栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル
2016年7月25日
ここでは、Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2の10日間の過剰発現により、マウス胚性線維芽細胞を完全に機能的で安定した栄養膜幹細胞に直接変換するためのプロトコルを紹介します。
この手順の全体的な目標は、マウス線維芽細胞から真正な誘導栄養膜幹細胞またはiTSCを生成することです。この方法は、胚と余分な胚系統を分離する障壁の性質に関する幹細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、トランスジェニック発現が一過性にしか活性化されず、安定して変換された細胞の選択が容易になることです。
適切な個人用保護具を使用したバイオセーフティレベル2の実験室で、5つの100ミリリットルの皿を5ミリリットルのポリ-L-リジン溶液で覆い、プレートを穏やかに揺さぶってコーティング溶液を均一に分配します。皿を摂氏37度のインキュベーターに30分間入れ、次にPoly-L-リジンを吸引し、PBSで皿を1回すすいでください。次に、293T細胞培地10ミリリットル中にディッシュあたり10〜6回目の293T細胞を7回プレートし、細胞を均一に分散させるようにディッシュを渦巻かせ、ディッシュをインキュベーターに戻す。
翌朝、増殖培地を5ミリリットルのトランスフェクション培地と交換します。次に、1000倍のクロロキン溶液のストック6マイクロリットルで培養物を処理し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。トランスフェクション混合物を調製するには、各レンチウイルスベクターについて、ボルテックスしながら600マイクロリットルのLentivector DNA溶液を600マイクロリットルの2X HEPES緩衝生理食塩水に滴下し、トランスフェクション混合物を室温でインキュベー
トします。15分後、調製した293T細胞に混合物を慎重に滴下し、皿をインキュベーターに戻します。5〜6時間後、培地を10ミリリットルのウイルス産生培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻します。翌朝、培地を7ミリリットルの新鮮なウイルス産生培地と慎重に交換し、さらに一晩インキュベーションします。
次に、各プレートから培地を個々の15ミリリットルの円錐管に移し、7ミリリットルの新鮮なウイルス産生培地をプレートに加えて、さらに一晩インキュベーションします。翌朝、ウイルス含有培地の第2バッチを収穫し、上清をウイルスの最初のバッチとプールし、0.45ミクロンの界面活性剤を含まない酢酸セルロース膜フィルターを介してウイルス含有培地を濾し、マイナス80で500マイクロリットルのアリコートに貯蔵します。線維芽細胞を誘導栄養膜幹細胞に変換するには、形質導入された塊状胚性線維芽細胞またはMEFを2ミリリットルのPBSで2回洗浄します。
次に、0.5ミリリットルのトリプシンEDTA溶液で細胞を摂氏37度で分離します。3〜4分後、倒立顕微鏡で細胞がプレートから浮き上がったことを確認し、1ミリリットルのTS培地でトリプシンを活性化します。細胞懸濁液を個々の15ミリリットルの円錐管に移し、細胞を遠心分離します。
次に、ペレットを2ミリリットルのTS培地に再懸濁し、10〜5番目の4因子mCherryを2回プレートするか、100ミリリットルの皿あたり未形質導入MEFを10ミリリットルのTS培地に注入し、線維芽細胞成長因子4とヘパリンを添加して一晩培養します。翌日、落射蛍光顕微鏡下で、mCherryタンパク質発現を使用して形質導入効率を推定します。形質導入効率が約100%の場合は、培養物をインキュベーターに戻し、10日目まで隔日ですべての皿の培地を交換します。
その後、倒立顕微鏡を使用して、線維芽細胞増殖因子4とドキシサイクリンを含まないヘパリンを含む新鮮なTS培地を細胞に供給し、4因子皿の超分化領域の外観を最大3週間監視します。この時点では、MEFは形態学的に栄養膜幹細胞に似ていないため、分化転換した領域の特定は非常に重要です。栄養膜巨細胞に隣接して密集したコロニーを探し、細胞サイズと大きな核によって識別されます。
個々のiTSCラインを分離するには、まず倒立顕微鏡を70%エタノールで拭き取り、細菌汚染の可能性を最小限に抑えます。次に、40マイクロリットルの05%トリプシンEDTAを96Uボトムウェルプレートの12ウェルに加え、プレートを氷上に置きます。次に、4因子のMEF分化転換皿から培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞を1回洗浄します。
洗浄後、10ミリリットルの新鮮なPBSを細胞に加え、プレートを倒立顕微鏡ステージに置きます。40マイクロリットルに設定された100マイクロリットルのピペットを使用して、ピペットチップで個々のコロニーを一周し、結果として生じる浮遊コロニーを吸引します。12コロニーが選択されるまで、各コロニーを96ウェルプレートの個々のウェルに移します。
次に、コロニーを摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、ピペッティングで細胞を解離し、細胞懸濁液を500マイクロリットルの完全TSと線維芽細胞成長因子およびヘパリン培地を含む24ウェルプレートの個々のウェルに移し、一晩培養します。翌日、培地を新鮮な完全なTSと線維芽細胞増殖因子およびヘパリン培地と交換して、死んだ細胞を取り除き、プレートをインキュベーターに戻します。
明るい境界を持つ上皮コロニーの出現について、毎日培養を監視します。コロニーが観察されたら、細胞を最大1週間、または70%コンフルエントになるまで培養します。4因子の導入遺伝子発現が活性化される培養では、細胞の形態が急速に変化します。
14日目から21日目頃には、明確な分化領域が出現します。これらの一次コロニーは、典型的な栄養膜幹細胞の形態を欠いていますが、継代培養されると、正真正銘の栄養膜幹細胞を強く連想させる、タイトなエッジと明るい境界を持つ特徴的な上皮形態が観察されます。4因子が誘導した栄養膜幹細胞が栄養膜転写因子、Cdx2、およびTfap2cに対して陽性のままであれば、これらの系統の考え方をその後のIn vitroまたはInVivo解析に使用することができます。
このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば6週間で完了することができます。この手順に続いて、ブラストアシストインジェクションなどの他の方法を実行して、生成されたiTSCのキメラ化ポテンシャルに関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、この分野の研究者や初期の系統分離研究者が、マウスの胚細胞と外部胚細胞の運命変換を探求する道を開きました。
このビデオを見れば、新しい胚性線維芽細胞を人工栄養膜幹細胞に直接変換する方法を十分に理解できるはずです。レンチウイルスベクターの取り扱いは非常に危険であり、バイオセーフティレベル2の適切な作業手順を使用するなどの予防措置を常に守る必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、特定の転写因子の一時的な過剰発現を通じて、マウスの胚性線維芽細胞を誘導トロフoblast幹細胞（iTSCs）に変換するプロトコルを紹介します。この方法は、胚性および胚外系統間の分化経路に関する洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 幹細胞生物学
- 細胞分化
- トランスジェニック技術
背景
- 誘導トロフoblast幹細胞（iTSCs）は、胎盤の発達を研究する上で重要です。
- 胚性および胚外系統間のバリアを理解することは、発生生物学において不可欠です。
- 転写因子の一時的な発現により、制御された分化が可能になります。
- このプロトコルは、線維芽細胞から安定したiTSCsを効率的に生成することを目指しています。
研究目的
- マウスの線維芽細胞からiTSCsを生成する信頼性の高い方法を開発すること。
- 初期の発達における系統特異のメカニズムを調査すること。
- トロフoblast機能とその健康と疾患への影響の研究を促進すること。
使用した方法
- Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2のトランスジェニック発現。
- 細胞培養用のポリ-L-リジンコーティングされた皿の準備。
- 成長を促進するための制御された条件下での細胞のインキュベーション。
- 一時的なトランス遺伝子発現後の安定変換細胞の選択。
主な結果
- マウスの線維芽細胞から機能的なiTSCsへの成功的な変換。
- 一時的発現方法の有効性の実証。
