Name: 高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶ、ヒト血漿から高密度リポタンパク質を迅速に精製し、miRNA解析を効率化する簡便法。この手法は、肝臓病学と循環器病学におけるHDLの分子メカニズムと保護機能の解明に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、全体的または部分的に、NIH助成金R01 AA 020758-04、U01DK 061731-13、T32 DK 007150-38からAJSに、T32 DK 007150-38からAAに支援されました。これはオリジナル作品であり、他の場所での出版は検討されていません。

血液試料の1コレクション<ol><li>肘前窩の著名な静脈の標準的な静脈穿刺によって、（他の抗凝固剤に比べていくつかの利点を持っている）、抗凝固剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有する10ミリリットルのプラスチックチューブに末梢静脈血サンプルを断食収集します。 </li><li>遠心卓上遠心機で4℃で20分間、1,600×gでの血液サンプルは、赤血球及びRNAの少量の遊離血漿を得ました。 </li><li>順次、それぞれ残りの細胞破片を除去するためにWBCおよび血小板その後さらに15分を除去するために10分間、スイングバケットローター3,000 G（4℃）、上清を集めます。 </li><li>製造指示に従って、室温で濃度計を用いてプラズマの密度を測定します。 注：0.9％食塩水（D = 1.023グラム/ ml）の濃度の調整は、エキソソームの除去後で前の密度勾配超遠心分離に必要とされ得ます。 </li></オール&gt; プラズマから2.エキソソームの取り外し<ol><li> HDLと同様の密度を持つ循環エキソソームを削除し、miRNAの3の量的重要な供給源を表します。 <ol><li> 4℃で30分間インキュベートした1ミリリットルプラズマに252μlのエキソソーム沈殿溶液を添加することによってこれを行います。エキソソームをペレット化し、4℃で1500グラムで30分間、混合物を遠心分離。 </li><li> HDL、密度勾配超遠心分離によるさらなる処理のためにポリカーボネート厚肉超遠心管に得られた上清の転送1 mlで単離する（下記参照）。 </li></ol></li></ol> 3.密度勾配超遠心分離（図1）。 <ol><li> HDLを区切るために、それぞれ、448811のx Gと8℃で動作し、固定角ローターで床の超遠心機を用いて3段階のプロセスを使用します。 </li><li>各単離するための3つの異なる密度のソリューションを順次、新鮮なを準備します。 <ol><li>オートクレーブし、蒸留水1000mlに、0.1グラムEDTA2Naと1ミリリットルの1NのNaOH：11.4グラムのNaCl（0.195モルのNaCl）を溶解することにより溶液A（VLDLの単離、D = 1.006グラム/ミリリットル）を準備します。その後、オートクレーブし、蒸留水の追加の3ミリリットルを追加します。 </li><li> 100ミリリットルの溶液A（塩化ナトリウム0.195モル、NaBrを2.44モル）に25.2グラムのNaBrを追加することによって、溶液B（LDLの単離、D = 1.182グラム/ミリリットル）を準備します。 </li><li> A液（塩化ナトリウム0.195モル、NaBrを7.7モル）の100mlで78.8グラムのNaBrを混合して溶液C（HDLの単離、D = 1.470グラム/ミリリットル）を準備します。濃度計を用いて、室温で適切な密度を確認してください。さらに使用するまで4℃ですべてのソリューションをしてください。 </li></ol></li></ol> VLDLの4.絶縁<ol><li>血漿の1ミリリットル（平均密度= 1.023グラム/ミリリットル）6.5ミリリットルポリカーボネート厚肉超遠心管で脂肪レッド7Bのヌクレアーゼフリーの200μLを混ぜます。 </li><li>次いで注意深く混合物の上に溶液Aを5ml層。必要に応じて、溶液AをTの上に付加的な脂肪レッド7Bを追加O各チューブの重量のバランスをとります。 、（減速 - 7） - 2時間（5加速度）のための遠心分離機。 注：遠心分離中に、リポタンパク質は、それらの平衡密度領域でのバンドとして蓄積されます。 </li><li>ランの終わりに2層を観察します。 4℃でのトップ層とストアを表すVLDL画分の1.5ミリリットルを削除します。 </li><li>最後に、LDLを含むチューブの底部からピペット転送4 mlで使用し、HDL、LDLの単離のための新たポリカーボネートチューブにアルブミンと脂肪酸画分。 </li></ol> LDLの5分離<ol><li>それぞれ、LDLとHDL画分（セクション4）を含むチューブに溶液B及び100μlのヌクレアーゼ無脂肪レッド7Bの2ミリリットルを混ぜます。 </li><li>その後、3時間（加速9、減速7）のために遠心分離。その後、最上層を表すLDL画分の1.5ミリリットルを除去し、-80℃で4°Cまたは店でおきます。最後に、HDLを含むチューブの底から4ミリリットルを転送新しいポリカーボネートチューブに分画。 </li></ol> HDLの6の単離<ol><li>それぞれ、HDL画分を含むチューブにソリューションC、100μlのヌクレアーゼ無脂肪レッド7Bと98％のβメルカプトエタノール15μlのの2ミリリットルを混ぜます。 </li><li> 3時間（加速9、減速7）のための遠心分離機。その後、最上層を表すHDL画分の2ミリリットルを除去し、-80℃で4℃で維持するか、ストアのいずれか。 </li></ol> 7.