Name: 無傷の植物をブランチングすることによって、または抽出物の熱処理によりタバコ宿主細胞タンパク質の除去方法の比較 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶ タバコ抽出物から90%以上の宿主細胞タンパク質を熱沈殿で除去する方法。ブランチング、攪拌槽、熱交換器の3手法を比較し、後続のクロマトグラフィー精製を効率化する技術です。

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私たちは、トランスジェニックタバコの種子を提供してくださったトーマス・ラデマッハー博士、アレクサンダー・ボーズさん、ヴェロニク・ベイスさん、そしてタバコ植物の栽培に携わってくださったイブラヒム・アル・アメディさんに感謝します。著者は、編集支援をしてくださった Richard M. Twyman 博士と、MSP1-19 のリファレンスを提供してくださった Güven Edgü に感謝します。この研究は、欧州研究会議のアドバンスドグラント「Future-Pharma」(提案番号269110)、フラウンホーファー未来財団、およびフラウンホーファー研究機構の内部プログラム(助成金番号)によって部分的に資金提供されました。125-600164を引き付けます。

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<li>Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+downstream+processing+of+plant-derived+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).</li>
<li>Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+and+purification+of+plant-made+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Recovery and purification of plant-made recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-down+models+to+optimize+a+filter+train+for+the+downstream+purification+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves.</a> Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flocculation+increases+the+efficacy+of+depth+filtration+during+the+downstream+processing+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose-based+filter+aids+increase+the+capacity+of+depth+filters+during+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins.</a> Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+chromatography-based+purification+strategies+accelerate+the+development+of+downstream+processes+for+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants.</a> Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+quantitative+structure-activity+relationship+models+to+develop+optimized+processes+for+the+removal+of+tobacco+host+cell+proteins+during+biopharmaceutical+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production.</a> J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).</li>
<li>Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine+precipitation+versus+anion+exchange+chromatography+in+fractionating+recombinant+beta-glucuronidase+from+transgenic+tobacco+extract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract.</a> J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants%3A+the+pros+and+cons+of+flocculants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants.</a> Bioengineered. 5, 138-142 (2014).</li>
<li>Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+extraction+of+monoclonal+antibodies+targeted+to+different+subcellular+compartments+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).</li>
<li>Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyclonal+antibodies+can+effectively+detect+tobacco+host+cell+proteins+after+RuBisCO+depletion+and+endotoxin+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal.</a> Biotechnol. J. , (2015).</li>
<li>Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+host+cell+protein+heat+precipitation+step+simplifies+the+subsequent+purification+of+recombinant+proteins+from+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Eng.+J%22%5BJournal%5D)">Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco.</a> Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+juice+extractor+can+simplify+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins+compared+to+blade-based+homogenizers%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers.</a> Process Biochem. 50, 859-866 (2014).</li>
<li>Beiss, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-precipitation+allows+the+efficient+purification+of+a+functional+plant-derived+malaria+transmission-blocking+vaccine+candidate+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein.</a> Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).</li>
<li>Ma, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+approval+and+a+first-in-human+phase+I+clinical+trial+of+a+monoclonal+antibody+produced+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).</li>
<li>Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postharvest+treatments+of+fresh+produce%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+T+R+Soc+A%22%5BJournal%5D)">Postharvest treatments of fresh produce.</a> Philos T R Soc A. 372, (2014).</li>
<li>Menzel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+blanching+reduces+the+host+cell+protein+content+and+substantially+enhances+the+recovery+and+stability+of+two+plant+derived+malaria+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates.</a> Front. Plant Sci. , (2015).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+complex+systems+using+the+design+of+experiments+approach%3A+transient+protein+expression+in+tobacco+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study.</a> J. Vis. Exp. , e51216(2014).</li>
<li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+to+evaluate+the+efficiency+of+flocculants+for+the+removal+of+dispersed+particles+from+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts.</a> J. Vis. Exp. , e53940(2016).</li>
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<li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter%2F5%27UTR+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).</li>
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<li>Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+behavior+of+proteins%3A+Heat-resistant+proteins+and+their+heat-induced+secondary+structural+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-Us%22%5BJournal%5D)">Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes.</a> Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).</li>
<li>Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+heat-stable+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Bmb+Rep%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli.</a> Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).</li>
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<li>Lowe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation%2C+stability%2C+and+formulation+of+human+antibody+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+protein+chemistry+and+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics.</a> Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).</li>
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著者らは、開示する利害の競合がありません。

