Name: に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイブルセラ HeLa細胞の感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: 学ぶ顕微鏡ベースのハイスループットスクリーニング法で、HeLa細胞におけるBrucella感染に関与する宿主因子を特定するsiRNAスクリーニング技術。この半自動化ワークフローは効率的なデータ収集と宿主病原体相互作用の解析を可能にする。

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この作業は、研究技術開発(RTD)プロジェクトInfectXおよびTargetInfectXに対する助成金51RT 0_126008および51RTP0_151029によって、それぞれ、SystemsX.ch、スイスのシステム生物学イニシアチブの枠組みで支援されました。スイス国立科学財団(SNSF)からの助成金310030B_149886に感謝します。S.H.L.とA.C.の研究は、Biozentrumの国際博士課程プログラム「Fellowships for Excellence」の支援を受けました。Simone Muntwilerは、技術支援で認められています。pNF106を提供してくださったDirk Bumann氏と、pJC43とpJC44を提供してくださったJean Celli氏に感謝します。

<ol><li>Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+global+map+of+human+brucellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The new global map of human brucellosis.</a> Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).</li>
<li>Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+human+pathogenic+Brucella+species+with+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).</li>
<li>Guzman-Verri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+of+the+Rho+subfamily+are+required+for+Brucella+abortus+internalization+in+nonprofessional+phagocytes%3A+direct+activation+of+Cdc42%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42.</a> J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).</li>
<li>Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+intracellular+replication+requires+trafficking+through+the+late+endosomal%2Flysosomal+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment.</a> Traffic. 9, 678-694 (2008).</li>
<li>Boschiroli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brucella+suis+virB+operon+is+induced+intracellularly+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).</li>
<li>Celli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+evades+macrophage+killing+via+VirB-dependent+sustained+interactions+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum.</a> J Exp Med. 198, 545-556 (2003).</li>
<li>Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acidification+of+phagosomes+containing+Brucella+suis+is+essential+for+intracellular+survival+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages.</a> Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).</li>
<li>Anderson, T. D., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+morphometric+analysis+of+Brucella+abortus-infected+trophoblasts+in+experimental+placentitis.+Bacterial+replication+occurs+in+rough+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum.</a> Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).</li>
<li>Ramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+large-scale+RNAi+screens+for+pathogen+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry.</a> BMC genomics. 15, 1162(2014).</li>
<li>Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+InlC+secretion+to+investigate+cellular+infection+by+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes.</a> J Vis Exp. , e51043(2013).</li>
<li>Kentner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+reroutes+host+cell+central+metabolism+to+obtain+high-flux+nutrient+supply+for+vigorous+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).</li>
<li>Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+coopts+the+small+GTPase+Sar1+for+intracellular+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).</li>
<li>von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+affairs%3A+investigating+the+Brucella+intracellular+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle.</a> FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

細菌性病原体は、真核生物の宿主細胞を操作して利益を得るための多くの戦略を進化させてきました。急性感染症を引き起こす病原体は、免疫系の重大な警戒と感染細胞の生存率の喪失を伴う急速な増殖を示すことがよくあります。対照的に、慢性感染症を引き起こすブル セラ 菌やその他の病原体は、宿主細胞内で長期にわたる相互作用を確立することに成功しています。したがって、細菌は、細胞の恒常性を損なうことなく、宿主細胞の機能を有益に微調整する必要があります。ゲノムスケールで感染プロセスに関与する宿主細胞因子を特定するための一般的な戦略は、たとえば、感染の機能的読み出しに結合されたsiRNAによる体系的な遺伝子枯渇の使用です。ここでは、蛍光菌の検出に基づくハイコンテント、ハイスループットのスクリーニングに適したプロトコルを紹介します。
大規模なスクリーニングを成功させるための重要な側面は、堅牢な自動画像分析と感染スコアリングです。ここで説明する方法は、一般に非常に堅牢なDAPI染色による細胞核の検出と、病原体シグナルが測定される関心領域の定義に依存しています。エンドポイントアッセイは、核周囲...

