転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

この造血誘導プロトコルの全体的な目的は、転写因子の過剰発現を通じてマウス線維芽細胞に分化プロセスを誘発し、長期培養によって造血細胞を産生する造血前駆細胞をin vitroで生成することです。この手法は、多系統分化能および生着能を持つ真正なHSCをde novoで取得するためのプロトコルを開発できるかという、造血プログラミング分野における重要な問いへの答えを得るのに役立ちます。本技術の主な利点は、最小限の転写因子セットを過剰発現させることで、多能性の中間段階を経ることなく、リプログラミングされた細胞において分化プロセスを開始できることです。

マウス胎児線維芽細胞（MEF）を培養し、テキストプロトコルに従ってウイルスを作製した後、PBSで調製した0.1%ゼラチンを用いて6ウェルプレートをプリコートします。その際、ゼラチンがウェルの全領域を覆っていることを確認してください。プレートを37 °Cのインキュベーターに少なくとも20分間置きます。

次に、プレートを取り出し、ゼラチンを吸引して除去します。MEFを標準的なDMEMを用いて1ウェルあたり25,000 cellsの密度で播種し、37 °Cで一晩静置して細胞を接着させます。M2RTTAを50 µL、GATA2、GFI1B、CFOS、ETV6をそれぞれ12.5 µLずつ混合し、100 µLのウイルスカクテルを調製します。

MEFから培地を吸引し、8 µg/mLのヘキサジメトリンブロミドを含む標準DMEMを2 mL添加します。次に、各MEFウェルにウイルスカクテルを15 µL導入し、37 °Cで一晩インキュベートします。16〜20時間のインキュベーション後、各ウェルの培地を、1 µg/mLのDOXを添加した新鮮な標準DMEM 2 mLに交換します。

37 °Cで3日間インキュベートします。4日目に、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子（SCF）、MFS関連チロシンキナーゼ3リガンド、インターロイキン3、インターロイキン6、およびDOXを添加した造血培養培地を調製します。次に、MEFから培地を吸引し、1 mLのPBSを用いて細胞を洗浄します。

次に、PBSを吸引後、細胞を解離させて回収するため、各ウェルに0.05%トリプシンを1 mLずつ加えます。血球計数計を用いて細胞数を数えた後、300 ×gで5分間遠心分離し、先ほど調製した造血培地12 mLを用いて細胞を再懸濁します。その後、ゼラチンコートした6ウェルプレートに、1ウェルあたり10,000個の細胞を播種します。

培養期間中、6日ごとに培地を新鮮な添加済み造血培養培地と交換します。テキストプロトコルに従って細胞を解析してください。テキストプロトコルに従って妊娠マウスから胎盤を摘出した後、PBSに20% FBSを添加した0.2%コラゲナーゼtype Iを2～5 mL使用して組織を洗浄し、5 mLシリンジに装着した18ゲージの針を用いて、PBS溶液中で組織を機械的に分散させます。

胎盤細胞を2〜5 mLのコラゲナーゼ溶液中で37°C、1.5時間インキュベートします。次に、5 mLシリンジに取り付けた20〜25ゲージの針を用いて細胞を数回パスし、さらに機械的に解離させます。その後、単一細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過します。

次に、血球計数計を用いて細胞数をカウントし、有糸分裂不活性化のために2,000 centigray voltsで照射します。以下を添加した造血培養液10 millilitersを10 centimeterディッシュに加えます。0.65 micronフィルターをディッシュ内の培養液に直接載せ、浮遊させて気液界面を作成し、ディッシュを置いておきます。

このビデオの前の手順で示した通り、導入後25日目のMEFを解離させ、導入済みMEF 33,000個と有糸分裂不活性化胎盤凝集細胞 167,000個を混合します。凝集塊を作成するため、MEFと胎盤細胞の混合液を300 ×gで5分間遠心分離します。培地を吸引し、30〜50 µLの標準的なDMEMを用いてペレット化した細胞を再懸濁させ、単一細胞懸濁液を200 µLの非研磨済みピペットチップに吸い取ります。

次に、パラフィンフィルムでピペットチップを塞ぎます。次に、塞いだチップを15 milliliter遠心チューブに入れ、300 ×gで5分間遠心分離し、チップの塞いだ末端にペレットを形成させます。15 milliliterチューブからチップを慎重に取り出し、P200ピペットの先端に取り付けます。

パラフィンフィルムを取り除き、細胞ペレットを培地が入ったディッシュに浮かべているフィルター上に押し出します。浮遊フィルター上の凝集塊を、37 °C、5% CO₂条件下で4〜5日間培養します。セルスクレイパーを用いて凝集塊を回収してまとめ、0.5% collagenaseを用いて消化します。

解離後、5% FBS含有PBSを2〜5 mL用いて凝集塊を洗浄し、300 ×gで5分間遠心分離します。FBS、Pen-Strep、またはL-グルタミンを含まないDMEM 500 µLで凝集塊を再懸濁します。気泡の形成に十分注意しながら、懸濁液全量を、10 ng/mLのTepoを添加した1%メチルセルロース培地3 mLに加えます。

CFUアッセイのため、この混合液を等量ずつ3枚の35 x 10 mm非処理培養皿に播種します。対照として、放射線照射した胎盤凝集塊を培養します。最後に、37 °C、5 % CO₂条件下で10〜14日間培養した後、顕微鏡下で造血コロニー数を手動でカウントします。

MEFをHSCにリプログラミングする過程において、ここに示すように転写因子を細胞に導入します。3日間の拡大培養およびDOXへの曝露によって外来遺伝子の活性化を開始した後、細胞を分散させ、分割してゼラチンコートプレート上で補完造血培地を用いて培養します。リプログラミング培地での導入後、培養20日目において、34/H2BGFP MEFは、MEFとは異なる内皮細胞様形態を含む明確な形態的変化を示します。

35日目まで培養を継続すると、内皮様中間体から複数の円形の造血様細胞が出現し、これらはGFP陽性であり、造血マーカーであるSca1およびCD45に対して陽性に染色されます。さらに培養すると、ヒトCD34レポーターの発現を維持したまま、CD45を発現する細胞となります。胎盤凝集を行うと、培養細胞はクローン形成能を獲得し、メチルセルロース中で、多様な造血形態および芽球様細胞を含むコロニーを形成します。

本手順を実施する際は、混同を避けるため、各セクションをゆっくりと丁寧に行うことが重要です。誤りがあったとしても、リプログラミングを開始してから数週間経つまで気づくことは困難です。本手順の後、誘導された細胞が機能解析で示されたように真に造血機能を有しているかといった追加の疑問を解決するために、コブルストーン形成細胞アッセイや長期培養開始細胞アッセイなどの他の手法を実施することが可能です。

この手法の開発により、造血幹細胞プログラミング分野の研究者が、血液細胞、血管内皮細胞、およびその他の細胞型における他のリプログラミング戦略や最適化プロトコルを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、マウス線維芽細胞において血液生成プログラムを誘導する方法、転写因子の過剰発現、および誘導された細胞の機能評価方法について深く理解していただけたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。