Name: 自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶEAEマウスモデルを用いた薬理学的介入による免疫細胞浸潤抑制と神経保護効果の区別方法。フローサイトメトリーと組織イメージングでT細胞動態とグリア細胞を解析し、多発性硬化症治療薬開発への洞察を得ます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

一般的な寄付基金、国立 - この作品は、国立多発性硬化症SocietyRG 4587-A-1、Civitan国際研究財団、マイク・L. Jezdimir横断性脊髄炎財団、アラバマ州保健財団の大学NINDS P30-NS069324によって賄われていました国立アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所からの科学財団1355183、およびT32 AI007051。

<ol><li>Teitelbaum, D., Meshorer, A., Hirshfeld, T., Arnon, R., Sela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+a+synthetic+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide.</a> Eur J Immunol. 1, 242-248 (1971).</li>
<li>Yednock, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+antibodies+against+alpha+4+beta+1+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin.</a> Nature. 356, 63-66 (1992).</li>
<li>Ridge, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+mitoxantrone%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology+and+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by mitoxantrone.</a> Clinical immunology and immunopathology. 35, 35-42 (1985).</li>
<li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 60, 12-21 (2006).</li>
<li>Kuerten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MP4-+and+MOG%3A35-55-induced+EAE+in+C57BL%2F6+mice+differentially+targets+brain%2C+spinal+cord+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">MP4- and MOG:35-55-induced EAE in C57BL/6 mice differentially targets brain, spinal cord and cerebellum.</a> J Neuroimmunol. 189, 31-40 (2007).</li>
<li>Brownell, B., Hughes, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+plaques+in+the+cerebrum+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The distribution of plaques in the cerebrum in multiple sclerosis.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 25, 315-320 (1962).</li>
<li>Kidd, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cortical lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 122 (Pt 1), 17-26 (1999).</li>
<li>Kutzelnigg, A., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+lesions+and+brain+atrophy+in+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+neurological+sciences%22%5BJournal%5D)">Cortical lesions and brain atrophy in MS.</a> Journal of the neurological sciences. 233, 55-59 (2005).</li>
<li>Geurts, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+lesions+in+multiple+sclerosis%3A+combined+postmortem+MR+imaging+and+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22AJNR+Am+J+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Cortical lesions in multiple sclerosis: combined postmortem MR imaging and histopathology.</a> AJNR Am J Neuroradiol. 26, 572-577 (2005).</li>
<li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing--remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130, 2816-2829 (2007).</li>
<li>Evonuk, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+System+Xc%28-%29+Transporter+Attenuates+Autoimmune+Inflammatory+Demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of System Xc(-) Transporter Attenuates Autoimmune Inflammatory Demyelination.</a> J Immunol. 195, 450-463 (2015).</li>
<li>Rowse, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+controls+central+nervous+system+autoimmunity+through+modulation+of+IFN-gamma+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lithium controls central nervous system autoimmunity through modulation of IFN-gamma signaling.</a> PloS one. 7, e52658(2012).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Naive+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>McWilliams, I. L., Rajbhandari, R., Nozell, S., Benveniste, E., Harrington, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT4+controls+GM-CSF+production+by+both+Th1+and+Th17+cells+during+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">STAT4 controls GM-CSF production by both Th1 and Th17 cells during EAE.</a> J Neuroinflammation. 12, 128(2015).</li>
<li>Legoux, F. P., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide%3AMHC+tetramer-based+enrichment+of+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Law, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Foxp3+antibody+and+fixation%2Fpermeabilization+buffer+combinations+in+identifying+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75, 1040-1050 (2009).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth.</a> Current protocols in immunology. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Korn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-specific+regulatory+T+cells+accumulate+in+the+CNS+but+fail+to+control+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation.</a> Nature medicine. 13, 423-431 (2007).</li>
<li>Pierson, E. R., Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+promote+induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+facilitating+reactivation+of+T+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">B cells promote induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by facilitating reactivation of T cells in the central nervous system.</a> Journal of immunology. 192, 929-939 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England journal of medicine. 358, 676-688 (2008).</li>
<li>Bar-Or, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%3A+a+72-week%2C+open-label%2C+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial.</a> Ann Neurol. 63, 395-400 (2008).</li>
<li>Kappos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%3A+a+phase+2%2C+randomised%2C+placebo-controlled%2C+multicentre+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, placebo-controlled, multicentre trial.</a> Lancet. 378, 1779-1787 (2011).</li>
<li>Berer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+microbiota+and+myelin+autoantigen+cooperate+to+trigger+autoimmune+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination.</a> Nature. 479, 538-541 (2011).</li>
<li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system%3A+host-virus+stand-off%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li>
<li>Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+role+for+virus-specific+CD4+T+cells+in+mice+with+coronavirus-induced+acute+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis.</a> The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

