表4 PCR増幅のための鋳型とプライマーの配列。。。 </li><li> 50μlのPCR反応のために、50 ngのDNAを（オリゴまたはプラスミド）を混ぜて、4μlのdNTPを（各個々のdNTP 2.5 mMの）、5μlの10×反応緩衝液、1μlの2.5 U /＆＃181;リットルのDNAポリメラーゼ、2μlの10μMのフォワードプライマー、2μlの10μMのリバースプライマー、およびヌクレアーゼフリー水。 <ol><li>以下のプログラムを使用して、サーマルサイクラーでのPCR増幅を実行します。 STEP1：2分間95℃での一回; STEP2：30秒（AR）または60秒（FL）のための30秒、72℃30秒間、95℃の35サイクル、55°C; STEP3：10分間72℃での一回。 </li></ol></li><li>製造元の説明書11以下のin vitro転写キットを用いてビオチン化RNAを合成します。この実験では、RNA合成のための鋳型としてPCR産物を使用します。 20μlのin vitro転写反応のために、200 ngのPCR増幅されたDNAは、各個々のNTPの2μlを、1μlの10mMのビオチンCTP、2μlの10×反応緩衝液、および2μlのT7 RNAポリメラーゼを混ぜます。 4時間37℃で混合物をインキュベートします。 </li><li> インビトロ転写に続いて、37＃で1μlの2 U /μlのDNaseで反応混合物を処理176; Cは、15分間鋳型DNAを分解する。最後に、その後の精製のために60μlの総体積にビオチン化RNAを希釈します。 </li><li>製造業者の説明書12以下の精製カラムを用いて、塩および取り込まれなかったヌクレオチドを除去するために、ビオチン化RNAを精製します。その後のプルダウンアッセイのために-80℃でRNA濃度とストアを測定します。 </li><li> 2分、2分間氷上で寒さのために90℃でRNA-タンパク質相互作用、熱50μlのビオチン化RNA（50 PM）への関心のRNAのための適切な二次構造を確保するために、その後、50μlの2倍のRNA構造のバッファ（ 表と供給3）30分13,14 RTで折りたたみRNAを可能にします。 </li></ol> RNA結合ビーズの調製注：磁気ビーズと上清を分離するための磁気スタンドを使用してください。 <ol><li>簡単なvorteによって、元のバイアル中のストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを再懸濁し製造者の指示に従って興。 1.5mlチューブにビーズを再懸濁し、150μlのを転送します。 1分間磁石上にチューブを置きます。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 注：RNAプルダウンアッセイでは、元のバイアルから再懸濁ビーズを分取、MSが続くアッセイのためにウェスタンブロッティングに続いて、アッセイのための50μlのビーズ、および200μlのビーズを使用します。 </li><li>再懸 ​​濁し、製造元の推奨1xのW＆Bの1mlでビーズペレットを（結合および洗浄）バッファー（ 表3）によって一度ビーズを洗浄し、ローテーターで、室温で5分間チューブを回転させることによって行いました。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li><li> 400μlの緩衝液A緩衝液Aでビーズペレットを再懸濁することにより、毎回、ビーズ上のRNaseを不活化二回ビーズを洗浄するには、0.1M NaOHおよび0.05 M NaClを（ 表3）を含むアルカリ性溶液です。ローテーターで、室温で2分間チューブを回転させます。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li> &lt;李&gt;は回転子に室温で2分間、チューブを回転させることで、その後再懸濁し、400μlの緩衝液Bでビーズペレットを（ 表3）、によって、二回ビーズを洗浄し、ビーズから毎回のNaOHを削除します。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li><li> 300μlの2倍のW＆B緩衝液で再懸濁ビーズペレットは、スプリットビーズ均等と3 1.5ミリリットルのチューブ（チューブあたり100μlのビーズ）に移します。 