ブルセラ種は、αプロテオバクテリアのクラスに属するグラム陰性、通性細胞内病原体です。彼らはそのような流行地域における深刻な経済的損失をもたらしウシ、ヤギ、またはヒツジなどのそれらの自然宿主における中絶や不妊の原因となります。ブルセラ症は、世界的に毎年1万人以上の新しいヒトへの感染を引き起こす最も重要な人獣共通感染症の一つです。人間への送信は、最も一般的に感染した動物との直接接触により、または低温殺菌牛乳のような汚染された食品の摂取によって引き起こされます。熱性疾患の症状は、ブルセラ症の診断に困難を引き起こす、非特異的です。未治療の場合、患者は、関節炎、心内膜炎、及び神経障害2などのより重篤な症状と慢性感染症を発症することができます。 細胞レベルではブルセラ菌は食細胞および非貪食細胞に侵入することができ、細胞内内で複製しますブルセラ含有液胞（BCV）として知られているコンパートメント。細菌の内部移行は、RAC、ロー、およびCdc42の3の直接的な活性化によって、アクチン細胞骨格の再編成が必要です。真核生物宿主細胞の内部では、BCVは、エンドサイトーシス経路に沿って入稿するとリソソームとの相互作用にもかかわらず、細菌が分解4を避けるために管理します。水疱性ATPアーゼによってBCVの酸性化は、細菌IV型分泌系（T4SS）5の発現を誘導するために必要とされます。 ブルセラ菌は 、その複製ニッチを確立するT4SSによって分泌された細菌のエフェクターは、細胞内ニッチ7の確立の欠陥にT4SS 6の削除や水疱性ATPアーゼリードの阻害するので、必須であると考えられています。細菌は彼らまで人身売買のフェーズ中に複製されません ER由来液胞コンパートメント8に達します。細胞内増殖が発生すると、BCVはCLに見出されますこのようなカルネキシンおよびグルコース-6-ホスファターゼ6のようなERマーカーと大証の関連。 ブルセラ菌は、ER-ような区画内に、細胞に入り、リソソーム分解を回避し、最終的に複製される分子メカニズムはほとんどわかっていません。感染の異なる段階に関与する宿主因子は、主にターゲットにアプローチまたはショウジョウバエ細胞9で行われる小規模な低分子干渉RNA（siRNA）は、画面によって同定されています。これらは、 ブルセラ感染の間の個々の宿主因子の寄与に光を当てるしているが、我々は、プロセス全体の包括的な理解程遠いです。 ここでは、自動化された広視野蛍光顕微鏡および自動画像解析と組み合わせて、大規模なRNA干渉（RNAi）スクリーニングを用いてヒト宿主因子の同定を可能にするプロトコルが提供されます。逆HeLa細胞のsiRNAトランスフェクションはdescribように行われますエド以前10,11のマイナーな修正を加えました。エンドポイントアッセイは、出力および隣接細胞の感染を除くブルセラ細胞内のライフサイクルの大部分を覆っています。さらに、エンドポイントアッセイで同定されたヒットを特徴付けるために、感染の初期段階に関与する因子を同定するための修正されたプロトコルが使用されます。 構成的にGFPを発現ブルセラ流産株は、細菌を二日間細胞を感染させて、エンドポイントアッセイのために使用されます。この間、細菌は細胞、ER由来の複製ニッチへのトラフィックを入力し、核周囲の空間に複製します。 GFP信号のハイレベルは、その後、確実に複製する細菌が含まれている個々の細胞を検出するために使用することができます。 ハイスループットアッセイにおけるブルセラエントリを研究するために、細胞内および細胞外の細菌を区別できることが重要です。この方法は、ここに提示circumv細胞内および細胞外の細菌のエント差動抗体染色。これは、DsRedのの構成的発現と組み合わせたテトラサイクリン誘導性GFPを発現ブルセラ株に基づいています。構成のDsRedマーカーの存在は、試料中に存在するすべての細菌の同定を可能にします。 GFP発現は、ゲンタマイシン（GM）によって細胞外の細菌の不活性化と同時に非毒性テトラサイクリンアナログアンヒドロテトラサイクリン（ATC）の添加によって誘導されます。細胞不透過性抗生物質Gmは細胞外細菌を死滅させる一方で、ATCは、宿主細胞に入り、細胞内細菌に選択的にGFPの発現を誘導することができます。このデュアルレポーターは、広視野顕微鏡を用いて細胞外細菌（のみのDsRed信号）からの単一細胞内細菌（GFPとDsRedの信号）の堅牢な分離を可能にします。細胞内ブルセラによって検出可能なGFP発現を達成するために、我々は、ATCによる誘導の4時間はRELIになることを見出しましたできる信号。選択的細胞内細菌でGFPを発現するための同様の誘導方式は、細胞内の赤痢菌 12を研究するために以前に使用されてきました。