MS患者は直接的にCNSを保護する治療選択肢の開発を正当化、CNSへのT細胞活性化および/または浸潤を減衰させる薬物を服用しながら、疾患の再発を経験し続けます。 EAEは、古典的MSの症状をモデル化するために使用され、 インビボで免疫系と中枢神経系との間の相互作用の性質を研究する際に強力なツールであることができます。 EAEにおいて治療上の考慮事項のタイミング、 例えば 、使用することは、疾患の開始前または後に、周囲にCNSにおける免疫細胞浸潤を調べ、増殖および活性化に関連して、免疫系の両方での処置の効果を描写することが可能であるとCNS。 C57BL / 6マウスにおけるEAEは、より広く利用されているが、これらのマウスは、実質における再発寛解型の表現型と免疫細胞の浸潤を持っているとして、SJLマウスにおけるEAEは、MSの症例の大部分をより表すことができます脳10の。 SJLマウスは、疾患が提示した後、それが可能な治療を開始することが、減少の炎症の時代に、ならびに寛解の間に明確な回復を持っています。 SJLマウスは、常に結果がプールされたときに、潜在的に大きなばらつきが生じ、同期して再発し、送金しないことを考慮することが重要です。そのため、一部の研究者は、疾患の進行に個別のポイントでFACS分析および組織学のためのマウスをしながら1動物から臨床スコアのための代表的な結果を示すことを選ぶことができます。 操作がEAEマウスに行われた場合を考慮すると、治療は免疫系や中枢神経系にどのように影響するかの決意を支援することができます。治療の開始時には多くのオプション、免疫細胞が中枢神経系に入っているとどのように彼らはCNSと対話することができるかどうかのために、独自的な意味合いを持つそれぞれがあります。症状の発症前に治療は、免疫細胞がまだ入力またはCNSへの損傷を引き起こしていないことを意味します。症状の発症後の治療は、免疫細胞が中枢神経系に入っているし、いくつかの被害をもたらしていることを意味します。 SJLマウスを使用して、治療はまた、免疫細胞が活発に浸潤し、炎症を引き起こしている再発、中、または免疫細胞が少ない炎症とCNSであまり普及しているかもしれ寛解、中に開始することができます。免疫細胞が治療中に病理学的過程のどこにいるか検討する際の治療はCNSおよび免疫系にどのような影響を与えるかについて初期仮説を行うことができます。 治療は、免疫細胞及びCNS、EAE症状の重症度を軽減するの最終結果にそれぞれ影響を与えることができるいくつかの方法があります。したがって、免疫細胞のCNS入力したか否かを、周囲及びCNSに影響を受けるかの免疫細胞を見てフローサイトメトリー分析および免疫組織化学を使用する必要があり、CNSは、治療に反応する方法。脊髄のフローサイトメトリー分析はどのように多くの細胞ヘクタールを判断することができますが与えられた時間にCNSを入力VEの免疫細胞の増殖は、脾臓で影響されない場合を除き、1は、この効果は減少した免疫細胞の輸送によるものであることを判断することはできません。末梢および中枢神経系の両方の組織を分析し、両方の組織を比較した場合の結果は、機構的に何を意味するかを決定することが必要です。免疫細胞活性プロファイルが調節性T細胞重プロファイルに病原性のヘルパーT細胞重いプロファイルのスイッチを有し、例えば、処理することにより変更することも可能です。異なる細胞型のマーカーを見て、処置および未処置動物の間のパーセント発現を比較するためにも重要な考慮事項です。 MS研究における新興の概念は、B細胞が自己免疫性脱髄において重要な役割を果たすことを示唆しています。これは、B細胞がT細胞20の再活性化に必要であることを示す研究に基づいています。この概念は、リツキシマブなどの治療の成功は、CD20元に対する抗体によってサポートされていますB細胞21,22の表面に押されました。臨床試験におけるモノクローナル抗体のオクレリズマブの成功によって示されるように、CD20の異なるエピトープを標的とする薬剤は、B細胞標的治療薬23の有効性を改善することができます。 ここに提示された技術の1つの制限は、免疫細胞がCNSに入るが、実質に移動することができなくすることが可能であることです。免疫組織化学、免疫細胞の血管周囲カフィングを検出し、処理および未処理動物の間で実質に移動した距離を評価するために使用することができます。別の潜在的な制限は、EAEの病因にmicrobiomeの影響を伴います。共生腸内細菌叢は重く疾患の病因24に影響を与えることができます。したがって、別のコロニーに、さらに別のケージで飼育したマウスは、疾患の重症度の広大な違いを持つことができます。以下のために、同じケージで飼育同腹子対照を使用することが可能な場合したがって、それは常に好ましいです。EAEを含む実験。最後の注意は、末梢における免疫細胞増殖の変化の影響を排除するために、実験が望ましい場合、受動的伝達の誘導ではなく、このプロトコルに記載の活性誘導を使用してそうすることが可能であるということです。 神経保護のためのさらなる確認は、細胞死または細胞型に選択的にタンパク質の欠失を可能にする条件付きノックアウトマウスの使用を介して特定の機構を試験する共培養系11を用いて達成することができます。さらに、神経保護されている薬理学的薬剤の探索を拡張するために、軸索切断および神経細胞死のマーカーが含まれるべきです。重要性の別の領域は、再ミエリン化です。負傷軸索は神経保護療法は、再ミエリン化療法の重要な一部である必要があり、さらにサポートを貸し再ミエリン化することはできません。さらに、無髄軸索がmyelinaよりも傷害に対してより脆弱ですテッドの軸索。これは、軸索は軸索損傷を防ぐことができますタイムリーな再ミエリン化を促進する脱髄治療的介入になるとことを示唆しています。これらの道を探索するために、脱髄および再ミエリン化のために他のin vivoモデル（ すなわち 、クプリゾン及びリゾレシチン）を用いることができます。本明細書に記載される方法は、ミエリンの損失を定量することによって神経保護を評価することに焦点を当てました。再ミエリン化の評価のための前駆細胞の数、ならびに増殖および成熟する能力も調査することが重要であろう。これらの代替モデルの言及で、1はまた、ウイルスに媒介される脳炎の異なるモデルを考慮しなければなりません。ミエリン損失を生成する2つのよく特徴付けRNAウイルスのモデルがあります：1は、タイラーマウス脳脊髄炎、非エンベロープピコルナウイルスであり、他方はマウス肝炎ウイルス、コロナウイルス科25,26のメンバーです。 EAEは、STのための貴重なツールです。操作または治療は、生体内で免疫系と中枢神経系にどのような影響を与えるかのudies。ここで説明するプロトコルは、それが周辺部で、血液脳関門に、またはCNSにあるかどうか、治療は病気のプロセスに影響を与えている場所を判断するのに役立ちます。 MSのための現在の治療は、時間の経過とともに、多くの場合、経験の減少疾患患者を治すません。同様に、急性散在性脳脊髄炎、横断性脊髄炎、および視神経脊髄炎、それは浸潤免疫細胞による攻撃の直下であるとしてCNSを保護欠如処理を含む免疫細胞のCNSへの浸潤およびミエリンの分解を伴う他の疾患。考慮治療のタイミングを取り、炎症および損傷を評価するためにCNSの免疫組織化学と関連して脾臓および脊髄のフローサイトメトリー分析を使用して治療についてなされるべきメカニズムの決定を可能にします。

