固形腫瘍内の灌流、間質液圧とリポソーム蓄積の空間測定

この実験の全体的な目的は、ナノ治療薬の腫瘍内蓄積を、腫瘍の微小循環や間質液圧（IFP）の上昇を含む腫瘍微小環境の特性と関連付けることです。この手法を用いることで、腫瘍内部におけるナノ粒子の不均一な取り込みを駆動する要因は何か、といったナノ医薬品に関する重要な疑問に答えることができます。

この手法の主な利点は、腫瘍微小環境の特性とナノ粒子の腫瘍内分布の共局在的な空間マッピングが可能になることです。トペンゲにより適切な麻酔レベルにあることを確認した後、マウスの目に軟膏を塗り、動物を伏臥位にして薄いプラスチックボード上に四肢をテープで固定します。次に、20 cmのPE10チューブに接続したカスタム27ゲージカテーテルを尾側静脈に挿入し、チューブを数枚のテープで固定します。

次に、1 mLシリンジ1本に200 µL以上のCTリポソームを充填し、もう1本の1 mLシリンジに、遊離iohexolと生理食塩水を体積比9:1で混合した溶液を150 µL以上充填します。CTリポソームのシリンジをシリンジポンプにセットしてカテーテルを接続し、ポンプの流量を600 µL/min（10 µL/secに相当）に設定します。その後、マウスをマイクロCTスキャナーのベッドに乗せ、レーザーポジショニングシステムを使用して、各スキャンで腫瘍がほぼ同じ方向になるように調整します。

関心のある各イメージングプロトコルについて、CTスキャナーコンソールソフトウェアのドロップダウンメニューから「bright dark」を選択し、スキャンボタンをクリックしてキャリブレーションを開始し、システムを初期化します。造影剤を注入する前に腫瘍の体積解剖学的マイクロCTを取得するには、まずCTスキャナーコンソールソフトウェアのインジケーターを確認し、CTスキャナーの安全インターロックが解除されていることを確認してください。次に、X線エネルギー 80 kilovolts、管電流 70 milliamps を使用し、1,000 枚の投影画像をキャプチャするスキャンを選択します。

次に、スキャンを開始します。スキャンが完了したら、ポンプを設定してリポソーム溶液を約150 microliters注入し、スタートボタンを押して、ヨウ素濃度 55 milligram/mL のCTリポソームをボーラス注入します。その後、リポソーム剤が全量注入され、カテーテル内が洗浄されたことを確認するため、50 microliters の生理食塩水でカテーテルを手動でフラッシュします。

10分後、先ほど実演した通りに腫瘍の2回目の解剖学的スキャンを行います。DCE-CTを行うには、イオヘキソール溶液が入ったシリンジをシリンジポンプにセットし、同じ注入速度で100 µLのイオヘキソールを注入するようにポンプを設定します。これらの注入量は標準的な200 µLよりも多いですが、動物は回復中にモニタリングされており、有害事象は観察されていません。

次に、CTスキャナーのコンソールで、先ほど実演したように、管電圧 80 kV、管電流 90 mA を用いた5分間のダイナミックスキャンを選択します。この設定では、最初の30秒間は1秒ごとに416枚の投影画像を、その後は10秒ごとに416枚の投影画像を撮影します。5秒間のDCE-CTデータを取得した後、注入ポンプを開始します。スキャンの終了時に、3回目の体積解剖学的マイクロCTスキャンを行います。

48〜70時間後、先ほど示したものと同じボリューム設定を用いて、リポソームの解剖学的CT画像を撮影します。IFPを測定するには、腫瘍が固定され、CT IFPロボットシステムでアクセス可能な状態で、動物をCT IFPロボットプラットフォームにテープで固定します。先ほど示した方法で、解剖学的マイクロCTスキャンを行います。

次に、穿刺前のデータをCT IFPロボットアライメントソフトウェアに読み込み、ウィンドウレベルを調整して腫瘍を可視化します。任意の画像で腫瘍の縁をクリックし、続いて腫瘍の隣接する側の2つ目の縁の位置を選択します。ソフトウェアは、これら2点間の直線上の位置を連続的に算出します。

次に、リストから等間隔に配置された5〜8箇所のX、Y、Z座標を選択します。続いて、IFPシステムの針を生理食塩ヘパリン溶液でフラッシュし、あらかじめ決定した1番目の針位置をCT IFPロボット制御ソフトウェアのX、Y、Z座標ウィンドウに入力します。goボタンを押し、ロボットを目的の位置まで移動させます。

次に、各針位置について順に、「insert needle」ボタンをクリックして組織に針を挿入します。PE20チューブをつまんで離し、IFP針と組織の間で流体連絡が適切に確保されていることを確認し、IFP測定値が上昇した後、IFP収集ソフトウェア上でつまむ前の値に戻ることを観察します。最後に、針を挿入した状態で解剖学的CTスキャンを行い、スキャンの終了時に「retract needle」ボタンをクリックして組織から針を抜去します。

腫瘍内の関心領域を選択すると、時間/強度曲線が得られ、これを用いて腫瘍内の特定の血行動態パラメータを定量的に推定することができます。腫瘍体積を等サイズの複数の関心領域に分割することで、腫瘍体積内におけるこれらのパラメータの空間分布を定量化することが可能です。また、投与48時間後におけるCTリポソームの生体内分布を観察することもできます。

示した通り、造影剤は依然として血管系を循環しており、脾臓および肝臓に顕著な取り込みが観察されます。これらのCTリポソームの腫瘍内蓄積は不均一であり、腫瘍組織の中心部と比較して主に周辺部に蓄積しています。針は高解像度マイクロCTによって明確に識別できるため、腫瘍体積内におけるIFP測定の空間的な位置特定が可能です。

灌流と血漿分画を空間的に共局在させて測定すると、皮下腫瘍におけるCTリポソームの腫瘍内蓄積との間に有意な相関があることが示されます。さらに、IFPの半径方向の分布は他の血行動態測定値と相関しており、腫瘍の微小循環、IFP、およびリポソームの腫瘍内蓄積の間に複雑な空間的・時間的関係があることが示唆されます。この手順を行う際は、IFP測定間の腫瘍の動きを最小限に抑えるため、動物をスキャナーベッドにしっかりと固定することが重要です。

本研究の意義は、新たな治療法の開発にまで及びます。ナノ粒子の輸送は、ナノメディシンに基づいた有効な治療薬を構築するための重要な第一歩となります。このビデオを視聴することで、腫瘍の間質液圧、腫瘍の微小循環、およびナノ粒子の分布を空間的にマッピングする方法について、十分に理解していただけるはずです。