脱塩およびリポタンパク質画分の濃縮<ol><li>その後のアガロースゲル電気泳動およびPCRとの干渉を回避するために、製造業者の説明書によって記載されるように適切な分子量カットオフ（LDL / HDLためVLDLおよび10K管用3Kチューブ）で遠心分離フィルター装置を用いた密度勾配超遠心分離の間に加え、過剰な塩を除去します。 <ol><li>簡単に言えば、2.5ミリリットルを添加した後、冷PBS（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMのKCL、8 mMののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4; pH7.4）にcentrifuGE全体VLDL画分を集め、中密度勾配超遠心分離に4℃でスイングバケットローターを用いて60分間。 </li><li> 30分ごとに10ミリリットルの氷冷PBSで2回LDL画分を脱塩。次に、HDL画分を脱塩するために二回13ミリリットルの氷冷PBSを使用してください。高いPBSの体積を、アガロースゲル電気泳動で移動度を向上させる必要があります。遠心分離後、リポタンパク質を含有する溶質を除去し、4℃で保持するか、-80℃で保存しました。 </li></ol></li></ol> 8.アガロースゲル電気泳動<ol><li>次のように製造業者の使用説明書の軽微な変更でキットを使用するリポタンパク質のアガロースゲル電気泳動をPerfrom。 注：この手順はちょうど濃厚リポタンパクサンプルの品質と純度を評価することです。 <ol><li>簡潔には、密度勾配超遠心分離を用いて脱塩リポタンパク質画分の6μLを取得し、プレキャストリポタンパク質ゲル上にロードします。人間lipopを使用してくださいサイズ参考としてVLDL、LDLとHDLの基準をrotein。担当準備緩衝液を用いて60分間、100Vで、室温で電気泳動を行います。 </li><li> 10分間ゲルを乾燥した後、脂肪レッド7BでRTで10分間染色します。メタノール - 水75:25（v / v）の混合物中でゲル脱色し、5分間再度乾燥させます。 </li></ol></li></ol> 9. RNA抽出および精製<ol><li>血清/血漿中のmiRNAの単離及び精製キットを用いて精製したヒトHDLによりmiRNAの単離をPerfrom。 <ol><li>簡単に言えば、ボルテックスで混合し、次いで核タンパク質複合体とのRNaseの不活性化の完全な解離を確実にするために、室温で5分間インキュベートし、精製されたHDLの200μlに、RNA溶解試薬の1ミリリットルを追加します。 </li><li> （; 1.6×10 8コピー/μlのCEL-のmiR-39）の混合物に続いて合成線虫Caenorhabditis elegansのマイクロRNAの3.5μLをスパイク。その後、製造者の指示に従ってRNA抽出を行います。 </li></ol></li><li> purificatiを実行します製造元の指示に従って溶出スピンカラムを用いて抽出-miRNAの上。 spectrophorometerで精製したHDLからのmiRNAの濃度を測定します。 注：スピンカラムからのmiRNAの溶出は、RNaseフリー水を16μLを採用しました。 </li></ol> 10.逆転写（RT-PCR） <ol><li> HDLからmiRNAの100 ngのを分離する合成miRNA（CEL-のmiR-39）、逆転写キットを用い、製造業者の指示に従って20μlの反応容量中で逆転写でスパイク。 </li><li>テンプレートのmiRNA（NTC）がなく、逆転写酵素ミ​​ックス（NRT）することなく、適切なコントロールを実行します。 </li></ol> 11.リアルタイムPCR（QRT-PCR） <ol><li> cDNAの2希釈、10μlのPCRミックス、2μlのユニバーサルプライマー、miRNAのプライマー2μlのと4μlのRNaseフリー水：1の2μlので全量20μlにリアルタイムPCRをPerfrom。 </li><li> Reactiを実行します。15秒、55℃30秒間および30 s.ec 70℃での伸長相は三連で全ての反応をPerfrom 94℃の45サイクル、続いて15分間95℃で、96ウェルプレート中に。 </li><li>次に、製造者の指示に従って、合成ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した後、2-ΔΔCt法を用いて、miRNAのCalcuate相対量。 </li></ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).</li>
<li>Vickers, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).</li>
<li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+185%2C+96%2C+and+223+repress+selective+high-density+lipoprotein+cholesterol+uptake+through+posttranscriptional+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition.</a> Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).</li>