多発性硬化症（MS）は、早期の疾患における脳の白質領域において主に炎症性病変によって特徴付けられます。長期進行した後、灰白質萎縮は、MRIイメージングによって検出され、疾患の神経変性相をマークします。反応性神経膠症、脱髄、および白質における軸索損傷は、CNS浸潤免疫細胞に起因しています。現在MSに使用される治療法のいずれも逆転しないか、直接CNSに神経変性を防止する - その代わりに、それらは、CNSへのT細胞活性化および/または浸潤を減衰させることによって炎症を低減します。そこにMSの治療法がなく、現在の治療法を使用している患者は、疾患の進行を経験し続けているため、脱髄およびニューロンの損失を防ぐ薬の発見は非常に重要です。 すなわち 、CNSへのダメージ低減を- -のように見えるが、免疫細胞への影響およびCNS上のものとを区別することは、結果として、実験的に困難な場合がありますかかわらず、それが発生し、それを通してメカニズムの雨。したがって、CNS保護の評価は、病気のメカニズムにどのように影響するかを薬理学的薬剤を決定するために周囲に免疫細胞と免疫細胞の増殖をCNSは、浸潤性の評価と提携する必要があります。 実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、現在MS 1-4を治療するために使用される薬物の発見のための直接の原因であった自己免疫炎症性疾患の十分に確立された動物モデルです。マウスはしばしば、C57BL / 6マウスは、遺伝的変異体の利用可能性に基づいて、人気のある株であると、EAEのために使用されます。 EAEで誘導されたC57BL / 6マウスを、10日目、誘導後の周囲に発症する慢性疾患の進行を示します。脊髄実質および小脳の浸潤は、皮質実質5の浸潤の欠如と、これらの動物の組織病 ​​理学の特徴です。 Bでさらに、皮質病変および脱髄雨はC57BL / 6マウスでは比較的存在しない疾患6-9の顕著な特徴です。可能であればしたがって、MS 10と同様に表示され、脳および脊髄の両方に見られる再発寛解型疾患および病変を有するSJLマウスを、使用することが好ましいです。 免疫細胞が中枢神経系に到達しない場合の処置は、神経保護として分類することはできません。したがって、このプロトコルは、以前に11を示したように、脳、脊髄、およびEAEマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析の使用は、免疫細胞のCNS ​​への浸潤および末梢における免疫細胞の増殖に対する処置の効果を決定することを可能にします。程度および神経保護の性質を決定するために、中枢神経系組織の免疫組織化学的分析も記載されています。これらの方法を組み合わせることにより、CNSがあったかどうかPR免疫細胞が活性化免疫細胞がCNSに進入するかどうかを、周辺で増殖されたかどうかの決意を可能にし、そして炎症や損傷からotected。神経保護効果は、免疫系への影響にもかかわらず、疑われる場合はCNSへの免疫細胞の浸潤が発生した後、実験者は、治療の開始時間を変更することができます。 ここでは、アクティブなEAE、MSのT細胞媒介動物モデルの2つの異なるモデルを使用してプロトコルを提示し、のさまざまな側面に実験的な治療法の有効性を決定するために、病気中の様々な時点での免疫組織化学と組み合わせたフローサイトメトリー分析MSの病因。この方法は、それが簡単に薬が疾患の病因に作用する方法を絞り込むことながら、中枢神経系の保護に対する免疫細胞の増殖と浸潤に対する効果を区別するの研究者を支援します。