100μlのRNaseフリー水でビーズを含有するチューブを供給し、FLのRNAとそれぞれ、AR 3&#39;UTR RNAをビオチン化し、100μlのビオチン化を100μl。 </li><li>回転させながら室温で1時間各ビーズ混合物をインキュベートします。 1分間磁石上にチューブを入れます。すべての上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li><li> 400μlの1×W＆B緩衝液を用いて各ビーズペレットを再懸濁することにより、二回毎回ビーズを洗浄し、ローテーターで室温で5分間、チューブを回転させることによって行いました。 </li><li> 1分間磁石上にチューブを入れます。すべての上清を捨てます。再懸濁し、各ビーズPELLE50μlの核単離緩衝液（ 表3）でトン。 </li></ol> 3.前脂肪細胞の単離と脂肪生成誘導<ol><li>以前の刊行物5に記載したように、肩甲骨間の褐色脂肪パッド（3週齢C57BL6野生型マウス）からの前脂肪細胞を分析。 </li><li>成長し、in vitroで前脂肪細胞5を区別します 。細胞は4-5日分化の開始後に下流側のアプリケーションのための準備が整いました。 </li></ol>プライマリ脂肪細胞からの細胞溶解物の4準備注：細胞溶解物の準備のすべての手順を確認し、氷上で行われ、すべてのバッファを氷上で冷却されています。氷上でプレチルダウンスガラスホモジナイザー。 <ol><li>成長すると15cmの皿5（セクション3.2を参照）で前脂肪細胞を分化します。各皿には、1つのRNAプルダウンアッセイのための適切な細胞を提供します。分化の4日目または5日目に、細胞培養培地、および洗浄CEを破棄する1×PBSで一度LLS。 </li><li>収穫細胞に、細胞を10〜15 mlの1×PBSを追加し、室温で5分間、200×gでの遠心分離によって50mlチューブ中の細胞を収集するためにこすり、ペレット細胞。 1ミリリットルピペットを使用して、上清を捨てます。 </li><li> 2ml中に再懸濁細胞ペレットを低張緩衝液（ 表3）、そして氷上で15分間細胞をインキュベートします。転送15ミリリットルダウンスガラスホモジナイザーに細胞、および機械的に氷上で20ストロークでせん断セル。 </li><li> 4℃で15分間、3300×gでの遠心分離によってペレットは、細胞核。さらに使用するために氷上で核ペレットにしてください（セクション4.6を参照）。 1.5ミリリットルチューブに上清を移し、150mMのの最終濃度を得るために、上清に3MのKClを追加し、4℃で15分間20,000×gでスピン。 </li><li>遠心分離後、慎重に1ミリリットルピペットを用いて、トップlipidlayeron削除、および細胞質細胞溶解物として上清を収集します。 </li><li>核ペレットを再懸濁1ミリリットル核単離緩衝液中（4.4節を参照）。 Transfer核機械的に100ストロークで、氷上で15ミリリットルダウンスガラス1ミリリットルピペットを用いて、ホモジナイザー、およびせん断核へ。 4℃で15分間20,000×gで遠心分離することによって、核破片をペレット化し、そして核細胞溶解物として上清を収集します。 </li><li>核と細胞質の細胞溶解物を組み合わせ、または下流プルダウンアプリケーションのために、個別に各画分のいずれかを使用します。このデモ実験では、細胞溶解物のこれら2つの画分1の体積比で混合した：1。 </li><li> 0.5 U /μlの最終濃度を得るために、この未分画の細胞溶解物にRNase阻害剤を加えます。ウェスタンブロッティング15のための入力制御として、細胞溶解物の脇に100μLを設定します。 </li></ol> 5.結合およびRBPの溶出<ol><li>スプリットセル3つの等しいアリコートに溶解液（1.5mlチューブで1ミリリットルの細胞溶解物）、およびブランクでインキュベートは、FL RNA結合型およびAR 3&#39;UTR RNA結合ビーズは4℃で3時間、それぞれ、（2.8節を参照してください） C言語回転に。 </li><li> 1分間磁石上にチューブを入れます。 RNAの完全性を確認するために、上清からのRNAの単離に続いて1ミリリットルピペットを使用して、上清を収集します。製造業者の説明書（ 表2）は、以下の酸グアニジニウムチオシアネート-フェノール溶液を用いてRNAを単離します。リボソームRNAの28Sおよび18Sサブユニットを分析することによって、RNAの完全性を評価します。氷の上にビーズペレットを保管してください。 </li><li>ローテーターで、室温で2分間、チューブを回転させることにより、続いて40 UのRNase阻害剤と0.25％IGEPALを含む1ミリリットルの核単離緩衝液を用いて各ビーズペレットを再懸濁することにより磁気ビーズを6回、毎回洗浄します。磁気ビーズと上清を分離するための磁気スタンドを使用してください。すべての上清を捨てます。氷の上にビーズペレットを保管してください。 </li><li>ウェスタンブロッティングのためのビーズからRNA-タンパク質複合体を溶出するには、次の手順を使用します。まず、75μlの核単離緩衝液中の各ビーズペレットを再懸濁。その後、25μlの4倍ウェスタンブロットローディングBUFを追加FERは、（SDSを含む）を100μlの総容積を得ました。最後に、5分間、95℃で100μlの溶液中のビーズを沸騰。 注：使用は、MSのためのビーズからRNA-タンパク質複合体を溶出するための手順を以下に示します。 STEP1：100μlの溶出バッファー（ 表3）の各ビーズペレットを再懸濁。 STEP2：回転させながら室温で2-3時間、ビーズのサンプルをインキュベート。 STEP3：遠心分離機とタンパク質含有上清を回収。 STEP4：MSの提出前に20〜30μlにタンパク質溶液を濃縮します。 </li><li> 4℃で30秒間12,000×gで遠心分離ビーズサンプルの各100μlを、上清を集めます。ウエスタンブロット分析のためにアリコート15μlの上清（セクション6.1と6.2を参照してください）​​。プローブ希釈HuRのマウスモノクローナル抗体で得られた膜（1：1,000希釈）を、一晩。 </li></ol> RBPの検証6.ウェスタンブロッティング<ol><li>標準的な技術を用いてSDS-PAGEで区切りRBPs。 </li><li>私たちを実施船尾目的のRNAに関連したRBPsのためにプローブすることによって、標準的な技術を用いてブロッティング。 注：このデモ実験では、HuRのマウスモノクローナル抗体のHuRタンパク質の免疫検出のために使用しました。 </li><li> 、脱脂粉乳、1×TBS w / vの5％に：（千希釈1）希釈HuRの抗体と得られた膜をインキュベート 0.1％ トゥイーン- 4で20 一晩、穏やかに振盪しながらC°。 1×TBSTで膜を3回洗浄します。室温で1時間二次抗体（ヤギ抗マウスIgG-HRP）を用いて膜をインキュベートします。ウォッシュ膜。開発し、信号を記録します。 </li></ol>

<ol><li>Huot, M. É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li>
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<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li>
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<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されていません。

lncRNAsとRBPsが健康と病気に重要な役割を持っている、しかし、これらの分子の分子メカニズムはあまり理解されていません。 lncRNA分子と相互作用するタンパク質の同定は、調節機構の解明に向けた重要なステップです。 RNAプルダウンアッセイシステムによってRBPsの濃縮は、溶液内の細胞溶解物からのタンパク質は選択的にストレプトアビジン磁気ビーズに結合したビオチン化RNAベイトを用いて抽出することができるように、複雑な相互作用の捕捉に基づいています。このようなチャープ、CHARTとRAPのようないくつかの他の方法は、しかし、これらの方法は、RNAプルダウン技術の16,17,18よりも設定する手間がかかり、同じ目標を達成することができます。 RNAプルダウンの主な強みは、比較的単純なプロトコル及び実行が容易であることです。両方CHIRPとRAPは、RNA-タンパク質複合体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドのフルセットの設計を天然に存在する保存する架橋工程を伴う（90 nucleotides長いRAPで、および20ヌクレオチド長チャープで）ターゲット全体...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
