ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離
2016年10月8日
人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 + CD34 -周皮細胞およびCD34 + CD146 -外膜細胞、ヒト心筋から。
この手順の全体的な目標は、ヒトの心臓組織から多能性血管周囲前駆細胞の2つの別々の集団を単離することです。この方法は、血管周囲細胞集団のサブセットによるこのプロセスへの貢献など、心臓再生の分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、選択した主要なex-adhesion技術の不均一性が低下し、生存率が向上した前駆細胞の集団をもたらすことです。
この技術は、血管周囲幹細胞のサブタイプが心筋原性の可能性を持っていることが示されているため、虚血性心疾患の治療に影響を及ぼします。この方法は、心臓再生における血管周囲細胞の役割についての洞察を提供することができますが、心筋線維症など、心疾患の他の側面の研究にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、組織の新鮮さの結果として生存細胞を使用するために苦労します。
この手順を開始するには、心膜、主要な血管、および心房を取り出した後、サンプルをペトリ皿の洗浄媒体に入れます。次に、心室心筋を約1立方ミリメートルの小片に切断し、すぐに処理して最高の細胞収量を得ます。次に、新鮮な消化液を作り、水浴で摂氏37度に温めます。
その後、懸濁したティッシュピースを100ミクロンのストレーナーでろ過し、PBSで2回洗います。ティッシュピースを、蓋がしっかりと密封された滅菌済みの30ミリリットル容器に移します。消化液を加え、120RPMに設定された摂氏37度の振とう水浴の密封されたビニール袋に容器を入れます。
15分後、コンテナを3回ひっくり返します。その後、さらに15分間ウォーターバスに戻します。その後、コラゲナーゼを20%FBSで補充した5ミリリットルのDMEMでコラゲナーゼを取り出して急冷します。
その後、10ミリリットルの血清学的ピペットで10〜20回穏やかにピペッティングして消化した組織を粉砕し、組織の塊を分解します。次に、懸濁液を100ミクロン、70ミクロン、最後に40ミクロンのセルストレーナで順次濾過して、単一細胞懸濁液を得る。これに続いて、細胞懸濁液を200 x gで4分間遠心分離します。
上清を慎重にデカントし、ペレットを室温で2分間1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁してから、4ミリリットルの洗浄媒体で希釈します。遠心分離ステップを繰り返し、ペレットを1ミリリットルの洗浄媒体に再懸濁します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を90マイクロリットルの洗浄培地で希釈して、細胞懸濁液を1〜10希釈します。
希釈した細胞懸濁液10マイクロリットルを10マイクロリットルのトリパンブルーステインと混合し、混合物10マイクロリットルを細胞計数用の標準血球計算盤に置きます。この手順では、50マイクロリットルのマウス血清を細胞懸濁液に加え、摂氏4度で20分間インキュベートして、非特異的抗体の結合をブロックします。次に、細胞懸濁液を200 x gで4分間遠心分離します。
上清を取り除き、洗浄剤に再度懸濁します。次に、50マイクロリットルの細胞懸濁液を、アイソタイプおよび未染色コントロール用の2本のポリスチレン丸底フローサイトメトリーチューブのそれぞれに分注し、残りの容量をマルチカラー染色用の第3のチューブに入れる。シングルセル懸濁液に5種類の抗体を添加し、マルチカラー染色を行います。
ピペットで静かにピペットで抗体を細胞と混合し、すべてのチューブを摂氏4度で暗所で20分間インキュベートします。5本のフローサイトメトリーチューブ内の100マイクロリットルの洗浄媒体に1滴のポジティブビーズを添加して、コンペンセーションコントロールビーズを調製します。抗体を5本のチューブのそれぞれに個別に添加します。
次に、すべてのチューブを摂氏4度で暗所で20分間インキュベートします。その間に、それぞれ500マイクロリットルのEGM-2培地が入った細胞採取チューブを準備し、摂氏4度に置きます。抗体インキュベーション後、5ミリリットルの洗浄培地を加えて細胞とビーズを洗浄し、未結合の抗体を除去します。
すべてのチューブを200 x gで4分間遠心分離します。洗浄と遠心分離のステップを繰り返し、上清を慎重にデカントします。次いで、細胞を洗浄培地に1×10〜250マイクロリットル当たり6番目の細胞の濃度で再懸濁する。
その後、ビーズを100マイクロリットルの洗浄媒体に再懸濁します。細胞とビーズ懸濁液を、暗闇の中で氷上の細胞選別機に移します。ポジティブビーズ補正コントロールチューブにネガティブビーズを1滴加え、これらを使用して蛍光補正を設定します。
次に、未染色のコントロール細胞を走査してバックグラウンド蛍光を確立し、電圧を設定します。続いて、コントロールアイソタイプを実行して、非特異的結合に関連するバックグラウンド蛍光閾値を確立します。多色染色したサンプルを泳ぎ、周皮細胞と外膜細胞集団をコレクションチューブに集めます。
この手順では、成長面積の平方センチメートルあたり100マイクロリットルの滅菌0.2%ゼラチン溶液を追加し、手動で攪拌してウェル全体をコーティングします。その後、プレートを摂氏4度で10分間インキュベートします。次に、ゼラチン溶液を完全に取り除きます。
培養プレートを調製している間、収集した細胞を氷上に保ちます。次に、新たに採取した細胞を200×gで4分間遠心分離し、細胞ペレットを適量のEGM-2に穏やかに再懸濁します。その後、ゼラチンでコーティングされたプレートに細胞を播種します。
この図では、生細胞をゲーティングして、最初にCD45陽性細胞を除外し、次にCD56陽性細胞を除外しました。次いで、CD144陽性内皮細胞をCD56陰性画分から除去した。この最終集団から、CD146陽性、CD34陰性の周皮細胞およびCD146陰性、CD34陽性の外来細胞を選抜し、続いて収集した。
FACSで精製した心筋周皮細胞および外来細胞の両培養物は、紡錘体から星状細胞の形態を示す。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約5時間かかります。この手順を試行する際には、最も新鮮なサンプルが生細胞の最高の収量を提供することを覚えておくことが重要です。
この手順に続いて、虚血性心疾患の治療におけるこれらの細胞の適合性などの追加の質問に答えるために、細胞心筋形成術などの他の方法を実行できます。
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概要
この記事では、ヒトの心臓組織から多能性血管周囲前駆細胞の2つの異なる集団を分離する手法を提示します。この技術は、心臓再生とそのプロセスにおける血管周囲細胞の役割についての理解を深めることを目指しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 心臓再生
- 幹細胞生物学
- 血管周囲細胞集団
背景
- ヒトの心臓組織には多能性血管周囲前駆細胞が含まれています。
- これらの細胞は心筋再生に寄与する可能性があります。
- この研究はCD146 + CD34 - ペリサイトとCD34 + CD146 - 外膜細胞に焦点を当てています。
- これらの集団の理解は、虚血性心疾患の治療法に情報を提供する可能性があります。
研究目的
- 特定の血管周囲細胞集団を分離・精製すること。
- 心臓再生への寄与を調査すること。
- 不均一性を減少させ、分離された細胞の実行可能性を向上させること。
使用された方法