<table><tbody><tr><td>22 x 22 x 20 mm 包埋型</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td><td></td></tr><tr><td>22 x 30 x 20 mm 埋込み型</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 mm 包埋金型</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK 溶解バッファー</td><td>品質 生物学的</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD4 PE-Cy7</td><td>BD バイオサイエンス 552775</td><td></td><td>0.2 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>anti-Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0.5 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>抗 GFAP (カクテル)</td><td>バイオレジェンド</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>抗 Iba-1 ポリクローナル抗体 (50 &#181;g)</td><td>和光</td><td>019-19741</td><td>0.5 mg / mlストック濃度</td></tr><tr><td>抗IFN-&γ;APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0.2 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>抗 IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0.2 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>抗 Ki-67 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0.2 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>抗 MBP (D-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0.2 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>抗 TCR&β;FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0.5 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>抗 TCR&β;PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>0.2 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG</td><td>ベクターラボ</td><td>BA-1000</td><td>1.5 mg/ml ストック濃度</td></tr><tr><td>ビオチン化ウマ抗マウスIgG</td><td>ベクターラボ</td><td>BA-2000&nbsp;</td><td>1.5 mg / mlストック濃度</td></tr><tr><td>クエン酸、無水、99.5%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、四ナトリウム塩二水和物、99%</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ックAC446085000<td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランドスーパーフロストプラス顕微鏡スライド、10</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>ゴルジのケースプラグ</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>タンパク質輸送阻害剤</td></tr><tr><td>Immedge 疎水性バリア ペン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>EMD ミリポア</td><td>407952-5mg</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン、100x</td><td>コーニング</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>コーニング</td><td>25-025-CL</td><td></td></tr><tr><td>ニア IR ライブ/デッド染色キット</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td>生存率染料</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>正常馬血清</td><td>Vector Labs</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、96%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0891-01</td><td>密度勾配</td></tr><tr><td>パーマウント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP15-500</td><td>樹脂封入剤</td></tr><tr><td>ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)</td> <td>シグマ</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>精製抗ミエリン塩基性タンパク質抗体</td><td>BioLegend</td><td>808401</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>コーニング</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>コーニング</td><td>25-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT コンパウンド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T9284</td><td>非イオン性洗剤</td></tr><tr><td>ベクタステイン エリート ABC キット (標準)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC9206402</td><td>アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ&nbsp;免疫ペルオキシダーゼの複合体(ABC)&nbsp;</td></tr><tr><td>ベクターラボラトリーズペルオキシダーゼ基質キット(DAB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9276270</td><td>DAB solution</td></tr></tbody></table>