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Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPsは、細胞内で二本鎖または一本鎖RNAに結合し、RNA-タンパク質複合体の形成に関与するタンパク質です。 RBPsは、mRNAと長い非コードRNA（lncRNAs）を含むRNA種の多様性を結合し、転写後のレベルで自分の影響力を発揮することができます。 RBPsとlncRNAsの両方が脂肪の発達と機能1,2,3における新規調節因子として浮上しています。細胞経路のRBP-とlncRNA媒介調節のメカニズムを理解するためには、RNAのタンパク質パートナーの完全なスペクトルを識別するために、時々、特定のRNA分子および1つまたはいくつかのRBPsの間の相互作用を検出することがしばしば必要であり、かつ転写産物。しかし、実験が原因脂肪細胞中の脂質の含有量が高いに挑戦することができます。ここで説明するRNAプルダウンプロトコルは、初代培養4,5の脂肪細胞溶解物から特定 ​​のRNAのタンパク質パートナーを取得するために使用することができます。 このプロトの根拠次のようにcolが要約されています。 RNAの餌は、DNAテンプレートから転写された試験管 、ビオチン標識したストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズ4に共役です 。 RNAの餌は、その後、磁気スタンド上にプルダウンされているRNA-タンパク質複合体の形成を可能にするために、細胞溶解物と共にインキュベートします。具体的には、RNAプルダウンプロトコルは、以下に記載のHuRタンパク質、初代培養のtheadipocytelysateから、mRNAを6,7の3&#39;UTRに結合された普遍的に発現RBPを取得するために餌としてAR 3&#39;UTRからRNA断片を使用します。このアッセイの結合特異性を試験するために、非関連RNAasだけでなく、空白のストレプトアビジンビーズを対照として含まれています。このプロトコルは、特定のRBPのキャプチャを確認したり、撮影しRBPs、それぞれ8の完全なレパートリーを識別するために、ウエスタンブロッティングまたは質量分析法（MS）と互換性があります。 いくつかの技術は、RNA-タンパク質相互作用を研究するために利用可能です秒。所与RBPによって拘束RNAを明らかにするために、RIP（RNA免疫沈降）及びCLIP（UV架橋及び免疫沈降）を適用することができます。対照的に、与えられたRNA、RNAプルダウン、チャープ（RNA精製によってクロマチン分離）、グラフ（RNA標的の捕獲ハイブリダイゼーション分析）のタンパク質パートナーを識別し、RAP（RNAアンチセンス精製）を適用することができます。それ以降のものと比較して、RNAプルダウン技術が設定する労力がかかります。 in vitroおよびin vivoでタンパク質を捕捉するために使用することができます。技術的に困難なそのin vitro対応物よりもRNAプルダウンのインビボでのアプローチは、細胞内で架橋することによりRNA-タンパク質相互作用を維持し、細胞からの目的のアプタマータグ付きRNAを捕捉し、その後、結合したRBPsを検出します。 RNAプルダウンは低豊富RBPsを濃縮するために使用することができ、細胞調節9,10を制御することで、多様な機能的役割を有するRNA-タンパク質複合体を単離し、同定するために</s&gt;アップ。

<table><tbody><tr><td>この研究で使用した主な材料.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&nbsp;アンビオン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-14-CTP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAwayスピンカラム&nbsp;</td><td>アンビオン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダイナビーズ M-280 ストレプトアビジン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) マウスモノクローナル抗体 (sc-5261)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG-HRP(sc-2005)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer 生理食塩水 (1倍;PBS)</td><td>&nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase阻害剤&nbsp;</td><td>バイオリン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>アジレント・テクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ・トライシュア</td><td>&nbsp;バイオライン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>この研究で使用した主な機器.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R遠心分離機&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R 遠心分離機&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 サーマルサイクラー&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO ローテーター Multi Bio RS-24&nbsp;</td><td>BOECO、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>タンパク質ゲル電気泳動およびブロッティング装置&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna結合タンパク質の検出によって、<em&gt;インビトロ</em脂肪細胞培養における&gt; rnaプルダウン

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA結合タンパク質（RBPs）は、脂肪の発達と機能における規制層として浮上しています。 RBPsは、標的mRNAの安定性および翻訳効率に影響を与えることにより、転写後レベルでの遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす。 RNAプルダウン技術が広く機構RBP​​s &#39;ならびに長い非コードRNA」（lncRNAs）機能の根底に解明する必要があるRNA-タンパク質相互作用を研究するために使用されています。しかし、脂肪細胞における高脂質存在量は、この実験を行う際の技術的な課題を提起します。ここで詳細なRNAプルダウンプロトコールは、一次脂肪細胞の培養のために最適化されています。脂肪細胞lystateからアデニル酸ウリジル酸が豊富な、そのRBPパートナーを取得する方法を示すために例として使用elementwas、HuRのタンパク質を含むアンドロゲン受容体の（AR）3 &#39;非翻訳領域（3&#39;UTR）からのRNA断片。ここで説明する方法は、間の相互作用を検出するために適用することができますRBPsおよび非コードRNA、ならびに間RBPsとコーディングRNA。

このデモ実験において、AR RNA断片は、結合タンパク質HuRのを捕捉するために餌として使用しました。両方のHuRタンパク質に非関連であるFLのRNAの餌、およびコンジュゲートされていない空白のストレプトアビジンビーズのアリコートを陰性対照としました。 RNA-タンパク質相互作用は、核または細胞質のいずれかで発生することができ、このプルダウンプロトコールは、全または分画（核または細胞質）細胞溶解物のいずれにも適用することができます。ウェスタンブロッティングによるタンパク質の分析は、15μlの未分画の細胞溶解物のサンプルは、（セクション4.8を参照）、無ビーズ入力制御としてのHuRタンパク質を用いてマウス初代培養の脂肪細胞溶解物中で検出されたことを示す、陽性の結果を与えたことを示しモノクローナル抗体。 ARのRNAの溶出画分は、HuRのタンパク質がRNAプルダウンアッセイのためにAR RNA結合ビーズを用いて、脂肪細胞の溶解物中で検出されたことを示す、陽性の結果が得られました。 FL RNA溶出画分とbの両方痩せ細ったビーズのサンプルは、FL RNA断片とのHuRタンパク質...