上記の熱沈殿のための3つの方法が効果的に任意のクロマトグラフィー精製ステップ16,17の前にタバコのHCPを削除することができます。彼らは、分泌タンパク質に限定されているすべてのそれらの初期生成物の純度を高めることを目指して他の戦略、 例えば、排水29、rhizosecretion 30または遠心抽出31,32を 、補完します。標的タンパク質は、以上1分〜60°Cの最低沈殿温度に耐えることができる精製される場合は、熱ベースの方法は、唯一の意味のある方法で使用することができます。したがって、3つの方法のいずれかの最初のステップは、いくつかの熱帯熱マラリア原虫抗原異なるドメイン16,18,21からなるいくつかのマラリアワクチン候補タンパク質について記載されている、十分に高い融解温度を有する標的分子を設計することです。標的タンパク質の熱安定性が実証された後、あります三つの方法で利用可能な機器とメディア、予想される最終的なプロセススケールおよびその後のDSP演算16に基づいて選択...

現代の医療システムは、ますますバイオ医薬品タンパク質1に依存しています。植物におけるこれらのタンパク質を産生することは、従来の発現系2-4と比較して、低い病原体負荷とスケーラビリティに有利で ​​す。破壊的な抽出手順は5,000比濁分析濁度単位（NTUs）を超える濁度、及び宿主細胞タンパク質（HCP）濃度は、多くの場合、95を超えると、高い粒子負荷をもたらすしかし、植物由来の医薬品の下流の処理（DSP）は、挑戦することができ％[メートル/メートル] 5,6。 精巧な浄化手順は、分散粒子7-9を削除する必要があります。ただし、クロマトグラフィー装置はのHCP 10,11を効率的に除去するための以前のステップがある場合、最初の製品の回収時にバインドおよび溶出モードで動作するように安価であるされています。これはflocculを使用して標的タンパク質を沈殿させることによってのいずれかで達成することができますアリ12または低pH 13,14、ならびにのHCPが凝集させることもできます。リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（のRuBisCO）の選択的な凝集は、例えば、タバコ（ タバコ ）などの緑色植物の中で最も豊富なHCPは、ポリエチレングリコール15を追加することによって促進することができるが、これは高価であり、大規模なと互換性がありません-scale製造。例えばVax8などのタンパク質のマラリアワクチン候補は、溶液中で安定16-18まま熱処理は、タバコのHCPの95％以上を変性し、沈殿させることが示されています。 （I）ブランチング、 すなわち、高温の液体中の無傷の葉の浸漬、（ii）の温度制御撹拌容器、および（iii）熱交換器（：三つの異なるアプローチがタバコのHCPの熱誘導沈殿を達成するために使用しました。 図1）16。無傷の葉のために、ブランチングは、のHCPの迅速かつ効率的な降水量を達成し、また簡単でしたスケールアップと植物バイオマス19を洗浄するための最初のステップを含む、既存の大規模製造プロセスに適合します。対照的に、温度制御された血管は、既にいくつかのプロセスで利用可能であり、タンクの表面対体積比が徐々に低下するため、プラントの熱処理20を抽出し 、それらのスケーラビリティとエネルギー移動速度が制限されるために使用することができるとプロセスのスケールで適さなくなります。熱交換器は、撹拌容器を加熱するために技術的に明確に定義された代替手段であるが豊富な加熱の供給およびメディア、 例えば、蒸気、冷水、冷却、ならびに熱交換器の形状に適合されている厳密に制御体積流量を必要としメディアの特性、 例えば 、特定の熱容量。この記事では、すべての3つの方法が一般的にタバコのHCP、および植物のHCPの熱による沈殿のために使用することができる方法を示しています。 EACの設立と運営実験室の設定における時間法は、大規模なプロセスのためのそれらの適合性を評価するために使用することができます。主要な課題は、プロセス規模製造中に使用されるデバイスおよび条件に似ている各操作に対して十分な縮小モデルと運転条件を識別することです。ここに提示したデータは、マラリアワクチン候補Vax8を発現するトランスジェニックタバコ植物を用いて行った実験を参照し、蛍光タンパク質は、16のDsRedが、方法はまた、成功裏にNに適用されていますbenthamiana植物は一過他のバイオ医薬品タンパク質21を発現しています 。 デザイン・オブ・実験（DOE）アプローチ22は、プロセスの開発を容易にすることができ、以前8に記載のように凝集剤23もまた、この状況において有益であり得ます。ブランチング、加熱された容器と熱交換器との間の主な違いは、ブランチングは、初期のOT一方過程で無傷の葉に適用されることです彼女は、植物抽出物（ 図1）に適用されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54343/54343fig1.jpg" /> 図1： タバコHCP熱降水のための3つの異なる方法の実施例を示すプロセスフロースキームは、植物材料を洗浄し、明確化し、精製前の均質化されています。ブランチング工程（赤色）のための装置は、容易に既存の機械に追加することができます。これとは対照的に、攪拌容器（橙）、特に熱交換器（青）を使用して、1つまたはいくつかの追加の機器や配管を必要とします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54343/54343fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>2100P携帯用濁度計</td><td>Hach</td><td>4650000</td>の<td>濁度計</td></tr><tr><td>のアミンのカップリングのキット</td><td>GEのヘルスケア</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>SPRチップカップリングキット</td></tr><tr><td>オートクレーブバスケット</td><td>Nalgene</td><td>6917-0230</td><td>葉のブランチング用バスケット</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td>SPRデバイス</td></tr><tr><td>バイオセルアナライザー BCA 003 R&D with 