自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのcns保護に対する免疫系の抑制を決定します

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

>jove_content<自己免疫性脱髄疾患である多発性硬化症(MS)の主な特徴は、免疫細胞が脳と脊髄に浸潤し、その結果、ミエリンが破壊され、神経インパルスの伝導を遅らせるだけでなく、軸索の損傷を引き起こし、運動能力と認知機能の低下をもたらすことです。MSの現在の治療法は、中枢神経系(CNS)への免疫細胞の浸潤を弱めることに焦点を当てています。これらの治療法は再発数を減らし、生活の質を向上させますが、再発を完全に排除するわけではないため、長期的な障害は改善されません。したがって、CNSを保護する治療薬が必要です。動物モデルとMSのヒト患者の両方で、T細胞のCNSへの侵入は一般に炎症イベントの開始と考えられています。薬剤が中枢神経系を保護するかどうかを評価するためには、免疫細胞の浸潤や末梢での増殖に対する潜在的な影響を除外する必要があります。このプロトコルは、薬物介入後に観察されたCNS保護が、CNS浸潤免疫細胞の減弱または炎症性傷害中のCNS細胞の死のブロックの結果であるかどうかを判断する方法を説明しています。現在の治療法は再発(すなわち、免疫細胞浸潤)を減少させるが、完全に排除するわけではないため、炎症性傷害時にCNSを保護するMS治療を検討する能力は、治療戦略の進歩にとって非常に重要です。

このプロトコルは、実験的自己免疫性脳脊髄炎の薬理学的治療が免疫細胞の浸潤を抑制した結果として中枢神経系の防御を示すか、または免疫細胞の浸潤の猛攻撃中に神経保護的であるかを決定する方法を説明しています。