<table><tbody><tr><td>トリプシン性大豆寒天培地(TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン性大豆ブロス(TSB)</td><td>フルーカ</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>スキムミルク</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250mlスクリューキャップボトル</td><td>コーニング</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr>胎児<tr><td>子牛血清 (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10x ストック溶液、PBS</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>代替の細胞計数装置を使用可能</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384-well plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>剥離可能なアルミホイル</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr>試薬<tr><td>ディスペンサー:「Multidrop 384試薬ディスペンサー」</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840150</td><td>Alternative試薬ディスペンサーが使用できます。</td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬:「リポフェクタミン RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr>」 <tr><td>自動プレートウォッシャー:「プレートウォッシャー ELx50-16」</td><td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>このプレートワッシャーには、384ウェルプレートに適した16チャンネルマニホールドが含まれています。バイオセーフティキャビネットに収まり、洗浄中にプレートを覆う蓋が付いているため、エアロゾル生成のリスクが軽減されます。同様の機能を備えた代替プレートワッシャーを使用できます。</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>アンヒドロテトラサイクリン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 &#956;100%エタノール中のg / ml溶液は-20°Cに保たれます。C アルミ箔</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td> で光から保護 <td>0.2 M HEPES バッファー、pH 7.4 に溶解します。-20°Cで保管します。Cと使用前日に新たに解凍します。注意、PFAは吸入、皮膚との接触、および飲み込むと有毒です。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Construction: pJC44 4 を EcoRI で消化した後、Klenov 酵素で鈍末端を生成し、続いて SalI で消化しました。TetR-GFPは、プライマーprAC090およびprAC092を使用してpNF106から増幅されました。SalIによる消化後、TetR-GFP産物を消化したpJC44ベクターにライゲーションしました。</td></tr><tr><td>プライマー prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC</td></tr><tr><td>HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>IXMイメージングMSCOPE</td><td>精密電動Zステージを搭載した自動細胞イメージング顕微鏡。自動顕微鏡の代替システムや、以下に指定されているハードウェアおよびソフトウェアの代替コンポーネントを使用することができます。</td></tr><tr><td>高速レーザーオートフォーカス</td><td>分子デバイス&nbsp;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>CFI Super Fluor 10X 対物レンズ</td><td>ニコン&nbsp;</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, バネ式</td></tr><tr><td>フォトメトリクス CoolSNAP HQ モノクロ CCD カメラ</td><td>分子デバイス&nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1,392 x 1,040 イメージング ピクセル、6.45 x 6.45 & マイクロ;mピクセル、12ビットデジタル化</td></tr><tr><td>MetaXpressソフトウェア</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>ライトエンジン。次の光源が使用されます:バイオレット(DAPI)、シアン(GFP)、緑/黄(RFP)</td></tr><tr><td>DAPI用シングルバンドエキサイター</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI用シングルバンドエミッター</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI用シングルバンドダイクロイック</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>GFP用シングルバンドエキサイター</td><td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>シングルバンド GFP 用シングルバンド ダイクロイック</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>シングルバンド エキサイター RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr> シングル<tr><td>バンド エミッター RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr> シングル<tr><td>バンド ダイクロイック RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td></tr> 用</tbody></table>