<li>Rayner, K. J., Moore, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+control+of+high-density+lipoprotein+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function.</a> Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+endosomal-derived+vesicles+shipping+extracellular+messages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages.</a> Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Foreman, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+human+serum+lipoproteins+by+single-spin+gradient+ultracentrifugation%3A+quantification+of+apolipoproteins+B+and+A-1+and+lipid+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components.</a> J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+LDL-+and+HDL-cholesterol+determined+by+ultracentrifugation+and+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC.</a> J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).</li>
<li>Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low+temperature+flotation+method+to+rapidly+isolate+lipoproteins+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma.</a> J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).</li>
<li>Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+of+apolipoprotein+%28a%29+and+lipoprotein+%28a-%29+derived+from+the+dissociation+of+human+plasma+lipoprotein+%28a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a).</a> J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).</li>
<li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).</li>
<li>Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNA%3A+a+new+source+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNA: a new source of biomarkers.</a> Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).</li>
<li>Stefanie, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+profiling+with+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker profiling with microRNAs.</a> Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).</li>
<li>Prasun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+promising+biomarkers+in+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics.</a> Biomarker Research. 2 (19), (2014).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease?</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJonathan%2C+S+%22miRNA+profiling+from+blood+-challenges+and+recommendations%22">miRNA profiling from blood -challenges and recommendations</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.qiagen.com">www.qiagen.com</a> (2015).</li>
<li>Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%2C+novel+biomarkers+of+acute+myocardial+infarction%3A+a+systemic+review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review.</a> World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