- CD146 + CD34 - ペリサイトとCD34 + CD146 - 外膜細胞の分離。
- 主要なex-adhesion技術の適用。
- 細胞の実行可能性と不均一性の評価。
- 心筋線維症研究への潜在的な応用。
主要な結果
- 2つの異なる血管周囲細胞集団の成功した分離。
- 従来の方法と比較して、前駆細胞の実行可能性の向上。
- 心臓再生における血管周囲細胞の役割に関する洞察。
- 他の心臓疾患調査にも適用可能な方法。
結論
- この技術は心臓再生メカニズムの理解を向上させます。
- 虚血性心疾患の治療法の進歩につながる可能性があります。
- 将来の研究では、心臓の健康へのより広範な影響を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating defined perivascular precursor cell populations from human myocardium enables mechanistic de-risking in cardiac regeneration research by reducing cellular heterogeneity and improving viability. This approach supports target validation and phenotypic screening for ischemic heart disease therapies by providing reproducible, disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in preclinical models through standardized isolation of CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding perivascular cell contributions to cardiac regeneration.
- Operational Value: Reduces biological noise through prospective isolation of homogeneous multipotent precursor subpopulations.
- Strategic Value: Supports target de-risking by clarifying functional roles of specific perivascular subsets in myocardial repair pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with defined surface marker profiles for consistent compound screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via FACS-based purification of pericyte and adventitial cell populations.
- Strategic Value: Facilitates scalable platform reuse for evaluating drug effects on cardiac progenitor cell function and viability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human cardiac cell models for investigating myocardial fibrosis and ischemic injury mechanisms.
- Operational Value: Enables translational continuity from discovery to preclinical validation using clinically relevant perivascular subsets.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by improving predictive value of preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying purified perivascular precursor cells for hypothesis testing in early discovery, assay-ready cells for screening applications, and translationally relevant models for preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through isolation of defined perivascular cell populations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell suspensions with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of cell viability, purity, and functional readouts following isolation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use of human-derived, disease-relevant cardiac progenitor cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable FACS-based isolation platform applicable across cardiac disease models and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in perivascular cell function.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cardiac progenitor cell isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency through better target validation and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac regeneration programs based on validated precursor cell activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell sorting, and primary tissue handling.
- Dependent on access to FACS instrumentation, antibody panels, and sterile cell culture infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different tissue sources or disease models.
- Limited by tissue freshness requirements, as viable cell yield declines with sample degradation.