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em&gt;ブルセラ</em&gt; hela細胞の感染

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

ブルセラ種は、それらの天然の宿主としての動物に感染する通性細胞内病原体です。ヒトへの送信は、最も一般的に感染した動物との直接接触により、または汚染された食品の摂取によって引き起こされ、重度の慢性感染症につながることができます。 ブルセラ菌は、プロと非専門的な食細胞に侵入し、小胞体（ER）由来の液胞内で複製することができます。 ER-ような区画内のブルセラ宿主細胞への侵入、リソソーム分解の回避、および複製に必要な宿主因子はほとんどわかっていません。ここでは、HeLa細胞におけるブルセラエントリおよび複製に関与する宿主因子を同定するために2つのアッセイを説明します。代替的なスクリーニング方法が適用できるがプロトコルは、RNA干渉の使用を記載しています。アッセイは、蛍光標識された細菌の検出自動使用して蛍光標識された宿主細胞に基づいています広視野顕微鏡。蛍光画像は、単一の細胞ベースの感染スコアリングを可能CellProfilerで標準化された画像解析パイプラインを用いて分析します。 エンドポイントアッセイでは、細胞内複製は感染の2日後に測定されます。これは、増殖が細菌侵入後12時間の周りに開始され、その複製ニッチへのトラフィックへの細菌を許可します。正常に細胞内ニッチを確立したブルセラ菌は、このように強く、宿主細胞内で増殖しています。細胞内細菌が大きく、個々の細胞外または細胞内の非複製の細菌数を上回るので、構成的にGFPを発現する株を使用することができます。強力なGFP信号は、感染した細胞を同定するために使用されます。 対照的に、エントリアッセイのために、細胞内および細胞外の細菌を区別することが重要です。ここでは、テトラサイクリン誘導性GFPのためのひずみエンコードが使用されます。誘導ゲンタマイシンによる細胞外細菌の同時不活性化とGFPの唯一の細胞内細菌は、GFPを発現することができることで、細胞内およびGFP信号に基づいて、細胞外細菌との区別を可能にします。細胞内増殖が開始される前に、これは、単一の細胞内細菌のロバストな検出を可能にします。

図1Aは、自動的に、エンドポイントアッセイで感染細胞を同定するために使用される画像解析の例を示しています。 DAPIで染色されたHeLa細胞の核は、核の周囲の8画素幅の周囲核を同定し、そして25ピクセル核の伸長によってボロノイセル本体を算出しました。細菌は主に核周囲空間に増殖するので、細胞のこの領域におけるGFP強度は、感染と非感染細胞とを区別するための最も堅牢な測定です。いくつかのケースでは、細菌は、核と大きくペリ核又はオーバーレイの外に増殖することが見出されています。したがって、これら二つの追加の目的はまた、感染細胞の同定のために考慮されました。セグメンテーションならびにGFP強度測定は、画像解析ソフトウェアCellProfiler 2を用いて行きました。 ブルセラ菌 <strオング&gt;宿主細胞3の成功の侵略のためのアクチン再構成を必要とします。したがって、アクチン再...

ブルセラ感染に関与する宿主因子の顕微鏡ベースのハイスループットスクリーニングのための2つのアッセイが説明されています。エントリーアッセイはブルセラエントリーに必要な宿主因子を検出し、エンドポイントアッセイは細胞内複製に必要な宿主因子を検出します。他のアプローチにも適用可能ですが、HeLa細胞におけるsiRNAスクリーニングは、プロトコルを説明するために使用されます。

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em&gt;ブルセラ</em&gt; HeLa細胞の感染