自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

この概念的方法の全体的な目標は、実験的自己免疫性脳脊髄炎の薬理学的治療が、免疫細胞浸潤の猛攻撃中または免疫細胞浸潤抑制の結果として中枢神経系保護を示すかどうかを判断することです。この方法は、神経免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、EAEの治療時間を操作することで、免疫細胞の浸潤と防御への影響をどのように区別するのでしょうか。この技術の意味は、現在、この病気に対する神経保護治療がないため、多発性硬化症の治療にも及びます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Xc-トランスポーターというシステムの阻害剤を持つEAEマウスを治療すると、神経保護と免疫調節の両方があることを発見したときでした。この方法は薬物治療の研究にも使用できますが、EAEやその他の操作を受けた遺伝子ノックアウトマウスを用いた研究にも適用できます。まず、滅菌ハサミを使って、個々の動物の脳と脊髄を細かく刻みます。次に、組織ごとに1つの3ミリリットルシリンジプランジャーを使用して、各サンプルを個々の70ミクロンセルストレーナーにマッシュし、ストレーナーを培地ですすいでいます。すべてのピースが浸軟されたら、チューブ内の最終容量を新鮮な培地で最大50ミリリットルまで持ってきてから、細胞懸濁液を遠心分離します。各ペレットを4ミリリットルの40%密度勾配溶液に再懸濁します。次に、チューブあたり2ミリリットルの密度70%の勾配溶液の上に、個々の15ミリリットルの円錐形チューブの壁にセルをゆっくりと重ねます。遠心分離により細胞を分離し、1ミリリットルのトランスファーピペットを使用して、上部ミエリン層を慎重に廃棄します。次に、サンプル界面から生細胞を新しい15ミリリットルの円錐管に移し、チューブあたり15ミリリットルの新鮮な培地の最終容量で細胞を洗浄します。ペレットを200マイクロリットルの新鮮な培地に再懸濁し、細胞懸濁液を96ウェル丸底プレートの個々のウェルに移します。プレートを遠心分離し、上清をはじき取ります。次に、ペレットを200マイクロリットルの再刺激培地に再懸濁し、細胞を摂氏37度で4時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、プレートを再度遠心分離し、上清を取り除きます。次に、2%FCSを添加した200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、2%FCSとFCブロックを添加した200マイクロリットルのPBSで細胞を氷上で10〜15分間再懸濁します。インキュベーションの終了時に、示したように細胞を洗浄し、ペレットを15マイクロリットルの細胞表面染色カクテルに氷上で15分間再懸濁します。次に、細胞をスピンダウンし、サンプルを200マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。次に、製造元の指示に従って、FOXP3転写因子染色試薬に細胞を再懸濁し、摂氏4度で30分間から一晩中。インキュベーションの終わりに、細胞を150マイクロリットルの透過化緩衝液で洗浄します。次に、細胞を遠心分離し、目的の細胞内抗体にペレットを再懸濁し、氷上の15マイクロリットルの透過化バッファーに入れます。30分後、細胞をスピンダウンし、続いて200マイクロリットルの透過化緩衝液で3回洗浄します。最後の洗浄後、ペレットを200マイクロリットルのPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーでサンプルを分析し、生きたCD4陽性、TCRベータ陽性細胞をゲーティングします。また、末梢性T細胞の増殖を評価することも重要です。なぜなら、末梢の変化は免疫細胞の中枢細胞への浸潤に影響を与えるからです。EAE導入後に脊髄組織サンプル中に存在する星状細胞とグリア細胞の数を定量化するには、各切片の画像を4倍の倍率で取得し、その画像をTIFFファイルとして保存します。次に、ImageJで目的の画像を選択し、ポリゴン選択ツールを使用して脊椎組織切片全体をトレースします。画像メニューで、タイプと16ビットを選択して、画像を16ビットに変換します。次に、プロセスメニューを開き、被写体の背景を選択して、ローリングボールの半径を、少なくとも背景の一部ではない最大オブジェクトのサイズに設定します。スライドする放物面を確認し、[OK]をクリックします。次に、画像の下で「調整」と「しきい値」を選択し、スライドバーを使用して下限しきい値レベルを設定します。選択した領域内のしきい値領域の割合を取得するには、[測定値の分析と設定] で [面積の割合] を選択します。「threshold への制限」がオフになっていることと、「表示ラベル」がオンになっていることを確認し、「OK.To」をクリックして測定値を取得し、「analyze」で「measure」を選択します。結果のポップアップボックスが表示されます。このデータを保存し、処理グループ間の面積の割合の値を比較します。光学濃度によるミエリン塩基染色を定量化するには、目的の画像を開き、ポリゴンセクションツールを使用してサンプル内に関心領域を描画します。[測定値の分析と設定] で、平均グレー値を選択し、[Limit to threshold] がオフになっていることと、[表示ラベル] がオンになっていることを確認します。[OK] をクリックします。次に、分析メニューで [測定] を選択します。新しい結果ポップアップボックスが表示され、ミエリン塩基性タンパク質の平均グレー値データが表示されます。脊髄摘出術とフローサイトメトリー解析により、疾患のピーク時に免疫細胞の浸潤が最大となる中枢神経系の免疫細胞浸潤を評価することができます。CD4陽性、インターフェロンγ陽性、IL-17陽性、およびFOXP3陽性の細胞数の統計解析は、薬物処理動物と対照動物におけるCD4陽性浸潤T細胞数で観察された変化の重要性を明らかにすることができ、CD4陽性浸潤T細胞数の全体的な減少における交絡因子としてのスキューを除外するために不可欠な詳細な共発現分析を行うことができます。T細胞に浸潤する中枢神経系の減少が、末梢での増殖、活性化、分化の阻害の結果である可能性を排除するために、活発に増殖するT細胞の数とT細胞サブタイプの割合を評価することができます。ミエリンの完全性を定量的に評価するために、ミエリン塩基性タンパク質染色の光学密度の統計分析を行うことができ、例えば、野生型同腹仔と比較して、不特定の遺伝子ノックアウト動物における脊髄組織の有意な脱髄が明らかになります。神経炎症が治療的介入によって持続または減少することをさらに実証するために、反応性神経膠症は、ちょうど示したように反応性神経膠症の平均分率面積を測定することによって評価することもできます。フローサイトメトリー法は、適切に実施すれば2日で完了し、組織染色の定量化は1回の染色につき約2時間で完了します。免疫調節は、免疫細胞浸潤前に治療薬を導入して、T細胞の遊走性および増殖性変化を定量化することで評価できます。CNSの防御力は、免疫細胞がすでにCNSに浸潤している疾患のピーク時に治療を導入することで評価できます。この手順を試行する際には、細胞染色の特定のハイライトのみについて、ImageJの最適なしきい値設定を評価することを忘れないでください。このビデオを見れば、特定の治療が中枢神経系、T細胞の増殖、および遊走反応に及ぼす影響を評価する方法について十分に理解できるはずです。免疫細胞浸潤前後の治療時間を変更することによって。

