RNA及びDNA抽出の両方のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織コアの調製

この手順の全体的な目標は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織コアのアーカイブからRNAとDNAを順次抽出することです。これは、RNAとDNAの両方を抽出する組織コアを回収するためのプロトコルです。このプロトコルの主な利点は、組織ブロックの正確に標的化された領域からのRNAおよびDNA収量を改善することです。

この手順は、主にアーカイブ性前立腺がん組織で開発されています。また、他の種類のアーカイブ組織にも適用できます。この方法は、組織のコアリングステップが研究室では一般的に使用されていないため、視覚的なデモンストレーションが重要です。

ほとんどの研究室では、代わりに断面積を使用しているため、組織がより早く消耗し、サンプルに大きな不均一性が加わります。まず、顕微鏡のスライドをレビューし、細い点の油性マーカーを使用して関心領域の輪郭を描きます。次に、顕微鏡スライド上の関心領域を覆うのに十分な大きさのパラフィンフィルムの一部をカットします。

次に、フィルムをスライドにしっかりと置き、フィルムの端にフィルムを巻き付けて滑らないようにします。細い点の油性マーカーを使用して、組織全体と組織内の関心領域の輪郭を描きます。次に、スライドからフィルムをはがし、対応するティッシュブロックに移します。

フィルムを反転または回転させて、組織全体の輪郭がブロック内の組織の観察された形状と一致するように、フィルムの向きを調整します。滑りを防ぐために、フィルムの部分をブロックの表面にしっかりと押し付けます。油性マーカーの先端を使用して、関心領域の輪郭に沿って浅いが目に見えるくぼみを作成し、フィルムをはがします。

次に、0.6ミリパンチセットからレセプターパンチを1ミリリットルの漂白剤が入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブに先端を浸し、パンチを数回上下にスライドさせて清掃します。70%のエタノールが入ったチューブで洗浄を繰り返し、次に水で洗浄を繰り返します。次に、クリーニングしたパンチを関心領域に3ミリメートルの深さまで押し込み、引き出します。

コアをスタイラスでパンチから押し出すことにより、コアを低結合のマイクロ遠心分離チューブに放出します。組織コアを含むマイクロフュージチューブにキシレン1ミリリットルを加え、10秒間激しく渦巻く。次に、摂氏50度に設定されたヒートブロックに3分間置きます。

インキュベーション後、室温で最大速度で2分間遠心分離します。遠心分離後、コアを氷上に5分間置き、ワックス状の残留物を固化させます。次に、ピペットチップを使用して、上清と一緒に半月板の周りに蓄積したパラフィンを慎重に取り除きます。

その後、キシレン処理を繰り返します。パラフィンキシレンミックスを取り除いた後、100%エタノールの1ミリリットルを加え、10秒間激しく渦巻きます。最高速度で2分間遠心分離した後、エタノールを慎重に廃棄します。

均質化を開始する前に、エタノール洗浄をもう一度繰り返します。ホモジナイズする前に、脱パラフィン処理したコアを700マイクロリットルの100%エタノールに再懸濁します。.中程度の設定で電動ティッシュホモジナイザーを使用して、コアを微粒子に粉砕します。

最適なDNAおよびRNA収量を得るには、組織コアの徹底的な均質化が必要です。次に、別々の15ミリリットルのチューブに約10ミリリットルの漂白剤、RNase中和溶液、および70%エタノールを入れます。サンプルの均質化後、ホモジナイザープローブを各洗浄液で順番に洗浄します。

洗浄段階では、ホモジナイザーを最高速度で運転します。プローブをティッシュで拭き、プローブを完全に乾かしてから、次のサンプルを均質化します。プローブブレードに残留組織片がないか目視検査し、見つかった場合はプローブを再度清掃します。

均質化後、100%エタノールでサンプル量を1ミリリットルにし、最高速度で15分間遠心分離します。エタノールを慎重に吸引し、ペレットを約15〜20分間風乾してから、プロテイナーゼKの抽出を開始します。ペレットを150マイクロリットルのプロテイナーゼK消化バッファーに再懸濁し、チューブをフリックしてペレットを緩めます。

DNAの回収率を高めるためには、一晩のプロテイナーゼK消化が推奨されます。温度安定プロテイナーゼKを10マイクロリットル加え、フリックして混合します。摂氏56度で15分間、軽度の攪拌を加えながらインキュベートします。

チューブを氷上で3分間インキュベートします。冷却後、チューブを最大速度で15分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さずに、各上清を新しいマイクロ遠心チューブに慎重に移し、RNA精製を行います。

DNA抽出のための組織消化時間の延長を含む、文書化されたプロトコルの最適化された手順を使用してRNAとDNAを抽出します。この方法を使用して、古いホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプルからRNAおよびDNAを回収できます。核酸は、サンプル年齢が3〜14歳の前立腺がんサンプルから共抽出されました。

平均収量は2, 270ナノグラムのRNAと820ナノグラムのDNAでした。興味深いことに、組織サンプルの年齢と核酸回収率との間に有意な相関関係はありませんでした。全体として、RNAとDNAの収量はサンプル間で相関していましたが、ほとんどの場合、DNAと比較して2倍以上のRNAが回収されました。

このプロトコルで抽出されたゲノムDNAの性能を実証するために、アーカイブ前立腺癌サンプルからのバイサルファイト変換DNA抽出物をメチル化特異的PCRによって増幅しました。ALU反復エレメントはメチル化制御として使用され、サンプル間のばらつきはほとんど見られませんでした。GSTP1は、前立腺がんにおいて高メチル化されることが知られている遺伝子であり、良性サンプルから抽出したDNAを用いたところ、メチル化特異的PCRによる増幅は検出されませんでした。

侵攻性前立腺がん患者様のDNAサンプルは、無痛性前立腺がん細胞由来のものよりも低い検出可能なQPCRサイクル閾値を示し、侵攻性前立腺がんにおけるGSTP1のメチル化の増加を示しました。この手法を習得すると、RNAの場合は3〜4時間以内に、一晩の消化後、適切に実行されればDNAの場合は4時間で実行できます。この技術により、分子病理学の研究者は、さまざまながんの診断用DNAおよびRNAバイオマーカーを探索できるようになるはずです。

このビデオを見れば、アーカイブ組織ブロックで正確にマッピングされた関心領域からDNAとRNAを抽出するための組織コアの準備方法について十分に理解できるはずです。