血液由来の新規バイオマーカーの同定は、様々な疾患の臨床診断および予後に役立ちます。マイクロRNAは、バイオマーカーのすべての資質を有することが知られており、種々の研究14-17で示されています。本研究では、血漿HDLからのmiRNAを分離するために迅速かつ簡単な簡単な方法を示しました。 VLDL、LDLおよびHDLの分離の従来の密度勾配超遠心分離法は、プラズマの正確なサンプリング、緩衝液の正確な製剤、密度及び下部リポタンパク質画分8の定量的な転写の測定に依存します。 HDL 8 -11を単離するために記載されている多数の方法があります。これらの方法は、しばしば非常に面倒であるか、または脱塩単離されたリポタンパク質のための血漿および透析の大容量を必要とし、完全にmiRNAの3のソースとしてエキソソームおよびリポタンパク質を削除しないでください。私たちは、このSIを確立しているこれらの欠点に対処するために、mpleと血漿HDLからのmiRNAの単離の迅速な方法。 重要な目標と本研究の主な目的は、その...

MicroRNAは、高度に保存されており、特定の標的メッセンジャーRNAを分解または抑制することにより、さまざまな生物学的プロセスの調節における主要なプレーヤーと考えられている内因性の非コード微小RNA種です1。miRNAは細胞内で作用するため、組織由来のバイオマーカーとして研究され、これらのmiRNAの組織特異的な機能の発見につながっています。しかし、miRNAは、タンパク質と関連しているか、細胞外RNaseによる分解からmiRNAを効果的に保護できるエクソソーム/マイクロベシクルにも細胞外に見られます2。より最近の研究では、HDLの保護効果は、コレステロール排出を促進する能力ではなく、特に循環miRNAキャリアとしての非コレステロール貨物と密接に関連している可能性があることが示されています3、4。これらのmiRNAは、脂質代謝を調節するだけでなく、HDL-miRNA複合体の抗炎症作用、抗酸化作用、抗血栓作用にも関連している可能性があります5、6。
HDL粒子に含まれるmiRNAの役割をさらに探求するためには、分離された高度に精製されたHDLからのmiRNA抽出のためのシンプルで簡単なプロトコルを確立する必要があります。HDLを単離するための多数の方法が説明されています。これらの方法は非常に時間がかかるか、サンプルのプーリング、単離されたリポタンパク質の脱塩のための広範な透析を必要とする可能性のある大量の血漿を必要とするか、それぞれmiRNAの供給源としてのエキソソームを完全には除去しません3。ここでは、少量の血液サンプルを大規模に使用して、高度に精製されたHDLからmiRNAを分離できるシンプルで迅速な方法について説明します。この方法は、循環するmiRNAの役割、特にさまざまな細胞や臓器間のコミュニケーションを促進するHDLの役割に関する研究を促進するための良い参考になると考えています。

<table><tbody><tr><td>プラスチックバキュテナーラベンダーK2EDTAチューブ&nbsp;</td><td>ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィック、ソーバル・レジェンド X1R&nbsp;</td><td></td><td></td>75004261</tr><tr><td>Densito 30PX 濃度計</td><td>メトラー・トレド</td><td>MT51324450</td><td></td></tr><tr><td>ExoQuick ソリューション&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>4484451</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート厚肉超遠心チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>O3237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX100 超遠心機&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>46902</td><td></td></tr><tr><td>ファットレッド 7B&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>201618</td><td></td></tr><tr><td>ベータ;-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 遠心フィルター装置 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra遠心フィルター装置 3K</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td></td></tr><tr><td>QuickGel Lipo キット&nbsp;</td><td>ヘレナ研究所&nbsp;</td><td>3344,3544T</td><td></td></tr><tr><td>は、VLDL、LDLおよびHDLリポトロール用のヒトリポタンパク質標準物質</td><td>です。Helena Laboratories</td><td>5069</td><td></td></tr><tr><td>Rep Prep バッファー&nbsp;</td><td>ヘレナ研究所&nbsp;</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinEluteスピンカラム&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 アナライザー</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch リアルタイム PCR 解析システム</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217184</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Assays</td><td>QIAGEN</td><td>141078139</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy 血清/血漿スパイクイン制御</td><td>QIAGEN</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr> 480878 <tr><td>0.20 &#181;M滅菌シリンジフィルター</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z227536</td><td></td></tr></tbody></table>