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

このハイスループット顕微鏡ベースのアッセイの全体的な目標は、HeLa細胞のブルセラ感染に関与する宿主因子を特定することです。この方法は、細胞内病原体ブルセラによるコロニー形成を促進または防止する宿主タンパク質の特定など、宿主病原体相互作用分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、獣医ラボから画像解析までの半自動ワークフローにより、ロボットと効率的な高スループットで実験を作成できることです。したがって、この方法では、siRNAスクリーニングを使用してブルセラの宿主相互作用に関する洞察を得ることができます。プロトコールの大部分は、他のスクリーニング戦略に適用することができます。例えば、siRNAライブラリーなどです。HeLa細胞を培養し、テキストプロトコールに従ってsiRNAを含むスクリーニングプレートを調製した後、黒色の384ウェルプレートをGの300倍、室温で20分間遠心分離して解凍します。FCSを含まない室温のdmemを使用してトランスフェクション培地を調製します。トランスフェクション試薬を1〜200に希釈し、慎重に混合してから使用してください。試薬ディスペンサーを使用して、384ウェルプレートの各ウェルに25マイクロリットルのトランスフェクション培地を加え、プレートを前後に動かして溶液を混合します。プレートを室温で1時間インキュベートし、siRNAトランスフェクション試薬複合体の形成を可能にします。その間に、培地を吸引し、PBS中に0.05%トリプシンEDTAを2.5ミリリットル加えて、75平方センチメートルのフラスコのサブコンフルエント細胞を一度洗浄して、HeLa細胞を調製します。次に、1.5ミリリットルの新鮮なトリプシンを加え、細胞が切り詰められるまでフラスコを摂氏37度に2〜3分間移します。10ミリリットルの予熱したdmem 60%FCSを使用して、細胞を再懸濁します。次に、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントしてから、16%FCSのdmemでミリリットルあたり10, 000個の細胞懸濁液を調製します。トランスフェクション試薬の各ウェルに50マイクロリットルの細胞懸濁液を添加します。その結果、ウェルあたり500個の細胞が得られます。プレートを前後に動かして、セルを均等に分散させます。その後、プレートを室温で5〜10分間放置し、細胞が落ち着くまで待ちます。パラフィルムを使用してプレートをシールします。そして、それを摂氏37度で5%C02で予熱したアルミニウムプレート上の湿ったインキュベーターで72時間インキュベートします。クラス3の病原体であるB.abortusの取り扱いは危険であり、防護服、防護手袋、マスク、ゴーグルの着用など、地域のバイオセーフティ規制に従う必要があります。感染の1日前に、事前に決定した量のB.abortusスターター培養物を50ミリリットルのTSB KM培地に接種します。250ミリリットルのスクリューキャップボトル入り。パラフィルムを使用してボトルを密封し、シェーカーで摂氏37度、100RPMで一晩中バクテリアを増殖させ、光学密度600.8〜1.1にします。細菌培養物の光学濃度600を測定します。そして、細菌培養物をdmem 10%FCSで希釈して感染培地を調製し、所望の感染の多様性を達成します。または、MOI。自動プレートウォッシャーを使用して、トランスフェクション培地を50マイクロリットルの感染培地と交換します。フード内でプレートを遠心分離ケージに移し、384ウェルプレートをGの400倍、摂氏4度で20分間遠心分離します。次に、パラフィルムを使用してプレートをシールし、摂氏37度、5%C02で予熱したアルミニウムプレート上で4時間インキュベートします。自動プレートウォッシャーでのインキュベーション後、デントリマイセンまたはGMのミリリットルあたり100マイクログラムを含む10%FCSを含むdmemを使用して細胞を洗浄し、細胞外細菌を不活性化します。次に、パラフィルムを使用してプレートをシールし、インキュベーター内の予熱したアルミニウムプレートに再度置き、エンドポイントアッセイのためにさらに40時間待ちます。細胞を固定するには、まずPBSを使用してウェルを洗浄します。次に、PBSを50マイクロリットルの3.7%PFAと交換します。pH 7.4で2。そして、細胞を室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、50マイクロリットルのPBSを使用して固定培地を交換します。自動プレートウォッシャーでサンプルを染色するには、まずPBS溶液中の1%Triton X-100を50マイクロリットルで10分間使用して細胞を透過化します。