3D ORM</td><td>Sequip</td><td>n.a.Particle</td> <td>size analyzer</td></tr><tr><td></td><td>Blender Waring</td><td>800EG</td><td>Blender</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>Bag filter</td></tr><tr><td>Centrifuge 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Centrifuge Centrifuge</td></tr><tr><td>Tube 15 ml</td><td>Labomedic</td><td>2017106</td><td>Reaction tube</td></tr><tr><td>Centrifuge tube 50 ml self-standing</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>Reaction tube</td></tr><tr><td>CM5チップ</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012&nbsp;</td><td>SPR測定用チップ</td></tr><tr><td>キュベット 10 x 10 x 45</td><td>Sarsted</td><td>67.754</td><td>Zetasizer Nano ZS 用キュベット</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>&nbsp;4984.3&nbsp;</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>Ferty 2</td>メガ<td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td></td></tr>肥料<tr><td>Forma -86C ULT冷凍庫</td><td>サーモフィッシャー88400</td><td></td>冷凍<td>庫</td></tr><tr><td>温室</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td>植物栽培用</td></tr><tr><td>グローダンロックウールキューブ 10 x 10 cm</td><td>グローダン</td><td>102446</td><td>ロックウールブロック</td></tr><tr><td>トゥエンティーループ熱交換器(4.8 mの長さ)</td><td>n.a. (カスタムデザイン)</td><td>n.a.Heat</td><td>交換器</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>K200P 60D</td><td>ポール</td><td>5302303</td><td>デプスフィルター層</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>ポール</td><td>B12486</td><td>デプスフィルター層</td></tr><tr><td>ラウダ E300</td><td>ラウダ博士 Wobser GmbH</td><td>Z90010</td><td>ウォーターバスサーモスタット</td></tr><tr><td>L/S 24</td><td>Masterflex</td><td>SN-06508-24</td><td>チューブ</td></tr><tr><td>mAb 5.2</td><td>American Type Culture Collection</td><td>HB-9148</td><td>Vax8 specific antibody</td></tr><tr><td>Masterflex L/S</td><td>Masterflex</td><td>HV-77921-75</td><td>蠕動ポンプ</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R</td><td>ろ布</td></tr><tr><td>MultiLine Multi 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020</td><td>pH meter / conductivity meter</td></tr><tr><td>Osram cool white 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>光源</td></tr><tr><td>Phytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.For</td> <td>plant cultivation:</td></tr><tr><td>二亜硫酸ナトリウム</td>, <td>Carl Roth GmbH</td><td>8554.1</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>培地部品</td></tr><tr><td>ステンレス製容器; 0.7 kg 2.0 L; 高さ 180 mm; 直径 120 mm</td><td>n.a. (カスタムデザイン)</td><td>n.a.</td><td>熱沈殿用容器</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>蛍光および分光プレートリーダー</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>ポール</td><td>VP60G03KNH4</td><td>フィルターハウジング</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>DLS 粒度分布測定</td></tr><tr><td>Zetasizer ソフトウェア v7.11</td><td>Malvern</td><td>n.a.Zetasizer</td> <td>Nano ZS デバイスを操作するためのソフトウェア</td></tr></tbody></table>