determining-immune-system-suppression-versus-cns-protection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

特定のマウス系統では、ミエリン塩基性タンパク質で実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の誘導に抵抗することができます。ここで説明するには、無反応を逆にし、いくつかの典型的なEAE耐性マウスの汚れに麻痺性疾患を引き起こす単純な予防接種プロトコルです。...

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

マウス脊髄を撮像するための新規のex vivo調製。このプロトコルは、脊髄全体生細胞の相互作用の二光子イメージングを可能にする。...

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

脱髄疾患は、リゾレシチンを中枢神経系に局所的に適用することで、動物でモデル化することができます。マウスの脊髄にリゾレシチンを1回注射すると、時間の経過とともに自然に修復する病変が生じます。目標は、脱髄および再髄鞘形成に関与する因子を研究し、修復を強化するための薬剤をテストすることです。...

リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。...

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans...

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

本プロトコールは、マウスにおいて安定かつ再現可能な脱髄モデルを生成するための定位フレーム を介した...

マウスにおけるリゾホスファチジルコリン誘発局所脱髄モデルの安定的に確立された2点注射

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。...

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症の動物モデルとして機能します。この記事では、EAEにおける脊髄の炎症、脱髄、および軸索損傷をスコアリングするためのアプローチについて説明します。さらに、マウス血清中の可溶性ニューロフィラメント光レベルを定量化する方法が提示され、生きたマウスの軸索損傷の評価が容易になります。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化

学ぶEAEマウスモデルを用いた薬理学的介入による免疫細胞浸潤抑制と神経保護効果の区別方法。フローサイトメトリーと組織イメージングでT細胞動態とグリア細胞を解析し、多発性硬化症治療薬開発への洞察を得ます。

自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

さらに動画を探す