無傷の植物をブランチングすることによって、または抽出物の熱処理によりタバコ宿主細胞タンパク質の除去方法の比較

この一連の実験の全体的な目的は、熱を用いて植物宿主細胞タンパク質を沈殿させることです。これにより、その後の組換えバイオ医薬品タンパク質のクロマトグラフィー精製が容易になります。この手法は、例えば宿主プロテアーゼの活性化などを防ぐことで、プロセス開発の効率化や製品の安定性向上に寄与します。

この手法の主な利点は、既存のプロテアーゼに容易に導入でき、異なる標的タンパク質に迅速に適応させることが可能である点です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程学生であるHannah Gruchowが行います。宿主細胞タンパク質を熱沈殿させます。

例えばタバコ葉を用いる場合です。本文のプロトコルに従ってタバコ植物を培養した後、断熱性のポリスチレンフォームバケツに容量8リットルのウォーターバスを設置します。この装置全体をマグネチックスターラーの上に載せ、ウォーターバスの中に撹拌子を入れます。

次に、スターバーを非磁性支持タイルで囲み、タイルがスターバーより約1cm高くなるようにします。このタイルの上に、後の手順でポリプロピレンバスケットを配置します。ウォーターバスに8Lのバッファーを加えます。

次に、23 × 23 × 23 cmのポリプロピレン製バスケットを支持タイルの上に置きます。この際、支持部がスターバーの回転を妨げていないこと、およびバスケットが液体に完全に浸かっていることを確認してください。その後、バスケットを取り出します。

調整可能なサーモスタットを使用して、ウォーターバスを70°Cに加熱します。設定温度に達した後、装置全体が熱平衡状態になるまで、少なくとも15分間待ちます。次に、タバコ葉から150gずつ分注して準備します。

葉に不可逆的な圧縮や、引き裂きなどの損傷を与えないように注意しながら、1アリコートをバスケットに入れます。バスケットを熱い液体の中に注意深く、かつ迅速に浸し、サポートタイルの上に置きます。

次に、浮き上がりを防ぐためにバスケットの上にステンレス製ブロックを置きます。葉をブランチング液中で5分間インキュベートします。または、実験計画に適した時間を選択してください。

インキュベーション期間中、液温を常に監視してください。インキュベーション後、バスケットをブランチング液から慎重に取り出し、葉の水気を30秒間切らせます。その後、バスケットから植物の葉を取り出してブレンダーに移し、テキストプロトコルに従って直ちに抽出を開始してください。

撹拌容器内でHCPsの加熱沈殿を行う。ウォーターバスをマグネチックスターラーの上に載せ、2Lのステンレス製容器の中心がスターラーの中心に合うようにウォーターバス内に設置する。ステンレス製容器にマグネチックスターバーを入れる。

容器に抽出バッファーを満たします。次に、脱イオン水を加えます。ウォーターバスに、ステンレス製容器の上端から5 cm下の位置まで水を満たします。

ポリスチレンフォーム製の蓋で容器を覆います。次に、蓋の穴からステンレス製容器の中に温度計を挿入します。その後、恒温水槽の温度を78 °Cに設定し、装置全体を15分間インキュベートして熱平衡状態にします。

装置が平衡状態に達したら、容器を空にし、ウォーターバスに入れたままの状態で抽出液300 millilitersを容器に注ぎ、タイマーを開始します。150 rpmで攪拌しながら5分間インキュベートしてください。インキュベーション期間中、抽出液の温度が70 degrees Celsiusに少なくとも2分間到達することを確認してください。

インキュベーション後、マグネチックスターラーから温浴を取り出します。ステンレス製容器を取り出し、氷水を入れたバケットに入れます。その後、バケットをスタープレートの上に置きます。

植物ホモジネートを150 rpmで十分に攪拌してください。抽出液に温度計を挿入し、20 °Cまたは指定の温度に達するまでインキュベートします。テキストプロトコルに従って作動容量8 Lの水槽を2台準備し、1台目の水槽に脱イオン水を満たしてください。