無傷の植物をブランチングすることによって、または抽出物の熱処理によりタバコ宿主細胞タンパク質の除去方法の比較

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

植物は人間のための食品、飼料、原材料を提供するだけでなく、このような抗体、ワクチン候補と酵素などのバイオ医薬品タンパク質、のための経済的な生産システムとして開発されているだけではなく。これらは、植物バイオマスから精製されなければならないが、クロマトグラフィー工程は、植物抽出物中の宿主細胞タンパク質（のHCP）の高濃度によって妨げられます。しかし、ほとんどののHCPは、不可逆的に、標的タンパク質のその後の精製を容易にする60℃以上の温度で凝集します。ここでは、3つの方法は、無傷の葉または抽出物のいずれかでタバコのHCPの熱沈殿を達成するために提示されます。無傷の葉のブランチングを容易に既存のプロセスに組み込むことができるが、その後の濾過工程に悪影響を与えることができます。反対は、次のようなプロセス装置の設計に大きな変化、とはいえ下流操作のパフォーマンスを向上させることができ、撹拌容器、中葉抽出物の熱沈殿のために真でありますホモジナイザージオメトリ。最後に、熱交換器の設定は、熱伝達条件および拡張が容易という点で十分に特徴付けられているが、洗浄が困難であることができ、フィルタの能力に負の影響があってもよいです。デザイン・オブ・実験アプローチは、HCPの除去および生成物回収に影響を与える最も関連するプロセスパラメータを識別するために使用することができます。これは、他の発現プラットフォーム内の​​各メソッドと与えられた精製戦略に最も適した方法の特定のアプリケーションを容易にします。

ブランチングによってタバコ宿主細胞タンパク質の熱沈殿 項2に記載のブランチング手順が成功したタバコは96±1％TSPを減らす、70°Cでの葉からのHCPを沈殿させるために使用した（N = 3）従って、Vax8標的タンパク質の51％まで回復し、そのを増加させながらクロマトグラフィー分離16前の0.1％から1.2％まで純度。それ64.1％と3.3％の純度を増加させる、蛍光タンパク質DsRedの83±1％（n = 3）を回収することも可能でした。ブランチング手順は簡単バイオマス洗浄、均質化、袋濾過および深層濾過からなる標準的な抽出と明確化スキーム（ 図1）7に統合されました。ブランチング機器を準備する（ 図2）は、日常的に20分を要し清澄化するデバイスには、設定時間に約5分を追加しました。別の7分を実行するのに必要とされました45分の典型的な抽出と明確化の時間に加えて、無傷の葉のブランチング。しかし、追加の7分の唯一の2分は、実際の「ハ...

三熱沈殿法は、効果的に前に他の精製工程にタバコ抽出物から、宿主細胞タンパク質（のHCP）の90％以上を除去することが示されています。植物のHCPは、不可逆的に60℃以上の温度で凝集します。