RNAプルダウンプロトコルは、RNA結合タンパク質（RBPs）および非コードだけでなく、コーディングRNA間の相互作用の検出のためにここに最適化されています。アンドロゲン受容体（AR）からのRNA断片は、一次褐色脂肪細胞のlystateから、そのRBPを取得する方法を示すために例として使用しました。

RNA結合タンパク質の検出によって、<em&gt;インビトロ</em脂肪細胞培養における&gt; RNAプルダウン

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

本実験の全体的な目的は、褐色脂肪組織におけるRNA転写物のRNA結合タンパク質を回収することである。この手法は、長寿命コーディングRNAの調節機構および関連するRNAタンパク質は何かといった、この分野における重要な疑問を解明するのに役立つ。本手法の主な利点は、実施が容易であることである。本手順のデモンストレーションに使用するRNAは、抗原受容体3'非翻訳領域（以下、AR 3-Prime UTRと表記）の断片です。まず、T7 ARオリゴおよびpsiCHECK-2プラスミドからのホタルルシフェラーゼDNAの部分配列を増幅させます。使用したプライマーおよびパラメータの詳細については、付属のドキュメントに記載されています。増幅後、PCR産物を鋳型として、メーカーの指示に従いin vitro転写キットを用いてビオチン化RNAを合成します。その後、混合液を37 °Cで4時間インキュベートします。in vitro転写後、反応液に1 µLのDNaseを加え、37 °Cで15分間インキュベートして鋳型DNAを分解させます。次に、水を加えて全量を60 µLにします。ビオチン化RNAを精製カラムに適用し、塩および未反応のヌクレオチドを除去します。その後、RNA濃度を測定し、後のプルダウンアッセイに使用するため、RNaseを-80 °Cで保存します。アッセイ当日、凍結保存したビオチン化RNAを氷上で融解します。次に、目的のRNAが適切な二次構造をとるようにするため、そのうち50 µLを90 °Cで2分間加熱します。その後、氷上で2分間冷却します。次に、2X RNA構造バッファーを50 µL加え、室温で30分間静置してRNAをフォールディングさせます。続いて、ストレプトアビジンコート磁気ビーズを軽くボルテックスして、元のバイアル内で再懸濁します。その後、再懸濁したビーズ150 µLを1.5 mLチューブに移します。チューブを磁気スタンドに1分間静置し、磁気ビーズと上清を分離させます。ピペットを使用して上清を除去し、廃棄してください。ビーズペレットはそのまま保持します。ビーズペレットを製造者が推奨する1X結合・洗浄バッファー1 mLに再懸濁して1回洗浄し、その後、チューブを回転ミキサーに設置して室温で5分間回転させます。バッファーAおよびバッファーBで2回洗浄します。インキュベーション後、上清を除去し、ビーズペレットを回収します。次に、ビーズペレットを300 µLの2X洗浄および結合バッファーで再懸濁します。ビーズを3本の1.5 mLチューブに等量ずつ（1本あたり100 µL）分配します。そこに、100 µLのRNaseフリー水、100 µLのビオチン化ホタルルシフェラーゼRNA、および100 µLのビオチン化AR 3-Prime UTR RNAをそれぞれ加えます。各ビーズ混合物を室温で1時間、回転させてインキュベートします。その後、チューブをマグネットの上に1分間置きます。上清を除去し、廃棄します。ビーズペレットを回収します。次に、ビーズを2回洗浄します。毎回、ビーズペレットを400 µLの1X washing and binding bufferで再懸濁し、室温で5分間ローテーターで回転させます。その後、チューブをマグネットに1分間置きます。次に、上清をすべて取り除いて廃棄します。各ビーズペレットを50 µLの核分離バッファーで再懸濁します。プロトコルの次のステップに備え、すべてのバッファーおよびダウンス型ガラスホモジナイザーを氷上で冷却しておいてください。細胞溶解液の調製は氷上で行ってください。各RNAプルダウンアッセイにつき、3週齢のC57 Black Six野生型マウス由来の分化前脂肪細胞を15cmディッシュ1枚分用意します。4〜5日後、細胞を回収するために10〜15 mLのPBFを加え、セルスクレイパーを用いてディッシュから細胞を回収します。これらを50 mLチューブに移し、室温で200 ×gで5分間遠心分離してペレット化します。遠心後、1 mLピペットを使用して上清を吸引し、廃棄します。次に、細胞ペレットを2 mLの低張緩衝液に再懸濁し、氷上で15分間インキュベートします。