栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

この手順の全体的な目的は、マウス線維芽細胞から真正な誘導トロフォブラスト幹細胞（iTSC）を生成することです。この手法は、胚系と胚外系の分離障壁の性質に関する、幹細胞分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、導入遺伝子の発現が一時的にのみ活性化されるため、安定的に転換された細胞の選別が容易であることです。

適切な個人用保護具を着用し、バイオセーフティレベル2の研究室において、5枚の100 mLディッシュに5 mLのPoly-L-lysine溶液を加え、プレートを軽く揺らしてコーティング溶液を均一に分散させます。ディッシュを37 °Cのインキュベーターに30分間置き、その後、Poly-L-lysineを吸引し、PBSで1回洗浄します。次に、1枚のディッシュあたり7 × 10⁶個の293 T細胞を10 mLの293 T細胞用培地で播種し、ディッシュを回転させて細胞を均一に分散させ、インキュベーターに戻します。

翌朝、成長培地を5 mLのトランスフェクション用培地と交換します。次に、1000Xのクロロキン溶液ストックを6 µL加え、プレートを37 °Cのインキュベーターに戻します。トランスフェクション混合液を調製するため、各レンチウイルスベクターについて、2X HEPES緩衝生理食塩水600 µLにレンチベクターDNA溶液600 µLをボルテックスしながら滴下し、トランスフェクション混合液を室温でインキュベートします。

15分後、混合物を調製した293 T細胞に非常に慎重に滴下し、ディッシュをインキュベーターに戻します。5〜6時間後、培地を10 millilitersのウイルス生産培地に交換し、プレートをインキュベーターに戻します。翌朝、培地を7 millilitersの新鮮なウイルス生産培地に慎重に交換し、さらに一晩インキュベートします。

次に、各プレートから培地を個別の15 milliliter コニカルチューブに移し、プレートに7 milliliter の新鮮なウイルス作製培地を加えて、さらに一晩インキュベートします。翌朝、2回目のウイルス含有培地を回収して上清を1回目のウイルス分と合わせ、ウイルス含有培地を0.45 micron の界面活性剤フリーセルロースアセテートメンブレンフィルターでろ過し、-80°Cで500 microliter ずつ分注して保存します。線維芽細胞を誘導多能性栄養膜細胞に変換するため、導入後のマウス胚線維芽細胞（MEF）を2 milliliter のPBSで2回洗浄します。

次に、37°Cで0.5 mLのTrypsin EDTA溶液を用いて細胞を剥離させます。3〜4分後、倒立顕微鏡下で細胞がプレートから剥がれたことを確認し、1 mLのTS mediumを加えてTrypsinを不活化します。細胞懸濁液を個別の15 mLコニカルチューブに移し、細胞を遠心分離します。

次に、ペレットを2 mLのTS培地で再懸濁し、線維芽細胞増殖因子4とヘパリン、およびドキシサイクリンを添加した10 mLのTS培地を用いて、100 mmディッシュあたり2 × 10⁵個のmCherry導入またはコントロールの非導入MEFを播種し、一晩培養します。翌日、エピ蛍光顕微鏡下でmCherryタンパク質の発現を確認し、導入効率を推定します。導入効率が約100%であれば、培養物をインキュベーターに戻し、10日目まで1日おきにすべてのディッシュの培地を交換します。

その後、倒立顕微鏡を用いて、4つの因子を導入したディッシュ上に分化転換領域が現れるかを最大3週間監視しながら、Doxycyclineを含まず、線維芽細胞増殖因子4およびヘパリンを含む新鮮なTS培地で細胞を nuôi育します。この時点では、MEFは形態的に栄養膜幹細胞に似ていないため、分化転換領域を特定することが極めて重要です。細胞サイズと大きな核によって識別される栄養膜巨細胞に隣接した、密集して積み重なったコロニーを探してください。

個々のiTSCラインを単離するために、まず倒立顕微鏡を70%ethanolで拭き、細菌汚染の可能性を最小限に抑えます。次に、96 U底ウェルプレートの12個のウェルに0.5%Trypsin EDTAを40 µLずつ添加し、プレートを氷上に置きます。続いて、4つの因子のMEF転分化ディッシュから培地を吸引し、PBS 10 mLで細胞を1回洗浄します。

洗浄後、細胞に10 millilitersの新しいPBSを加え、プレートを倒立顕微鏡のステージ上に置きます。40 microlitersに設定した100 microliterピペットを用い、個々のコロニーの周囲をピペットチップで囲み、浮上したコロニーを吸引します。12個のコロニーをピックアップするまで、各コロニーを96ウェルプレートの個別のウェルに転移させます。

次に、コロニーを37°Cで5分間インキュベートします。インキュベーション後、ピぺッティングによって細胞を解離させ、細胞懸濁液を、500 µLの完全TS＋線維芽細胞増殖因子およびヘパリン含有培地を入れた24ウェルプレートの各ウェルに転移し、一晩培養します。翌日、死細胞を除去するために培地を新鮮な完全TS＋線維芽細胞増殖因子およびヘパリン含有培地に交換し、プレートをインキュベーターに戻します。

上皮細胞コロニーの明瞭な境界が出現するかどうか、毎日培養液を観察します。コロニーが観察されたら、最大1週間、あるいは細胞密度が70%コンフルエントになるまで培養します。4つの因子の導入遺伝子の発現が活性化している培養物では、細胞の形態が急速に変化します。

14日から21日頃にかけて、明確な分化転換領域が出現します。これらの一次コロニーは、典型的な栄養膜外胚葉幹細胞の形態を示しませんが、継代 culture すると、真の栄養膜外胚葉幹細胞を強く想起させる、境界が明瞭で辺縁が密な特徴的な上皮様形態が観察されます。4つの因子によって誘導された栄養膜外胚葉幹細胞が、栄養膜外胚葉転写因子である Cdx2 および Tfap2c に対して陽性であり続ける場合、これらの細胞株を以降の in vitro または in vivo 解析に使用することが可能です。

この手法を習得すれば、適切に実施することで6週間で完了させることができます。本手順の後、生成されたiTSCのキメラ形成能に関するさらなる疑問を解消するために、ブラストアシスト注入法などの他の手法を実施することが可能です。本手法の開発により、初期胚の系統分離分野の研究者が、マウスにおける胚性細胞から胚外細胞への運命転換について探索する道が開かれました。

このビデオを視聴することで、新しい胚性線維芽細胞を誘導トロフォブラスト幹細胞へ直接転換する方法について十分に理解できるはずです。レンチウイルスベクターを取り扱う際は極めて危険であるため、バイオセーフティレベル2に準拠した適切な作業手順などの予防策を常に遵守することを忘れないでください。