高度に精製された高密度リポタンパク質からのmirnaのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

小さなノンコーディングRNA(miRNA)は、メタボリックシンドロームを含むさまざまなヒトの病気に関与しています。それらは、それぞれ診断および予後のバイオマーカーとして利用されるか、または薬物開発の標的として役立つ可能性があります。最近、miRNAはリポタンパク質、特に高密度リポタンパク質(HDL)に運ばれ、レシピエント細胞に送達されて取り込みが行われることが示されています。このことから、miRNAは、遺伝子発現の制御や細胞間コミュニケーション、臓器間のクロストークなど、細胞や臓器の機能に重要かつ極めて重要な役割を果たしている可能性が浮かび上がってきます。精製されたHDLからmiRNAを単離する現在の方法は、小さなサンプルを大規模に利用する場合には実用的ではありません。これは主に、リポタンパク質の単離に使用される時間と手間のかかる方法によるものです。私たちは、miRNA分析に適した精製HDLを血漿サンプルから迅速に分離するための簡易的なアプローチを開発しました。この方法は、健康と疾患におけるmiRNAの役割に関する調査を促進し、特に、HDLに起因するコレステロール逆輸送以外のさまざまな生物学的機能に関する新たな洞察を提供するはずです。また、HDLに存在するmiRNA種は、さまざまな疾患の診断のための臨床バイオマーカーの貴重な情報を提供することができます。

エキソソームを除去した後に高密度リポタンパク質の単離 高度に精製されたHDLからのmiRNAを得るために、miRNA汚染7のソースを表すエキソソームを除去する必要があります。これは、市販のキットを用いて密度勾配超遠心分離の前に行われました。実用的な目的のために営利企業が開発した3段階の標準的な密度勾配超遠心分離プロトコルは（ 図1）変更されました。このプロトコルは、54,000 rpmで3、8、9、および10までの遠心力で一般的に使用されるプロトコルよりも大幅に高速である14万回転の速度で固定角ローターで遠心分離を必要とします。で広く利用可能なT-1270ローターを採用します7万回転の最大の力は、遠心分離は、最初に遠心力に耐えることができなかったポリアロマー管を用いて行きました。管の崩壊を回避するために、ポリカーボネート管を首尾よく使用しました。遠心分離時間は、リポタンパク質の酸化および潜在的なmiRNAの劣化<s...

マイクロRNAは、重要な調節的役割を果たし、様々なヒト疾患のための新規治療標的として浮上しています。 miRNAが、高密度リポタンパク質に運ばれることが示されています。私たちは、急速にヒト血漿からのmiRNA解析に適した精製されたHDLを分離するために簡略化された方法を開発しました。