PBSを使用して細胞を3回洗浄した後、DAPI1ミリリットルあたり1マイクログラムのPBIで50マイクロリットルのPBSを加え、室温で30分間インキュベートします。次に、PBSを使用して細胞を3回洗浄してから、光から保護します。プレートを自動顕微鏡に移します。顕微鏡のパラメータを設定します。10-X 主観を選択します。次に、384ウェルプレートに対応するプレート形式を選択します。井戸ごとに9つのサイトを取得します。[レーザーベースのフォーカスを有効にする] を選択します。そして、プレートと井戸の底に焦点を当てます。次に、最初に取得したウェルを、サンプルとサイトのオートフォーカスのすべてのサイトを見つけるための初期ウェルとして設定します。次に、DAPIチャネルの場合、フォーカスのZオフセットを手動で調整します。次に、[サンプルの検索]を押して、ウェルの底にフォーカスを設定します。AutoExposure 関数を使用すると、露光時間を適切に推定できます。DAPIチャンネルの露光時間を手動で補正して、露出オーバーの少ない広いダイナミックレンジを確保します。この露光時間を使用して、プレート全体のいくつかの部位を画像化します。また、最も明るいピクセルがサイト上の最大輝度の約80%に達するまで、露光時間を手動で調整します。この手順を繰り返して、他のすべてのチャンネルに応じてフォーカスと露光時間を設定します。その後、フルプレートの取得を開始します。エンドポイントアッセイでは、DAPIチャンネルとGFPチャンネルを使用してプレート全体をイメージングします。エンドポイントアッセイで染色細胞の画像解析を実行するには、シェーディングモデルを計算した後、テキストプロトコルに従って、View output settingsのテキストプロトコルに従って、画像を含む入力フォルダと結果を含む出力フォルダを選択します。次に、画像に共通するテキストを定義し、シェーディングモデルを読み込みます。[テストモードの開始]をクリックし、すべてのモジュールの一時停止と表示の設定が無効になっていることを確認します。モジュール 9 の ImageMath の一時停止と表示の設定を有効にします。有効な一時停止記号は黄色で表示されます。有効になっている表示機能は、開いた目として表示されます。次に、[実行] をクリックして、モジュール 9 までの解析を実行します。モジュール 9 では、パラメータを調整し、2 番目の画像に 2 番目の画像を乗算して、核を抑制せずに Brucella の DAPI 信号を抑制する値にします。モジュールの値をテストするには、ステップを押します。新しく開いた画像を右クリックし、画像のコントラストを対数正規化に設定します。繰り返し、モジュール 9 に戻ります。パラメータを調整し、2番目の画像に乗算し、Brucella信号が完全に抑制されるまでモジュールを再度ステップオーバーすると同時に、過減を示す黒い領域が最小限に抑えられます。特定のモジュールに適したパラメータを見つけるには、パラメータを徐々に最適化する必要があります。モジュールを繰り返しステップオーバーし、さまざまな値を試して、表示される結果への影響を観察することは間違いなく重要です。モジュール 10 の一時停止と表示を有効にします。プライマリオブジェクトを特定します。しきい値のパラメータの下限を、原子核がセグメント化され、バックグラウンドが無視されるように十分に高く設定します。適切な値を特定するには、モジュールをステップオーバーし、入力画像を右クリックして、ピークが通常背景を示すヒストグラムを表示します。バックグラウンド強度から始めて、出力画像に示されているように原子核の良好なセグメンテーションが達成されるまでパラメータを増やします。画像解析パイプラインの目標は、複製細菌を含む細胞を特定することです。これは、核、核周囲、およびボロノイ細胞体内の病原体シグナルに異なる閾値を設定することによって達成されます。モジュール 15 の一時停止と表示を有効にします。前に示したようにオブジェクトをフィルタリングし、実行を押します。パラメータの最小値を十分に高く設定して、核内にはっきりと見えるブルセラを持つ細胞のみが保持され、他のすべての細胞がフィルタリングされるようにします。適切な値を特定するには、モジュールをステップオーバーして出力イメージを表示します。核にはっきりと見えるブルセラを持つ細胞のみが保持されるまで、値を段階的に増やします。テキストプロトコルに従ってモジュール16および17の核周囲およびボロノイ細胞体に細菌を持つ細胞をフィルタリングした後、テストモードを終了し、モジュールの横にあるすべてのアイシンボルのチェックを外して、完全な分析を実行する前に、どのモジュールにも表示が表示されていないことを確認します。最後に、[画像の分析]を押して分析を開始します。