サーモスタットを74.5 °Cに設定し、熱平衡に達するまでアセンブリを15分間インキュベートします。1 Lのプラスチックビーカーに0.5 Lのプラスチックビーカーを入れることで、断熱保存容器を準備します。そして、隙間を埋めるために脱脂綿などの断熱材を使用してください。

LS24チューブを使用して、熱交換器の一端をペリスタルティックポンプに、もう一端を流出ホースに接続します。両端のチューブと温度計を断熱保存容器に入れ、抽出バッファーを300 millilitersまで満たします。

次に、熱交換器を温水バスに入れ、ペリスタルティックポンプを 300 milliliters per minute の速度で始動させます。3分後、容器内の温度が 70 °C になっていることを確認してください。これは温水バスの設定温度よりも約 4.5 °C 低い温度です。

断熱容器から抽出緩衝液を廃棄し、植物抽出液を300 mLずつ分注して準備します。次に、分注した抽出液の1つを用いて断熱容器を満たします。その後、植物抽出液を300 mL/minの流速で5分間、熱交換器に通します。

次に、3分後に抽出液の温度が70°Cになっているか、または実験計画で指定された温度に達していることを確認してください。5分後、熱交換器を氷冷水浴に移します。次の工程に進む前に、抽出液の温度が30°C以下であることを確認してください。

ペリスタルティックポンプに接続された入口ホースを断熱容器から取り出します。そのままポンプの運転を続け、熱交換器内部に残っている熱沈殿植物抽出液を回収します。その後、ポンプを停止させます。

植物抽出物のバッグろ過を行うには、フィルターハウジングに装着された対応するサポートバスケットにバッグフィルターを取り付けます。バスケットの下に1リットルの容器を置き、抽出液のアリコートを毎分150ミリリットルの速度でバッグに加えます。ろ過後、抽出バッファーで1～10倍に希釈したろ液の濁度を濁度計で測定します。

1 mLのサンプルを分注し、バッグろ過液を処理します。例えば、深層ろ過やクロマトグラフィーを用いて行います。その後、テキストのプロトコルに従ってサンプルをさらに分析します。

ブランチングによるホスト細胞タンパク質の熱沈殿により、全可溶性タンパク質（TSP）は96±1%減少しました。ブランチングでは、DsRedの最大83±1%およびVax8標的タンパク質の51%が回収されました。これにより、クロマトグラフィー分離前の純度が0.1%から1.2%に向上しました。

63 °Cを超えるブランチング温度では、ろ過能が低下しました。これは、タンパク質抽出後に凝集剤を添加し、バッグろ過後にろ過助剤を添加することで対処可能です。熱沈殿用の撹拌槽では、最大で84 ± 1 %のHCPsが除去されました。

Vax8で0.33 ± 0.02%、DsRedで20.2 ± 1.4%の純度を達成した。ブランチングおよび熱交換器を用いたセットアップとは対照的に、容器内でのHCP沈殿により、後続のデプスろ過の処理能力が2.5倍向上した。これは、抽出液を熱交換器でポンプ輸送したり、ブランチング後にホモジナイズしたりする場合と比較して、容器内でのせん断力が低いためであると考えられる。

60から70 °Cの熱交換器を用いることで、抽出液からHCP含有量の約88.3 ± 0.7 %が一貫して除去されました。その結果、純度はVax8で0.31 ± 0.01 %、DsRedで27.6 ± 2.0 %に達しました。

最終的に、熱交換器はダウンストリーム深度フィルター容量においても最低値を記録しました。目詰まりが発生するまでにろ過できた量は、わずか13.5 ± 6.0 liters per square meterでした。この手法を習得し、適切に実施すれば、サンプルの準備時間を除いて50分未満で完了させることができます。

本手法を試みる際は、標的タンパク質が熱安定性であることを確認することが重要です。本手順に続いて、クロマトグラフィーなどの他の手法を実施することで、産物を必要なレベルまでさらに精製することが可能です。本技術の開発により、植物分野の研究者は、ワクチン候補タンパク質およびNicotiana属の精製を探索するための技術的手法を得ることとなりました。

このビデオを視聴することで、ブランチング、攪拌槽、または熱交換器を用いて植物宿主細胞タンパク質を沈殿させる方法について十分に理解できるはずです。