ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

この手順の全体的な目的は、ヒト心臓組織から2つの独立した多能性血管周囲前駆細胞集団を単離することです。この手法は、血管周囲細胞集団のサブセットが心臓再生プロセスにどのように寄与しているかなど、心臓再生分野における重要な疑問の解決に役立つ可能性があります。本手法の主な利点は、不均一性が低減された前駆細胞集団が得られること、および主要な脱離技術の中でも選択的に生存率が向上することです。

血管周囲幹細胞のサブタイプが心筋分化能を持つことが示されているため、本手法は虚血性心疾患の治療に寄与する可能性があります。この手法は、心臓再生における血管周囲細胞の役割に関する知見を提供できるだけでなく、心筋線維化などの心疾患の他の側面を調査する場合にも適用可能です。一般的に、組織の新鮮度が生存細胞の使用に影響するため、本手法に不慣れな方は困難に直面することがあります。

本手順を開始するには、心膜、主要血管、および心房を除去した後、サンプルをペトリ皿に入れた洗浄液に浸します。次に、心室心筋を約1立方ミリメートルの小さな断片に切断し、最高の細胞回収率を得るために直ちに処理します。その後、新鮮な消化液を調製し、ウォーターバスで37 °Cに温めておきます。

その後、懸濁させた組織片を100 micronのストレーナーでろ過し、PBSで2回洗浄します。組織片を密閉蓋付きの滅菌済み30 milliliter容器に移します。消化液を加え、容器を密閉したプラスチック袋に入れ、120 RPMに設定した37 degrees Celsiusの振盪恒温水槽に入れます。

15分後、容器を3回反転させます。その後、さらに15分間ウォーターバスに戻します。その後、取り出して20% FBSを添加した5 mLのDMEMでコラゲナーゼをクエンチします。

続いて、10 mLセロロジカルピペットを用いて10〜20回緩やかにピペッティングし、消化した組織を摩砕して組織塊を分散させます。次に、懸濁液を100 µm、70 µm、そして最後に40 µmのセルストレーナーで順次ろ過し、単一細胞懸濁液を得ます。その後、細胞懸濁液を200 x gで4分間遠心分離します。

上清を慎重にデカントし、ペレットを1 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁して室温で2分間置き、その後、4 mLの洗浄用培地で希釈します。遠心分離ステップを繰り返し、ペレットを1 mLの洗浄用培地で再懸濁します。細胞懸濁液10 µLを90 µLの洗浄用培地で希釈し、細胞懸濁液を10倍希釈（1/10希釈）して作成します。

希釈した細胞懸濁液 10 µLをトリパンブルー染色液 10 µLと混合し、その混合液 10 µLを標準的な血球計数器に点適して細胞数を計測します。この手順では、非特異的な抗体結合をブロックするため、細胞懸濁液にマウス血清 50 µLを加え、4 °Cで20分間インキュベートします。次に、細胞懸濁液を 200 x g で4分間遠心分離します。

上清を除去し、洗浄緩衝液で再懸濁します。次に、アイソタイプコントロールおよび未染色コントロール用に、細胞懸濁液 50 µL ずつを 2 本のポリスチレン製ラウンドボトムフローサイトメトリーチューブに分注し、残りの量をマルチカラー染色のための 3 本目のチューブに入れます。マルチカラー染色のための単一細胞懸濁液に、5 種類の抗体を添加します。

ピペッティングで抗体と細胞を穏やかに混ぜ合わせ、すべてのチューブを4 °Cで20分間、暗所でインキュベートします。5本のフローサイトメトリー用チューブに、洗浄液100 µLとポジティブビーズ1滴を加え、コンペンセーションコントロールビーズを調製します。5本の各チューブに、個別に抗体を添加します。

次に、すべてのチューブを4 °Cで20分間、遮光してインキュベートします。その間に、EGM-2培地 500 µLを入れた細胞回収用チューブを準備し、4 °Cに置いておきます。抗体のインキュベーション後、5 mLの洗浄用培地を加えて細胞とビーズを洗浄し、未結合の抗体を除去します。

すべてのチューブを 200 x g で4分間遠心分離します。洗浄と遠心分離の工程を繰り返し、上清を慎重にデカントします。その後、洗浄用培地を用いて、細胞を 1 × 10⁶ cells / 250 µL の濃度で再懸濁します。

その後、ビーズを100 µLの洗浄液で再懸濁します。細胞およびビーズの懸濁液を、氷上で遮光した状態でセルソーターに移動させます。ポジティブビーズの補正コントロールチューブにネガティブビーズを1滴加え、これを用いて蛍光補正を設定します。

次に、未染色のコントロール細胞を解析して背景蛍光を確認し、電圧を設定します。続いて、非特異的結合に関連する背景蛍光の閾値を設定するため、コントロールアイソタイプを解析します。多色染色したサンプルを解析し、ペリサイトおよび外膜細胞の集団をコレクションチューブに回収します。

この手順では、培養面積 1 $\text{cm}^2$ あたり 100 $\mu\text{L}$ の滅菌済み 0.2% ゼラチン溶液を加え、手で攪拌してウェル全体をコーティングします。その後、プレートを 4 °C で 10 分間インキュベートします。次に、ゼラチン溶液を完全に除去します。

培養プレートの準備の間、回収した細胞を氷上で保持します。次に、回収したばかりの細胞を200 x gで4分間遠心分離し、細胞ペレットを適量のEGM-2で緩やかに再懸濁します。その後、細胞をゼラチンコートしたプレートに播種します。

この図では、生存細胞をゲートし、まずCD45陽性細胞を除外し、続いてCD56陽性細胞を除外しました。その後、CD56陰性分画からCD144陽性の内皮細胞を除去しました。この最終的な集団から、CD146陽性かつCD34陰性のペリサイトと、CD146陰性かつCD34陽性の外膜細胞を選択し、回収しました。

FACSで精製した心筋ペリサイトおよび外膜細胞の培養細胞は、いずれも紡錘形から星状の細胞形態を示します。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、所要時間は約5時間となります。本手順を行う際は、新鮮なサンプルを用いることで、生存細胞の回収率が最大になることを留意してください。

この手順に続き、虚血性心疾患の治療におけるこれらの細胞の適応性など、さらなる疑問を明らかにするために、細胞心筋形成術などの他の手法を実施することができます。