に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイブルセラ HeLa細胞の感染

このハイスループット顕微鏡ベースのアッセイの全体的な目標は、HeLa細胞のブルセラ感染に関与する宿主因子を特定することです。この方法は、細胞内病原体ブルセラによるコロニー形成を促進または防止する宿主タンパク質の特定など、宿主病原体相互作用分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、獣医ラボから画像解析までの半自動ワークフローにより、ロボットと効率的な高スループットで実験を作成できることです。

したがって、この方法では、siRNAスクリーニングを使用してブルセラの宿主相互作用に関する洞察を得ることができます。プロトコールの大部分は、他のスクリーニング戦略に適用することができます。例えば、siRNAライブラリーなどです。

HeLa細胞を培養し、テキストプロトコールに従ってsiRNAを含むスクリーニングプレートを調製した後、黒色の384ウェルプレートをGの300倍、室温で20分間遠心分離して解凍します。FCSを含まない室温のdmemを使用してトランスフェクション培地を調製します。トランスフェクション試薬を1〜200に希釈し、慎重に混合してから使用してください。

試薬ディスペンサーを使用して、384ウェルプレートの各ウェルに25マイクロリットルのトランスフェクション培地を加え、プレートを前後に動かして溶液を混合します。プレートを室温で1時間インキュベートし、siRNAトランスフェクション試薬複合体の形成を可能にします。その間に、培地を吸引し、PBS中に0.05%トリプシンEDTAを2.5ミリリットル加えて、75平方センチメートルのフラスコのサブコンフルエント細胞を一度洗浄して、HeLa細胞を調製します。

次に、1.5ミリリットルの新鮮なトリプシンを加え、細胞が切り詰められるまでフラスコを摂氏37度に2〜3分間移します。10ミリリットルの予熱したdmem 60%FCSを使用して、細胞を再懸濁します。次に、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントしてから、16%FCSのdmemでミリリットルあたり10, 000個の細胞懸濁液を調製します。

トランスフェクション試薬の各ウェルに50マイクロリットルの細胞懸濁液を添加します。その結果、ウェルあたり500個の細胞が得られます。プレートを前後に動かして、セルを均等に分散させます。

その後、プレートを室温で5〜10分間放置し、細胞が落ち着くまで待ちます。パラフィルムを使用してプレートをシールします。そして、それを摂氏37度で5%C02で予熱したアルミニウムプレート上の湿ったインキュベーターで72時間インキュベートします。

クラス3の病原体であるB.abortusの取り扱いは危険であり、防護服、防護手袋、マスク、ゴーグルの着用など、地域のバイオセーフティ規制に従う必要があります。感染の1日前に、事前に決定した量のB.abortusスターター培養物を50ミリリットルのTSB KM培地に接種します。250ミリリットルのスクリューキャップボトル入り。

パラフィルムを使用してボトルを密封し、シェーカーで摂氏37度、100RPMで一晩中バクテリアを増殖させ、光学密度600.8〜1.1にします。細菌培養物の光学濃度600を測定します。そして、細菌培養物をdmem 10%FCSで希釈して感染培地を調製し、所望の感染の多様性を達成します。

または、MOI。自動プレートウォッシャーを使用して、トランスフェクション培地を50マイクロリットルの感染培地と交換します。フード内でプレートを遠心分離ケージに移し、384ウェルプレートをGの400倍、摂氏4度で20分間遠心分離します。

次に、パラフィルムを使用してプレートをシールし、摂氏37度、5%C02で予熱したアルミニウムプレート上で4時間インキュベートします。自動プレートウォッシャーでのインキュベーション後、デントリマイセンまたはGMのミリリットルあたり100マイクログラムを含む10%FCSを含むdmemを使用して細胞を洗浄し、細胞外細菌を不活性化します。次に、パラフィルムを使用してプレートをシールし、インキュベーター内の予熱したアルミニウムプレートに再度置き、エンドポイントアッセイのためにさらに40時間待ちます。

細胞を固定するには、まずPBSを使用してウェルを洗浄します。次に、PBSを50マイクロリットルの3.7%PFAと交換します。pH 7.4で2。

そして、細胞を室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、50マイクロリットルのPBSを使用して固定培地を交換します。自動プレートウォッシャーでサンプルを染色するには、まずPBS溶液中の1%Triton X-100を50マイクロリットルで10分間使用して細胞を透過化します。

PBSを使用して細胞を3回洗浄した後、DAPI1ミリリットルあたり1マイクログラムのPBIで50マイクロリットルのPBSを加え、室温で30分間インキュベートします。次に、PBSを使用して細胞を3回洗浄してから、光から保護します。プレートを自動顕微鏡に移します。

顕微鏡のパラメータを設定します。10-X 主観を選択します。次に、384ウェルプレートに対応するプレート形式を選択します。

井戸ごとに9つのサイトを取得します。[レーザーベースのフォーカスを有効にする] を選択します。そして、プレートと井戸の底に焦点を当てます。

次に、最初に取得したウェルを、サンプルとサイトのオートフォーカスのすべてのサイトを見つけるための初期ウェルとして設定します。次に、DAPIチャネルの場合、フォーカスのZオフセットを手動で調整します。次に、[サンプルの検索]を押して、ウェルの底にフォーカスを設定します。

AutoExposure 関数を使用すると、露光時間を適切に推定できます。DAPIチャンネルの露光時間を手動で補正して、露出オーバーの少ない広いダイナミックレンジを確保します。この露光時間を使用して、プレート全体のいくつかの部位を画像化します。

また、最も明るいピクセルがサイト上の最大輝度の約80%に達するまで、露光時間を手動で調整します。この手順を繰り返して、他のすべてのチャンネルに応じてフォーカスと露光時間を設定します。その後、フルプレートの取得を開始します。