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

この一連の実験の全体的な目的は、熱を用いて植物宿主細胞タンパク質を沈殿させることです。これにより、その後の組換えバイオ医薬品タンパク質のクロマトグラフィー精製が容易になります。この手法は、例えば宿主プロテアーゼの活性化などを防ぐことで、プロセス開発の効率化や製品の安定性向上に寄与します。この手法の主な利点は、既存のプロテアーゼに容易に導入でき、異なる標的タンパク質に迅速に適応させることが可能である点です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程学生であるHannah Gruchowが行います。宿主細胞タンパク質を熱沈殿させます。例えばタバコ葉を用いる場合です。本文のプロトコルに従ってタバコ植物を培養した後、断熱性のポリスチレンフォームバケツに容量8リットルのウォーターバスを設置します。この装置全体をマグネチックスターラーの上に載せ、ウォーターバスの中に撹拌子を入れます。次に、スターバーを非磁性支持タイルで囲み、タイルがスターバーより約1cm高くなるようにします。このタイルの上に、後の手順でポリプロピレンバスケットを配置します。ウォーターバスに8Lのバッファーを加えます。次に、23 × 23 × 23 cmのポリプロピレン製バスケットを支持タイルの上に置きます。この際、支持部がスターバーの回転を妨げていないこと、およびバスケットが液体に完全に浸かっていることを確認してください。その後、バスケットを取り出します。調整可能なサーモスタットを使用して、ウォーターバスを70°Cに加熱します。設定温度に達した後、装置全体が熱平衡状態になるまで、少なくとも15分間待ちます。次に、タバコ葉から150gずつ分注して準備します。葉に不可逆的な圧縮や、引き裂きなどの損傷を与えないように注意しながら、1アリコートをバスケットに入れます。バスケットを熱い液体の中に注意深く、かつ迅速に浸し、サポートタイルの上に置きます。次に、浮き上がりを防ぐためにバスケットの上にステンレス製ブロックを置きます。葉をブランチング液中で5分間インキュベートします。または、実験計画に適した時間を選択してください。インキュベーション期間中、液温を常に監視してください。インキュベーション後、バスケットをブランチング液から慎重に取り出し、葉の水気を30秒間切らせます。その後、バスケットから植物の葉を取り出してブレンダーに移し、テキストプロトコルに従って直ちに抽出を開始してください。撹拌容器内でHCPsの加熱沈殿を行う。ウォーターバスをマグネチックスターラーの上に載せ、2Lのステンレス製容器の中心がスターラーの中心に合うようにウォーターバス内に設置する。ステンレス製容器にマグネチックスターバーを入れる。容器に抽出バッファーを満たします。次に、脱イオン水を加えます。ウォーターバスに、ステンレス製容器の上端から5 cm下の位置まで水を満たします。ポリスチレンフォーム製の蓋で容器を覆います。次に、蓋の穴からステンレス製容器の中に温度計を挿入します。その後、恒温水槽の温度を78 °Cに設定し、装置全体を15分間インキュベートして熱平衡状態にします。装置が平衡状態に達したら、容器を空にし、ウォーターバスに入れたままの状態で抽出液300 millilitersを容器に注ぎ、タイマーを開始します。150 rpmで攪拌しながら5分間インキュベートしてください。インキュベーション期間中、抽出液の温度が70 degrees Celsiusに少なくとも2分間到達することを確認してください。インキュベーション後、マグネチックスターラーから温浴を取り出します。ステンレス製容器を取り出し、氷水を入れたバケットに入れます。その後、バケットをスタープレートの上に置きます。植物ホモジネートを150 rpmで十分に攪拌してください。抽出液に温度計を挿入し、20 °Cまたは指定の温度に達するまでインキュベートします。テキストプロトコルに従って作動容量8 Lの水槽を2台準備し、1台目の水槽に脱イオン水を満たしてください。サーモスタットを74.5 °Cに設定し、熱平衡に達するまでアセンブリを15分間インキュベートします。1 Lのプラスチックビーカーに0.5 Lのプラスチックビーカーを入れることで、断熱保存容器を準備します。そして、隙間を埋めるために脱脂綿などの断熱材を使用してください。LS24チューブを使用して、熱交換器の一端をペリスタルティックポンプに、もう一端を流出ホースに接続します。両端のチューブと温度計を断熱保存容器に入れ、抽出バッファーを300 millilitersまで満たします。次に、熱交換器を温水バスに入れ、ペリスタルティックポンプを 300 milliliters per minute の速度で始動させます。3分後、容器内の温度が 70 °C になっていることを確認してください。これは温水バスの設定温度よりも約 4.5 °C 低い温度です。断熱容器から抽出緩衝液を廃棄し、植物抽出液を300 mLずつ分注して準備します。次に、分注した抽出液の1つを用いて断熱容器を満たします。その後、植物抽出液を300 mL/minの流速で5分間、熱交換器に通します。次に、3分後に抽出液の温度が70°Cになっているか、または実験計画で指定された温度に達していることを確認してください。5分後、熱交換器を氷冷水浴に移します。次の工程に進む前に、抽出液の温度が30°C以下であることを確認してください。ペリスタルティックポンプに接続された入口ホースを断熱容器から取り出します。そのままポンプの運転を続け、熱交換器内部に残っている熱沈殿植物抽出液を回収します。その後、ポンプを停止させます。植物抽出物のバッグろ過を行うには、フィルターハウジングに装着された対応するサポートバスケットにバッグフィルターを取り付けます。バスケットの下に1リットルの容器を置き、抽出液のアリコートを毎分150ミリリットルの速度でバッグに加えます。ろ過後、抽出バッファーで1～10倍に希釈したろ液の濁度を濁度計で測定します。1 mLのサンプルを分注し、バッグろ過液を処理します。例えば、深層ろ過やクロマトグラフィーを用いて行います。その後、テキストのプロトコルに従ってサンプルをさらに分析します。ブランチングによるホスト細胞タンパク質の熱沈殿により、全可溶性タンパク質（TSP）は96±1%減少しました。ブランチングでは、DsRedの最大83±1%およびVax8標的タンパク質の51%が回収されました。これにより、クロマトグラフィー分離前の純度が0.1%から1.2%に向上しました。63 °Cを超えるブランチング温度では、ろ過能が低下しました。これは、タンパク質抽出後に凝集剤を添加し、バッグろ過後にろ過助剤を添加することで対処可能です。熱沈殿用の撹拌槽では、最大で84 ± 1 %のHCPsが除去されました。Vax8で0.33 ± 0.02%、DsRedで20.2 ± 1.4%の純度を達成した。ブランチングおよび熱交換器を用いたセットアップとは対照的に、容器内でのHCP沈殿により、後続のデプスろ過の処理能力が2.5倍向上した。これは、抽出液を熱交換器でポンプ輸送したり、ブランチング後にホモジナイズしたりする場合と比較して、容器内でのせん断力が低いためであると考えられる。60から70 °Cの熱交換器を用いることで、抽出液からHCP含有量の約88.3 ± 0.7 %が一貫して除去されました。その結果、純度はVax8で0.31 ± 0.01 %、DsRedで27.6 ± 2.0 %に達しました。最終的に、熱交換器はダウンストリーム深度フィルター容量においても最低値を記録しました。目詰まりが発生するまでにろ過できた量は、わずか13.5 ± 6.0 liters per square meterでした。この手法を習得し、適切に実施すれば、サンプルの準備時間を除いて50分未満で完了させることができます。本手法を試みる際は、標的タンパク質が熱安定性であることを確認することが重要です。本手順に続いて、クロマトグラフィーなどの他の手法を実施することで、産物を必要なレベルまでさらに精製することが可能です。本技術の開発により、植物分野の研究者は、ワクチン候補タンパク質およびNicotiana属の精製を探索するための技術的手法を得ることとなりました。このビデオを視聴することで、ブランチング、攪拌槽、または熱交換器を用いて植物宿主細胞タンパク質を沈殿させる方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