- トロフoblastの分化プロセスへの洞察。
- 再生医療および発生生物学における潜在的な応用。
結論
- このプロトコルは、iTSCsを生成するための簡単なアプローチを提供します。
- 主要な転写因子の一時的な発現は実行可能な戦略です。
- この方法は、幹細胞生物学と胎盤の発達の研究を進めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Direct conversion of murine embryonic fibroblasts into trophoblast stem cells (iTSCs) enables precise modeling of early lineage segregation and placental development. This protocol provides a robust platform for interrogating the molecular barriers between embryonic and extra-embryonic fates, supporting predictive confidence in developmental biology and cell fate engineering. The approach is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in early discovery pipelines focused on extra-embryonic lineage specification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of lineage barrier mechanisms through controlled cell fate conversion.
- Supports biological de-risking by validating the sufficiency of key transcription factors in lineage reprogramming.
- Facilitates predictive confidence in target selection for placental and developmental biology research.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible system for generating iTSCs suitable for downstream differentiation and functional assays.
- Standardizes the induction of trophoblast lineage, enabling quantitative assessment of conversion efficiency and marker expression.
- Prepares validated cell populations for high-content screening of modulators affecting trophoblast fate.
Translational & Preclinical Research
- Offers a disease-relevant system for studying genetic and epigenetic determinants of placental development.
- Enables translational continuity by bridging in vitro lineage conversion with in vivo functional validation, such as chimerization assays.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based models for extra-embryonic lineage research.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling hypothesis-driven testing of lineage determinants and functional validation of induced cell states.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on the sufficiency of transcription factors to overcome epigenetic lineage barriers.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for evaluating conversion efficiency and marker gene expression.
- Analytics: Supports comparative analysis of methylation patterns and gene expression profiles between iTSCs and native TSCs.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with in vivo functional assays, such as placental chimerization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating lineage-specific stem cell lines from somatic sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in lineage conversion and target validation for extra-embryonic research.
- Operational Value: Standardizes cell induction and selection, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by clarifying mechanistic barriers and conversion thresholds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based models for placental and developmental studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, lentiviral transduction, and molecular marker analysis.
- Demands access to biosafety level two facilities and appropriate personal protective equipment for viral work.
- Necessitates standardized protocols for cell selection, marker validation, and functional assays.
- Adaptation to other species or cell types may require optimization of transcription factor combinations and culture conditions.
- Practical limitations include the need for careful monitoring of transduction efficiency and colony selection to ensure reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
293T Cell Lentiviral Vector Production
3:06
Fibroblast to Induced Trophoblast Stem Cell (iTSC) Conversion
5:10
Individual iTSC Line Isolation (Transdifferentiation Day 21-28)
7:02
Results: Representative Morphological Changes During MEF to iTSC Conversion
7:56
Conclusion
