高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

本手法の全体的な目的は、マイクロRNA解析のために、ヒト血漿から精製高密度リポタンパク質を迅速に単離するための簡便なアプローチを開発することです。この手法は、高密度リポタンパク質の分子メカニズムや保護機能の解明など、肝臓学および循環器病学における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、少量のサンプルから短時間で精製HDLマイクロRNAを単離できることです。

本プロトコルでは、プロトコル本文に記載されている複数の遠心分離ステップにより、空腹時の末梢静脈血サンプルから血漿を回収します。回収した血漿を新しいチューブに移します。その後、製造元の指示に従い、室温で密度計を用いて血漿の密度を測定します。

マイクロRNA汚染の原因となる循環エクソソームを除去するため、1 mLの血漿に252 µLのエクソソーム沈殿溶液を加えます。そして、4 °Cで30分間インキュベートします。その後、混合液を30分間遠心分離し、エクソソームをペレット化します。

得られた上清を1 mL取り、次の中ビデオセグメントで示すように、さらなる処理のためにポリカーボネート製の厚壁超遠心管に移します。高密度リポタンパク質（HDL）の単離は、超低密度リポタンパク質（VLDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、そしてHDLを順次単離する3段階の密度勾配超遠心分離プロトコルによって行われます。3種類の異なる密度溶液（A、B、C）は、プロトコル本文に記載されている手順に従い、調製直後に使用する必要があります。

6.5 mLのポリカーボネート製厚壁超遠心管に、1 mLの血漿と200 µLのヌクレアーゼフリーFat Red 7Bを混合します。次に、この混合液の上に溶液Aを5 mL、慎重に重層します。必要に応じて、各チューブの重量を均一にするために、溶液Aの上にFat Red 7Bを追加してください。

チューブをあらかじめ冷却したローターにセットします。ローターを据置型遠心機に入れ、2時間遠心分離を行います。運転終了後、2層に分かれていることが確認できます。

VLDL画分に相当する上層を1.5 milliliters除去し、4 °Cで保存します。ピペットを使用して、チューブの底部から4 millilitersを新しい50 milliliterチューブに転送します。

ここにはLDLおよびHDL分画が含まれています。次のステップはLDLの単離です。LDLおよびHDL分画を含むチューブに、溶液Bを2 mLとヌクレアーゼフリーのFat Red 7Bを100 µL加えて混合します。

5〜10分間、氷上に置きます。混合試料6.5 mLをポリカーボネート製の厚壁超遠心管に移します。管をあらかじめ冷却したローターにセットし、3時間遠心分離します。

遠心分離が完了したら、LDL分画に相当する上層を1.5 milliliters回収し、4 °Cで保存します。次に、HDL分画を含むチューブ底部の4 millilitersを、50 milliliterの滅菌チューブに移します。第3ステップはHDLの単離です。

HDL画分を含むチューブに、溶液Cを2 mL、ヌクレアーゼフリーのFat Red 7Bを100 µL、および98% β-mercaptoethanolを15 µL加えて混合します。混合液の密度を確認します。チューブをあらかじめ冷却しておいたローターにセットし、3時間遠心分離します。

その後、HDL画分に相当する上層を2 mL取り出し、4 °Cで保存します。その後のアガロースゲル電気泳動およびPCRへの干渉を防ぐため、リポタンパク質画分から過剰な塩を除去する必要があります。本ビデオでは、HDL画分のみを対象に脱塩と濃縮の手順を示します。

13 mLの冷PBSをHDL分画に加え、分画分子量10Kの遠心フィルターデバイスに移します。スイングバケットローターを用い、4000 ×g、4°Cで30分間遠心分離します。さらに13 mLの冷PBSを用い、同様に遠心分離してHDL分画を2回目の脱塩処理します。

遠心分離後、溶質を含むリポタンパク質を取り出し、4 °Cで保存します。単離したリポタンパク質の品質と純度を評価するため、サイズ基準としてヒトリポタンパク質標準物質を用いたアガロースゲル電気泳動を行いました。β-メルカプトエタノールを添加せずに単離した代表的な結果では、HDL画分にVLDLの混入はなく、典型的なα移動度を示すことが確認されました。

しかしながら、HDL画分にはリポタンパク質の混入によるベータ移動の痕跡も見られます。最後の遠心分離ステップで溶液Cにβ-メルカプトエタノールを添加することで、HDL画分からすべての混入リポタンパク質を効果的に除去できます。本法で精製したヒトHDLに含まれるmicroRNAの定量が可能であることを実証するため、2種類の異なるmicroRNAをリアルタイム定量PCRにより増幅しました。

これらの増幅プロットにおいて、水平線は検出閾値を示しています。6つのサンプルから得られた単離HDLの代表的なリアルタイムPCRデータでは、両方のmicro RNAが一貫して検出されました。最後に、融解曲線分析により、両方のmicro RNAについて明確な単一のピークが示されており、これは先行するPCRにおける特異的な増幅と一致しています。

この手法に習熟し、適切に実施すれば、脱塩手順を含めて9時間で完了させることができます。本手順を行う際は、常に4～8°Cで作業することが重要です。また、超遠心分離を行う前に、各リポタンパク質画分の密度を調整してください。

本手順の後、HDLの純度などの追加的な疑問を解消するために、電子顕微鏡法などの他の手法を実施することができます。本技術の開発により、メタボリックシンドローム分野の研究者は、脂肪肝疾患が疑われるヒトにおけるHDL関連マイクロRNAをバイオマーカーとして探索することが可能になります。また、HDLの機能や、HDLが細胞生物学を変化させる分子メカニズムをより深く理解するためにも活用できる可能性があります。