の自動解析 C。エレガンススイム挙動

この方法論の全体的な目標は、CeleSTと呼ばれるコンピュータービジョンソフトウェアを使用してC.Elegansの水泳行動を定量的に評価することです。「この分析方法は、遺伝子変異または薬理学的介入がC.elegansの水泳行動に与える影響に対処するのに役立ちます。また、経年劣化による機関車の能力低下も容易にスコアリングできます。この手法の主な利点は、複数の動物を同時に追跡できること、水泳姿勢のさまざまな側面を分析して水泳行動の8つのパラメーターをスコアリングすること、および自動データ評価を行うことです。

まず、実体顕微鏡とデジタルCCDカメラ、およびC.Elegansの水泳行動分析用のデジタルビデオ録画ソフトウェアとコンピュータービジョンソフトウェアを備えたコンピューターを入手します。デジタルビデオ録画ソフトウェア内で次の設定を設定します:顕微鏡スライドの水泳ドロップエリアのまぶしさを防ぐために、顕微鏡を暗い布で覆い、画質を向上させます。顕微鏡の作動距離と倍率を水泳エリアの全景に調整し、ベースミラーを調整して、背景に対する動物のコントラストを鮮明にします。

次に、イルミネーションを暗視野に設定して、黒い背景に対して大人の体を白く視覚化します。次に、顕微鏡スライドに事前に印刷された10ミリメートルのリングに60マイクロリットルの1 x M9バッファーをピペットで移し、液滴がリングの内側領域を完全に覆うことを確認します。4匹の成虫を1 x M9バッファーの液滴に移し、液体を曇らせる可能性のある細菌の輸送を最小限に抑えます。

線虫がプレートの着ていない領域を短時間這うのを待ってから移すか、記録する前にスイムウェルを少し混ぜてマイナーなバクテリアの痕跡を分散させることにより、スイムウェル内のバクテリアを最小限に抑えます。次に、成虫の線虫を装填したスライドを顕微鏡のベースに配置して、液体中での遊泳行動を30秒のビデオに記録します。録音するには、ホーム見出しの下にあるRAM内の新しいシーケンスを選択し、赤い録音ボタンを押します。

最後に、録画が完了したら、[Home] 見出しをクリックし、[Export Full Sequence] を選択して、ビデオを画像フレームのシーケンスにフラグメント化します。まず、Mat LabからC.elegansの水泳行動解析用のComputer Visionソフトウェアを起動します。水泳分析プログラムのホーム画面で、[1つのビデオを追加]または[複数のビデオを追加]ボタンを使用して、画像フレームのシーケンスを一度に1つずつ、またはグループでアップロードし、遺伝子型、日付、試行、期間などの関連するラベルを添付します。

次に、「ビデオの処理」をクリックして、アップロードされたシーケンス内の複数の動物の同時追跡を有効にします。表示される新しい画面で、左側のボックスで目的のビデオを選択し、[リストに追加]をクリックします次に、リング内の3つのポイントを選択してスイムゾーンを画定し、[上記のすべてのビデオを処理する]をクリックして処理を開始します。画面中央下部に動画処理の進行状況が表示されます。

完了したら、ビデオ処理画面を閉じます。まず、「Compute measures」をクリックして新しい画面を開き、処理されたビデオを一度に1つずつアップロードして、単一の動物の追跡を検証または拒否できます。この手動ステップを使用して、赤いブロックに示されている追跡の見逃しの領域に焦点を当て、緑のブロックで示されている追跡の成功と対比します。

セグメント化された本文の有効性を見つけます」画面全体の下半分の最初のカラーバーで。有効なフレームの割合は緑で、拒否されたフレームの割合は赤で示しています。次に、次のブロックを使用して、有効なフレームまたは拒否されたフレームのブロックをナビゲートして変更し、有効性の切り替え「ブロックの分割」およびフレームの分離オプションを使用します。

まれに、混雑していない遊泳ゾーンで2匹の動物がすれ違う場合は、「スイッチ」ボタンを使用して特定のフレーム範囲で識別番号を切り替えてください。最後に、「保存してメジャーを計算する」をクリックして、別の処理済みビデオをアップロードする前に有効性の入力を保存します。次に、[閉じる] を選択して [メジャーの計算] 画面を終了します。

このソフトウェアは、バックグラウンドの個々の動物の遊泳パフォーマンスの曲率マップと、後で示される8つのパラメータを計算することに注意してください。Computer Visionソフトウェアプログラムのホーム画面で、[結果の表示]をクリックして、分析出力を取得します。次に、左側のボックスで目的の分析されたフレームのシーケンスを選択し、[選択したサンプルに追加]または[新しいサンプルに追加]ボタンをクリックして、それらを新しい既存のサンプルグループに移動して、統計的処理用のサンプルグループを作成します。

[Show graphs for these samples] をクリックすると、2 番目の画面に移動し、画面上部に選択されている 8 つのパラメーターのそれぞれのサンプルのグラフと主要な統計量が表示されます。次に、「2Dヒストグラム」を選択して、画面左側のX軸のメジャーとY軸のドロップダウンメニューで任意の2つのパラメーターの組み合わせをプロットします。「閉じる」をクリックして終了し、「結果の表示」画面に戻ります。

次に、画面の左上にあるエクスポートボタンを選択して、詳細な数値データをcsvファイルとして保存し、スプレッドシートプログラムで開いてさらに操作します。最後に、「閉じる」を選択して「結果の表示」画面を終了し、ホーム画面に戻ります。「終了」をクリックして、分析されたビデオシーケンスを含むデータベースを確実に保存します。

波の開始率、活動指数、筆のストローク、移動速度など、水泳の特定のパラメータは、良好な遺伝的背景であっても、年齢とともに徐々に低下しました。一方、体の波数、非対称性、伸張性、およびカールのパラメータは、野生型および老化した変異体の成体では、年齢とともに上昇傾向にあります。すべての線虫は健康な成体として始まりますが、急速に体力を失うものもあれば、より長い期間活力を維持するものもあり、悪いエイジャーは優雅なエイジャーよりも健康寿命がかなり短いことを示しています。

習得すれば、4匹の遊泳虫の分析を数分で取得できます。計算はビデオごとに約6分かかり、リモートで実行できます。1日あたり250匹の動物を処理することが可能です。

このビデオを見れば、水泳トライアルのビデオを取得する方法と、液体での移動評価を得るためのデータ処理方法について十分に理解できるはずです。