エンドポイントアッセイでは、DAPIチャンネルとGFPチャンネルを使用してプレート全体をイメージングします。エンドポイントアッセイで染色細胞の画像解析を実行するには、シェーディングモデルを計算した後、テキストプロトコルに従って、View output settingsのテキストプロトコルに従って、画像を含む入力フォルダと結果を含む出力フォルダを選択します。次に、画像に共通するテキストを定義し、シェーディングモデルを読み込みます。

[テストモードの開始]をクリックし、すべてのモジュールの一時停止と表示の設定が無効になっていることを確認します。モジュール 9 の ImageMath の一時停止と表示の設定を有効にします。有効な一時停止記号は黄色で表示されます。

有効になっている表示機能は、開いた目として表示されます。次に、[実行] をクリックして、モジュール 9 までの解析を実行します。モジュール 9 では、パラメータを調整し、2 番目の画像に 2 番目の画像を乗算して、核を抑制せずに Brucella の DAPI 信号を抑制する値にします。

モジュールの値をテストするには、ステップを押します。新しく開いた画像を右クリックし、画像のコントラストを対数正規化に設定します。繰り返し、モジュール 9 に戻ります。

パラメータを調整し、2番目の画像に乗算し、Brucella信号が完全に抑制されるまでモジュールを再度ステップオーバーすると同時に、過減を示す黒い領域が最小限に抑えられます。特定のモジュールに適したパラメータを見つけるには、パラメータを徐々に最適化する必要があります。モジュールを繰り返しステップオーバーし、さまざまな値を試して、表示される結果への影響を観察することは間違いなく重要です。

モジュール 10 の一時停止と表示を有効にします。プライマリオブジェクトを特定します。しきい値のパラメータの下限を、原子核がセグメント化され、バックグラウンドが無視されるように十分に高く設定します。

適切な値を特定するには、モジュールをステップオーバーし、入力画像を右クリックして、ピークが通常背景を示すヒストグラムを表示します。バックグラウンド強度から始めて、出力画像に示されているように原子核の良好なセグメンテーションが達成されるまでパラメータを増やします。画像解析パイプラインの目標は、複製細菌を含む細胞を特定することです。

これは、核、核周囲、およびボロノイ細胞体内の病原体シグナルに異なる閾値を設定することによって達成されます。モジュール 15 の一時停止と表示を有効にします。前に示したようにオブジェクトをフィルタリングし、実行を押します。

パラメータの最小値を十分に高く設定して、核内にはっきりと見えるブルセラを持つ細胞のみが保持され、他のすべての細胞がフィルタリングされるようにします。適切な値を特定するには、モジュールをステップオーバーして出力イメージを表示します。核にはっきりと見えるブルセラを持つ細胞のみが保持されるまで、値を段階的に増やします。

テキストプロトコルに従ってモジュール16および17の核周囲およびボロノイ細胞体に細菌を持つ細胞をフィルタリングした後、テストモードを終了し、モジュールの横にあるすべてのアイシンボルのチェックを外して、完全な分析を実行する前に、どのモジュールにも表示が表示されていないことを確認します。最後に、[画像の分析]を押して分析を開始します。分析が終了したら、結果のPNG画像とCSVスプレッドシートを調べて、分析がプレート全体で確実に機能していることを確認します。

テキストプロトコルに従ってエントリーアッセイと感染スコアリングを実施します。この図は、エンドポイントアッセイで感染細胞を自動的に同定するための画像解析の一例を示しています。DAPIで染色した核HeLa細胞を同定しました。

核を囲む幅 8 ピクセルの核周囲。そして、核の延長線上にあるボロノイ細胞体を25ピクセル計算しました。病原体シグナルが少なくとも1つのコンパートメントで対応する閾値を超えた場合、細胞は感染したと見なされました。

ブルセラは、宿主細胞の関与を成功させるために、作用的な再配列を必要とします。したがって、ARP23の枯渇は、siRNAスクリーニングに適したポジティブコントロールです。ARPC3が枯渇すると、感染後2日で増殖する細菌を持つ細胞の数が減少しました。

スクランブル処理された制御細胞と比較して。自動画像解析により、このグラフでは、ARPC3が枯渇したHeLa細胞の感染が制御された細胞と比較して定量的に減少することが観察されました。ARPC3の枯渇は、制御された細胞と比較して、エントリーアッセイでのブルセラ感染の減少も示しました。

黄色で描かれた細胞内ブルセラの数の減少によって見られるように。最後に、自動画像解析による感染の定量化により、ARPC3の枯渇により、感染細胞数と感染細胞内の細胞内細菌数が減少することが確認されました。このプロトコルを習得すると、実験開始後1週間半以内に画像解析結果を得ることができます。

この手順を試行する際には、画像解析結果を慎重に確認して、選択したパラメーターがプレート全体で良好に機能することを確認することが重要です。この手順に続いて、生命細胞イメージングなどの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。あなたが人身売買をしているときのように、特定のホスト要因がブルセラと相互作用します。

または、遺伝子の枯渇が感染の細胞内動態にどのように影響するか。開発後、この技術は、感染生物学の分野の研究者がHeLa細胞アッセイでブルセラ感染に必要な宿主因子を探索する道を開きました。このビデオを見れば、細胞内病原体Brucella abortusによるHeLa細胞のコロニー形成を成功に導く、または阻害する宿主因子を特定する方法について、十分に理解できるはずです。

Brucella abortusでの作業は非常に危険であり、地域のバイオセーフティ規制に厳密に従わなければならないことを忘れないでください。