細胞を15 mLのダウンス型ガラスホモジナイザーに移し、氷上で20回ストロークして機械的に破砕します。4°Cで3300 ×gで15分間遠心分離し、細胞核をペレット化します。遠心後、上清を1.5 mLチューブに移し、ペレットは後で使用するため氷上で保持します。上清に3 Mの塩化カリウムを加え、最終濃度が150 mMとなるようにします。4°Cで20,000 ×g、15分間遠心分離します。遠心分離後、上層に脂質層が形成されます。1 mL ピペットを使用して、慎重に除去します。次に、細胞質ライセートの上清を回収します。続いて、1 mL ピペットを用いて、核ペレットを 1 mL の核単離バッファーで再懸濁し、15 mL のダウンス型ガラスホモジナイザーに移します。氷上で核を100回ストロークして機械的に剪断します。4°Cで20,000 ×gで15分間遠心分離し、核のデブリをペレット化します。上清を核細胞ライセートとして回収します。これらは、先に回収した細胞質溶解液と混合するか、または後のアプリケーションのために分けて保存します。ここでは、サンプルを1:1の比率で混合します。分画していない細胞溶解液にRNase阻害剤を加え、最終濃度が0.5 units/µLになるようにします。次に、ウェスタンブロッティング用のインプットコントロールとして、細胞溶解液 100 µLを氷上に除けておきます。細胞溶解液を3等分し、1.5 mLチューブにそれぞれ 1 mLずつ分注し、ブランクのfirefly luciferase RNA結合ビーズおよびAR 3-Prime UTR結合ビーズと共に、4 °Cで3時間回転混和しながらインキュベートします。インキュベーション後、チューブをマグネットの上に1分間置きます。1 mLピペットを使用して上清を回収し、付属文書の記載に従ってRNAを単離し、RNAの完全性を評価します。ビーズペレットは氷上で保持してください。磁気ビーズを6回洗浄します。毎回、ビーズペレットを、40 unitsのRNase inhibitorと0.25% igepalを含む1mLの核分離バッファーで再懸濁します。チューブを室温で2分間回転させます。チューブをマグネットスタンドに設置し、磁気ビーズと上清を分離させます。1分後、上清を吸引して廃棄し、ビーズペレットを氷上に置きます。ウェスタンブロッティング用に、ビーズからRNAタンパク質複合体を溶出させるには、まず各ビーズペレットを75 µLの核分離バッファーで再懸濁します。次に、25 µLの4Xウェスタンブロット用ローディングバッファーを加えます。SDSを含む溶液を加え、全量を100 µLにします。最後に、この100 µLの溶液中でビーズを95 °Cで5分間加熱します。付属のドキュメントに従い、ウェスタンブロッティングを行い、RBPの検証を行ってください。本実験では、抗原受容体RNA断片をベイトとして用い、その結合タンパク質であるHuRを捕捉しました。HuRタンパク質とは無関係なホタルルシフェラーゼRNAベイト、および未結合のブランクストレプトアビジンビーズをそれぞれ陰性対照として使用しました。RNAとタンパク質の相互作用は核内または細胞質のいずれにおいても起こり得るため、このプルダウンプロトコールは、全細胞溶解液、あるいは分画した核または細胞質の細胞溶解液のいずれにも適用可能です。ウェスタンブロッティングによる解析の結果、モノクローナル抗体を用いることで、分画前の細胞溶解液（インプット）中にHuRタンパク質が認められました。また、抗原受容体RNA溶出分画においても陽性結果が得られ、RNAプルダウンアッセイに使用した抗原受容体RNA結合ビーズにより、脂肪細胞溶解液中にHuRタンパク質が存在することが示されました。一方、ホタルルシフェラーゼRNA溶出分画およびブランクビーズ試料はともに陰性であり、この手法において非特異的な相互作用は検出されなかったことが示されました。以上の結果から、抗原受容体RNA断片とHuRタンパク質の相互作用は特異的であったことが示唆されます。このビデオを視聴することで、褐色脂肪組織のRNA転写物からRNA結合タンパク質を回収する方法について十分に理解できたはずです。適切に実施し、習得すれば、この工程は24時間以内に完了させることができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶRNAプルダウン法を用いて、褐色脂肪組織由来のRNA結合タンパク質を検出する方法です。AR 3-Prime UTRフラグメントを用いて、RBP相互作用のメカニズム解明に役立ちます。

RNA結合タンパク質の検出によって、

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