自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

この概念的方法の全体的な目標は、実験的自己免疫性脳脊髄炎の薬理学的治療が、免疫細胞浸潤の猛攻撃中または免疫細胞浸潤抑制の結果として中枢神経系保護を示すかどうかを判断することです。この方法は、神経免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、EAEの治療時間を操作することで、免疫細胞の浸潤と防御への影響をどのように区別するのでしょうか。

この技術の意味は、現在、この病気に対する神経保護治療がないため、多発性硬化症の治療にも及びます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Xc-トランスポーターというシステムの阻害剤を持つEAEマウスを治療すると、神経保護と免疫調節の両方があることを発見したときでした。この方法は薬物治療の研究にも使用できますが、EAEやその他の操作を受けた遺伝子ノックアウトマウスを用いた研究にも適用できます。

まず、滅菌ハサミを使って、個々の動物の脳と脊髄を細かく刻みます。次に、組織ごとに1つの3ミリリットルシリンジプランジャーを使用して、各サンプルを個々の70ミクロンセルストレーナーにマッシュし、ストレーナーを培地ですすいでいます。すべてのピースが浸軟されたら、チューブ内の最終容量を新鮮な培地で最大50ミリリットルまで持ってきてから、細胞懸濁液を遠心分離します。

各ペレットを4ミリリットルの40%密度勾配溶液に再懸濁します。次に、チューブあたり2ミリリットルの密度70%の勾配溶液の上に、個々の15ミリリットルの円錐形チューブの壁にセルをゆっくりと重ねます。遠心分離により細胞を分離し、1ミリリットルのトランスファーピペットを使用して、上部ミエリン層を慎重に廃棄します。

次に、サンプル界面から生細胞を新しい15ミリリットルの円錐管に移し、チューブあたり15ミリリットルの新鮮な培地の最終容量で細胞を洗浄します。ペレットを200マイクロリットルの新鮮な培地に再懸濁し、細胞懸濁液を96ウェル丸底プレートの個々のウェルに移します。プレートを遠心分離し、上清をはじき取ります。

次に、ペレットを200マイクロリットルの再刺激培地に再懸濁し、細胞を摂氏37度で4時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、プレートを再度遠心分離し、上清を取り除きます。次に、2%FCSを添加した200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、2%FCSとFCブロックを添加した200マイクロリットルのPBSで細胞を氷上で10〜15分間再懸濁します。

インキュベーションの終了時に、示したように細胞を洗浄し、ペレットを15マイクロリットルの細胞表面染色カクテルに氷上で15分間再懸濁します。次に、細胞をスピンダウンし、サンプルを200マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。次に、製造元の指示に従って、FOXP3転写因子染色試薬に細胞を再懸濁し、摂氏4度で30分間から一晩

インキュベーションの終わりに、細胞を150マイクロリットルの透過化緩衝液で洗浄します。次に、細胞を遠心分離し、目的の細胞内抗体にペレットを再懸濁し、氷上の15マイクロリットルの透過化バッファーに入れます。30分後、細胞をスピンダウンし、続いて200マイクロリットルの透過化緩衝液で3回洗浄します。

最後の洗浄後、ペレットを200マイクロリットルのPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーでサンプルを分析し、生きたCD4陽性、TCRベータ陽性細胞をゲーティングします。また、末梢性T細胞の増殖を評価することも重要です。なぜなら、末梢の変化は免疫細胞の中枢細胞への浸潤に影響を与えるからです。EAE導入後に脊髄組織サンプル中に存在する星状細胞とグリア細胞の数を定量化するには、各切片の画像を4倍の倍率で取得し、その画像をTIFFファイルとして保存します。

次に、ImageJで目的の画像を選択し、ポリゴン選択ツールを使用して脊椎組織切片全体をトレースします。画像メニューで、タイプと16ビットを選択して、画像を16ビットに変換します。次に、プロセスメニューを開き、被写体の背景を選択して、ローリングボールの半径を、少なくとも背景の一部ではない最大オブジェクトのサイズに設定します。

スライドする放物面を確認し、[OK]をクリックします。次に、画像の下で「調整」と「しきい値」を選択し、スライドバーを使用して下限しきい値レベルを設定します。選択した領域内のしきい値領域の割合を取得するには、[測定値の分析と設定] で [面積の割合] を選択します。「threshold への制限」がオフになっていることと、「表示ラベル」がオンになっていることを確認し、「OK.To」をクリックして測定値を取得し、「analyze」で「measure」を選択します。

結果のポップアップボックスが表示されます。このデータを保存し、処理グループ間の面積の割合の値を比較します。光学濃度によるミエリン塩基染色を定量化するには、目的の画像を開き、ポリゴンセクションツールを使用してサンプル内に関心領域を描画します。

[測定値の分析と設定] で、平均グレー値を選択し、[Limit to threshold] がオフになっていることと、[表示ラベル] がオンになっていることを確認します。[OK] をクリックします。次に、分析メニューで [測定] を選択します。新しい結果ポップアップボックスが表示され、ミエリン塩基性タンパク質の平均グレー値データが表示されます。

脊髄摘出術とフローサイトメトリー解析により、疾患のピーク時に免疫細胞の浸潤が最大となる中枢神経系の免疫細胞浸潤を評価することができます。CD4陽性、インターフェロンγ陽性、IL-17陽性、およびFOXP3陽性の細胞数の統計解析は、薬物処理動物と対照動物におけるCD4陽性浸潤T細胞数で観察された変化の重要性を明らかにすることができ、CD4陽性浸潤T細胞数の全体的な減少における交絡因子としてのスキューを除外するために不可欠な詳細な共発現分析を行うことができます。T細胞に浸潤する中枢神経系の減少が、末梢での増殖、活性化、分化の阻害の結果である可能性を排除するために、活発に増殖するT細胞の数とT細胞サブタイプの割合を評価することができます。

ミエリンの完全性を定量的に評価するために、ミエリン塩基性タンパク質染色の光学密度の統計分析を行うことができ、例えば、野生型同腹仔と比較して、不特定の遺伝子ノックアウト動物における脊髄組織の有意な脱髄が明らかになります。神経炎症が治療的介入によって持続または減少することをさらに実証するために、反応性神経膠症は、ちょうど示したように反応性神経膠症の平均分率面積を測定することによって評価することもできます。フローサイトメトリー法は、適切に実施すれば2日で完了し、組織染色の定量化は1回の染色につき約2時間で完了します。

免疫調節は、免疫細胞浸潤前に治療薬を導入して、T細胞の遊走性および増殖性変化を定量化することで評価できます。CNSの防御力は、免疫細胞がすでにCNSに浸潤している疾患のピーク時に治療を導入することで評価できます。この手順を試行する際には、細胞染色の特定のハイライトのみについて、ImageJの最適なしきい値設定を評価することを忘れないでください。

このビデオを見れば、特定の治療が中枢神経系、T細胞の増殖、および遊走反応に及ぼす影響を評価する方法について十分に理解できるはずです。免疫細胞浸潤前後の治療時間を変更することによって。