分析が終了したら、結果のPNG画像とCSVスプレッドシートを調べて、分析がプレート全体で確実に機能していることを確認します。テキストプロトコルに従ってエントリーアッセイと感染スコアリングを実施します。この図は、エンドポイントアッセイで感染細胞を自動的に同定するための画像解析の一例を示しています。DAPIで染色した核HeLa細胞を同定しました。核を囲む幅 8 ピクセルの核周囲。そして、核の延長線上にあるボロノイ細胞体を25ピクセル計算しました。病原体シグナルが少なくとも1つのコンパートメントで対応する閾値を超えた場合、細胞は感染したと見なされました。ブルセラは、宿主細胞の関与を成功させるために、作用的な再配列を必要とします。したがって、ARP23の枯渇は、siRNAスクリーニングに適したポジティブコントロールです。ARPC3が枯渇すると、感染後2日で増殖する細菌を持つ細胞の数が減少しました。スクランブル処理された制御細胞と比較して。自動画像解析により、このグラフでは、ARPC3が枯渇したHeLa細胞の感染が制御された細胞と比較して定量的に減少することが観察されました。ARPC3の枯渇は、制御された細胞と比較して、エントリーアッセイでのブルセラ感染の減少も示しました。黄色で描かれた細胞内ブルセラの数の減少によって見られるように。最後に、自動画像解析による感染の定量化により、ARPC3の枯渇により、感染細胞数と感染細胞内の細胞内細菌数が減少することが確認されました。このプロトコルを習得すると、実験開始後1週間半以内に画像解析結果を得ることができます。この手順を試行する際には、画像解析結果を慎重に確認して、選択したパラメーターがプレート全体で良好に機能することを確認することが重要です。この手順に続いて、生命細胞イメージングなどの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。あなたが人身売買をしているときのように、特定のホスト要因がブルセラと相互作用します。または、遺伝子の枯渇が感染の細胞内動態にどのように影響するか。開発後、この技術は、感染生物学の分野の研究者がHeLa細胞アッセイでブルセラ感染に必要な宿主因子を探索する道を開きました。このビデオを見れば、細胞内病原体Brucella abortusによるHeLa細胞のコロニー形成を成功に導く、または阻害する宿主因子を特定する方法について、十分に理解できるはずです。Brucella abortusでの作業は非常に危険であり、地域のバイオセーフティ規制に厳密に従わなければならないことを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Casanova, A. ほか。ヘラ細胞の ブルセラ 感染に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡を用いたアッセイ。 J. Vis. Exp. (2016年)本ビデオは、上皮細胞における ブルセラ・アボルタス...

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Q熱リケッチアは人獣共通感染症のQ熱の責任偏性細胞内グラム陰性細菌です。ここでは、 コクシエラ蛍光トランスポゾン変異体の生成と同様に、得られた内部移行、複製、および細胞傷害性表現型の自動識別と分析のための方法を説明します。...

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(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3...

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。...

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付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

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マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

学ぶ顕微鏡ベースのハイスループットスクリーニング法で、HeLa細胞におけるBrucella感染に関与する宿主因子を特定するsiRNAスクリーニング技術。この半自動化ワークフローは効率的なデータ収集と宿主病原体相互作用の解析を可能にする。

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ

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