高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

本手法の全体的な目的は、マイクロRNA解析のために、ヒト血漿から精製高密度リポタンパク質を迅速に単離するための簡便なアプローチを開発することです。この手法は、高密度リポタンパク質の分子メカニズムや保護機能の解明など、肝臓学および循環器病学における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、少量のサンプルから短時間で精製HDLマイクロRNAを単離できることです。本プロトコルでは、プロトコル本文に記載されている複数の遠心分離ステップにより、空腹時の末梢静脈血サンプルから血漿を回収します。回収した血漿を新しいチューブに移します。その後、製造元の指示に従い、室温で密度計を用いて血漿の密度を測定します。マイクロRNA汚染の原因となる循環エクソソームを除去するため、1 mLの血漿に252 µLのエクソソーム沈殿溶液を加えます。そして、4 °Cで30分間インキュベートします。その後、混合液を30分間遠心分離し、エクソソームをペレット化します。得られた上清を1 mL取り、次の中ビデオセグメントで示すように、さらなる処理のためにポリカーボネート製の厚壁超遠心管に移します。高密度リポタンパク質（HDL）の単離は、超低密度リポタンパク質（VLDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、そしてHDLを順次単離する3段階の密度勾配超遠心分離プロトコルによって行われます。3種類の異なる密度溶液（A、B、C）は、プロトコル本文に記載されている手順に従い、調製直後に使用する必要があります。6.5 mLのポリカーボネート製厚壁超遠心管に、1 mLの血漿と200 µLのヌクレアーゼフリーFat Red 7Bを混合します。次に、この混合液の上に溶液Aを5 mL、慎重に重層します。必要に応じて、各チューブの重量を均一にするために、溶液Aの上にFat Red 7Bを追加してください。チューブをあらかじめ冷却したローターにセットします。ローターを据置型遠心機に入れ、2時間遠心分離を行います。運転終了後、2層に分かれていることが確認できます。VLDL画分に相当する上層を1.5 milliliters除去し、4 °Cで保存します。ピペットを使用して、チューブの底部から4 millilitersを新しい50 milliliterチューブに転送します。ここにはLDLおよびHDL分画が含まれています。次のステップはLDLの単離です。LDLおよびHDL分画を含むチューブに、溶液Bを2 mLとヌクレアーゼフリーのFat Red 7Bを100 µL加えて混合します。5〜10分間、氷上に置きます。混合試料6.5 mLをポリカーボネート製の厚壁超遠心管に移します。管をあらかじめ冷却したローターにセットし、3時間遠心分離します。遠心分離が完了したら、LDL分画に相当する上層を1.5 milliliters回収し、4 °Cで保存します。次に、HDL分画を含むチューブ底部の4 millilitersを、50 milliliterの滅菌チューブに移します。第3ステップはHDLの単離です。HDL画分を含むチューブに、溶液Cを2 mL、ヌクレアーゼフリーのFat Red 7Bを100 µL、および98% β-mercaptoethanolを15 µL加えて混合します。混合液の密度を確認します。チューブをあらかじめ冷却しておいたローターにセットし、3時間遠心分離します。その後、HDL画分に相当する上層を2 mL取り出し、4 °Cで保存します。その後のアガロースゲル電気泳動およびPCRへの干渉を防ぐため、リポタンパク質画分から過剰な塩を除去する必要があります。本ビデオでは、HDL画分のみを対象に脱塩と濃縮の手順を示します。13 mLの冷PBSをHDL分画に加え、分画分子量10Kの遠心フィルターデバイスに移します。スイングバケットローターを用い、4000 ×g、4°Cで30分間遠心分離します。さらに13 mLの冷PBSを用い、同様に遠心分離してHDL分画を2回目の脱塩処理します。遠心分離後、溶質を含むリポタンパク質を取り出し、4 °Cで保存します。単離したリポタンパク質の品質と純度を評価するため、サイズ基準としてヒトリポタンパク質標準物質を用いたアガロースゲル電気泳動を行いました。β-メルカプトエタノールを添加せずに単離した代表的な結果では、HDL画分にVLDLの混入はなく、典型的なα移動度を示すことが確認されました。しかしながら、HDL画分にはリポタンパク質の混入によるベータ移動の痕跡も見られます。最後の遠心分離ステップで溶液Cにβ-メルカプトエタノールを添加することで、HDL画分からすべての混入リポタンパク質を効果的に除去できます。本法で精製したヒトHDLに含まれるmicroRNAの定量が可能であることを実証するため、2種類の異なるmicroRNAをリアルタイム定量PCRにより増幅しました。これらの増幅プロットにおいて、水平線は検出閾値を示しています。6つのサンプルから得られた単離HDLの代表的なリアルタイムPCRデータでは、両方のmicro RNAが一貫して検出されました。最後に、融解曲線分析により、両方のmicro RNAについて明確な単一のピークが示されており、これは先行するPCRにおける特異的な増幅と一致しています。この手法に習熟し、適切に実施すれば、脱塩手順を含めて9時間で完了させることができます。本手順を行う際は、常に4～8°Cで作業することが重要です。また、超遠心分離を行う前に、各リポタンパク質画分の密度を調整してください。本手順の後、HDLの純度などの追加的な疑問を解消するために、電子顕微鏡法などの他の手法を実施することができます。本技術の開発により、メタボリックシンドローム分野の研究者は、脂肪肝疾患が疑われるヒトにおけるHDL関連マイクロRNAをバイオマーカーとして探索することが可能になります。また、HDLの機能や、HDLが細胞生物学を変化させる分子メカニズムをより深く理解するためにも活用できる可能性があります。