アグロバクテリウムは、（タバコモザイクウイルスベース）の起動ベクタを運ぶと真空浸透に基づいてタバコ植物での一過性のタンパク質生産は、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を生産するための迅速かつ経済的なアプローチです。我々は、手順を簡略化し、細菌培養の条件を最適化する宿主種の選択、RNAサイレンシング抑制因子を共導入することにより、目標蓄積を改善した。...

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

我々は、植物におけるモノクローナル抗体およびレポータータンパク質の一過性発現に対する導入遺伝子の調節エレメント、植物の成長および発達パラメータ、およびインキュベーション条件の影響を決定し、モデル化するのに使用することができる実験アプローチの設計を記載している。...

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

標的タンパク質分解は、細胞機能の主要な調節機構を表す。その後、26Sプロテアソームのために、分子「タグ」を提供する標的タンパク質にユビキチン鎖が付加し保存され、ユビキチン-プロテアソーム経路を介して行われます。ここでは、タンパク質のプロテアソーム分解のための、シンプルで信頼性の高い無細胞アッセイを記述します。...

植物では無細胞系でプロテアソームによる分解をアッセイ

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。...

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。...

組換えセルラーゼCEL5Aの式から<em&gt;トリコデルマ·</em&gt;タバコ植物における

最適化されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)ex...

可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

この研究では、異なる生産プラットフォームにおける標的ヒト組換えタンパク質の発現が比較されました。私たちは、従来の発酵槽ベースの培養物と植物に焦点を当て、各システムのセットアップを説明し、報告された結果に基づいて、各プラットフォームに固有の制限と利点を強調しました。...

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。...

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

この手順では、DsRedベースのエピトープリガンドが固定化され、タンパク質Aの代替として、粗植物抽出物または細胞培養上清からのモノクローナル抗体の捕捉のための高選択的親和性樹脂を産生する。...

アフィニティクロマトグラフィー樹脂の急速な発達のための活性化架橋アガロース - ケーススタディとしての抗体捕捉

ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

ここでは、苗木における Phytophthora nicotianae...

フィトフトラ・ニコチアナエ耐性に対するタバコ遺伝子型のスクリーニング

学ぶ タバコ抽出物から90%以上の宿主細胞タンパク質を熱沈殿で除去する方法。ブランチング、攪拌槽、熱交換器の3手法を比較し、後続のクロマトグラフィー精製を効率化する技術です。

無傷の植物をブランチングすることによって、または抽出物の熱処理によりタバコ宿主細胞タンパク質の除去方法の比較

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