fast-simplified-method-for-high-through-put-isolation-mirna-from

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

このビデオでは、有機抽出とガラス繊維カラム濃縮を使用して、結腸直腸癌患者の血漿サンプルから循環マイクロRNAを抽出する方法を説明しています。miRNAは血清や血漿などの生体液中で安定しているため、がんの診断、予後、治療の意思決定とモニタリングに理想的な循環バイオマーカーとなっています。この方法は、患者の臨床転帰を予測できる新しい循環バイオマーカーを特定するのに役立ちます。...

循環miRNA抽出:有機抽出と低分子RNA濃縮により血漿サンプルからmiRNAを単離する方法

エキソソーム中の安定したマイクロRNA（miRNA）はの存在は、バイオマーカーとして、また治療的介入のためのルートとしての潜在的有用性のために、細胞間コミュニケーションの新たなモードとして莫大な利益を生成しました。ここでは、搬送中のmiRNAを識別するために、定量PCRに続いて、血液や文化メディアからエキソソーム浄化を示しています。...

血と文化メディア由来エキソソームの精製およびマイクロRNAプロファイリング

このプロトコルは、ヒト血清から低分子RNAを抽出するための方法が記載されている。私たちは、DNAアレイで使用するために、がん血清からマイクロRNAを分離してもシングルプレックス定量PCRするために、このメソッドを使用している。プロトコルは、高品質のRNAを得るために変更を加えてフェノール及びグアニジニウムチオシアネート試薬を利用する。...

ヒト血清から小非コードRNAの分離

MicroRNA(miRNA)は、広く保存された調節分子のクラスです。ここでは、2つの強力なライゲーションステップとそれに続くハイスループットシーケンシングに依存するmiRNAクローニング法について説明します。私たちの方法は、miRNAの正確なゲノムワイド定量を可能にします。...

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

胆汁液は、潜在的に重要なバイオマーカーを含む細胞外小胞/エクソソームの貴重な供給源です。このプロトコルは、miRNAプロファイリングを含むさらなる分析のために、ヒトの胆汁からエキソソームを単離するための堅牢な方法を表しています。...

ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング

このプロトコルは、高密度リポタンパク質の小さなRNAの単離と定量化を説明しています。...

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

このプロトコルは、脂質液滴分離と老舗の小胞体分離キットを使用して、マウス肝臓から精製法を確立します。...

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

ここでは、定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ベースのプロトコルが、リポタンパク質粒子の天然マイクロ RNA 含量 (絶対/相対) の決定のために提示される。加えて、マイクロ RNA...

マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

ここでは、小型RNAを分離し、マイクロRNAを強化し、ハイスループットシーケンス用のサンプルを準備するためのステップバイステップの戦略について説明します。次に、オープン ソース ツールを使用して、シーケンスの読み取りを処理し、マイクロRNA...

MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

血漿リポタンパク質の分析にはいくつかの方法が使用されています。しかし、超遠心は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。ここでは、逐次密度超遠心を用いて血漿からリポタンパク質を分離する方法と、診断と研究の両方の目的でアポリポタンパク質を分析する方法について説明する。...

超遠心分離による血漿リポタンパク質の単離と分析

学ぶ、ヒト血漿から高密度リポタンパク質を迅速に精製し、miRNA解析を効率化する簡便法。この手法は、肝臓病学と循環器病学におけるHDLの分子メカニズムと保護機能の解明に貢献します。

高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

さらに動画を探す