Name: 転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶ マウス胚線維芽細胞における転写因子過剰発現による造血プログラム誘導法。多能性中間段階を経由せず造血前駆細胞を産生し、造血幹細胞のde novo生成と血液疾患治療研究への応用可能性を示す。

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この作業は、K.M.とI.R.L.(1RO1HL119404)へのNHLBI助成金によって支援されました。Carlos-Filipe Pereiraは、Revson Senior Biomedical Fellowshipの受賞者でした。私たちは、マウントサイナイhESC / iPSC共有リソースファシリティとS.D'Souzaが資料とプロトコルの支援を提供してくれたことに感謝します。また、Mount Sinai Flow Cytometry、Genomics、およびMouseの施設にも感謝します。

倫理文：マウスの細胞株は、マウントサイナイ医科大学の動物ケアガイドラインに従って導出され、任意のホスト機関に準拠して行われるべきです。 C57BL / 6マウスに1マウス胚線維芽細胞（MEF）の単離<ol><li>時限交配13を設定します 。膣プラグが可視化されると、この日0.5を検討してください。 </li><li>プラグ日に差し込まメスを分離し、妊娠を確認するための日10月11日にそれらをチェック。 </li><li>日13.5から14.5に頸椎脱臼に続いてCO 2吸入により妊娠中の雌マウスを安楽死させます。 </li><li> 、70％エタノールで妊娠中の女性の腹部を浸し正中ダウン滅菌ハサミやピンセットで腹腔を分析し、外科的に胚14を含む子宮角を除去します。残りの腹部組織をカットしながら、静かに胚を取り出します。 注：各側に4で約8胚を回復します。 </li><li>子宮時間置き滅菌冷却し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）5-10 mlの10cmの皿に胚を含むORN類。 </li><li>滅菌ハサミとピンセットで、胚を運ぶ嚢を単離するために、子宮角に沿って切開を行います。 PBS冷やし滅菌5〜10 mlの新しい10cmディッシュに嚢を移し、氷上に置きます。 </li><li>滅菌冷PBS 5〜10mlの持つ新しい10cmの皿に嚢の数を置きます。滅菌はさみやピンセットを使用すると、静かに胚を突き刺す避けるために（あまりにも深く切断せずに）嚢を切り開きます。 </li><li>臍帯を切断することにより胎盤から胚を分離します。 </li><li>冷PBS 5-10 mlを含む新しい10cmの皿に胚を移し、残りの解剖を完了しながら、氷の上に残します。 </li><li>滅菌ピンセットを用いて、胚を刎ねます。慎重に腹部を開く断頭領域から出発し、滅菌したハサミやピンセットを用いて胚の正中線を削減。トンの下に位置鉗子彼（心臓、肝臓、および肺を含む）、内臓および15を 、それらを掻き出します。 </li><li>ハサミやピンセットを用いて小片に残りの組織を切断し、トリプシンの10ミリリットルを含む50mlコニカルチューブに移します。 </li><li>ピペットアップおよび20〜30回10ミリリットルのピペットでダウンミックスし、組織を解離します。 </li><li>時折旋回、45分間37℃の水浴中で組織およびトリプシン混合物をインキュベートします。 </li><li>内容物を混合するために、約5分間、10ミリリットルピペットで上下にピペット。 </li><li>で、10％ウシ胎児血清（FBS）を標準ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の3倍の体積にトリプシン処理した細胞を追加の10μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）、及び1mMのL-グルタミン（L-GLUT） 10cmの皿（約10 ml）およびコンフルエント（約2-4日）まで37℃で培養。 10cmディッシュあたり1-2の胚についての文化。 注：プレート一度凍結細胞がコンフルエントです。凍結細胞を解凍し、2回以上継代することができます。細胞は代わりにすることができます凍結前に2回に分割してから、もう一度解凍された後。 </li></ol> 2.ウイルス産生<ol><li> 10％FBS、トランスフェクションのために1％P / S、1％L-GLUTで10mlのDMEMで10cmプレート中の293T細胞を増殖。 <ol><li> 2 mlのトリプシンでトリプシン処理293T細胞は、37℃で5分間インキュベート300×gで、15 mlチューブ、スピンに細胞を収集し、適切にプレート（10cmディッシュ当たり10ml）で。 </li></ol></li><li>コーティングされた10cmのゼラチン（PBS中0.1％ゼラチン）プレート6と種子：トランスフェクションの前24時間は、コンフルエント10cmの293T細胞のプレート1を分割します。 注：ウイルスあたり4プレートが必要になります。 <ol><li>ゼラチンコートプレートにコートに10cmプレートの底を、0.1％ゼラチン溶液の少なくとも2つのmlで加えます。少なくとも20分間37℃でインキュベートします。ゼラチンを吸引除去プレートに細胞を添加する前に。 </li></ol></li><li> 15mlチューブでは、例えばGATA2、Gfi1b、のCFO、またはETV6は（pFUW-のtetO vectを内にサブクローン化した（84μgのプラスミドを追加または16）またはFUW-M2rtTA 17）、84μgののpsPAX2、および42μgのpMD2.G. 2ミリリットルにボリュームを補うために（H 2 O）の水を追加します。各要因（ 例えば 。GATA2、Gfi1b、のCFO、ETV6とFUW-M2rtTA）のためのチューブを準備します。 </li><li>選択された遺伝子の84μgのから成る2ミリリットルの混合物を含む各チューブに2MのCaCl 2の250μlのを追加します（GATA2、Gfi1b、のCFO、ETV6またはFUW-M2rtTA）+ 84μgのpsPAX2 + 42μgのpMD2.G + H 2 O 。 </li><li>ピペットエイドに挿入されたパスツールピペットを使用して、リリースは2.25ミリリットルDNA + H 2 O + 2 MのCaCl 2混合物中に泡。気泡が生成されているように、ガラスピペットに対してP1000の先端を配置し、ゆっくりパスツールピペット1ダウン100mMのN、N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸（BES）生理食塩水を2mlを取り出し当時のミリリットル。 </li><li>少なくとも15分間室温で培養フード内のすべてのチューブをインキュベートします。 注：4.25ミリリットルの混合物（今のDNAの+ H 2 O + 2MのCaCl 2 </サブ&gt; + BESの生理食塩水）は、わずかに濁っなります。 </li><li>混合物をインキュベートするように、培地を吸引し、オフ293Tプレートと10ミリリットルのDMEM + 10％FBS + 1 mMのL-グルタミン+ 25 nMのクロロキンを追加します。 注：このメディアは、P / Sが含まれていません。 </li><li>インキュベーションの少なくとも15分後（または293T細胞上のメディアを変えるまで）、O + 2 MのCaCl 2 + BESの生理食塩水の混合物は、チューブあたり4セルプレート全体に均等に分配する、293T細胞に滴下4.25ミリリットルDNA +にH 2を追加（すなわちプレート当たり混合物の1ミリリットルよりも若干）。 </li><li> 37℃で一晩プレート（O / N）でインキュベートします。 </li><li> 24時間後のインキュベーションは、4ミリリットル標準DMEM（ステップ1.15を参照）で、すべてのプレート上のメディアを交換してください。 </li><li>今から32℃のインキュベーター内で細胞を保管してください。 </li><li> 24時間はステップ2.10の後、別々の50mlチューブにメディアを集めます。標準DMEM 4mlで各プレートから収集したメディアを交換してください。 注：収集されたメディアの16ミリリットルの最初のチューブ混合結果につき4プレート。 <ol><li> AFTERインキュベーションの12時間は、同じ50ミリリットルチューブに再びメディアを収集し、標準的なDMEMの別の4ミリリットルと交換します。 </li><li>インキュベーションの12時間後、培地を収集し、同じ50ミリリットルチューブに追加します。 注：各チューブは現在、ウイルスを含む培地を約48ミリリットルが含まれている必要があります。 </li></ol></li><li> 0.45μM低タンパク質結合フィルターを通して収集したウイルス、第一のフィルタ収集メディアを集中させます。 </li><li>ウイルス濃度の遠心管（時間で約16ミリリットル）にウイルスを含む濾過した培地を注ぎます。 </li><li> 25分間、4℃、4,000×gでスピンし、フロースルーを削除します。 注：濃縮されたメディアやウイルスの小さな容積は、フィルタに表示されます。 </li><li>フィルターに残った濃厚メディア+ウイルスボリュームにフィルタリング、ウイルス含有培地の別の16ミリリットルを加え、チューブを転倒混和。 </li><li> 25分であり、廃棄フロースルーのために4℃で4000×gで再びスピンチューブ。 </li><li>フィルタリングされたまま追加フィルターに残っ濃厚メディア+ウイルスボリュームに収集し、チューブを転倒混和。 </li><li> （フィルタ内のボリュームに応じて）10から20分間、4℃で再び4000×gでスピンし、フィルターに残って濃縮した培地+ウイルスの残りの体積が約1ミリリットルであることを確認してください。濃縮した培地+ウイルスのより大きい1ミリリットルがフィルター内に残っている場合は、1分間4000×gで再びスピンと1ミリリットルがフィルタに残されるまで繰り返します。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブに濃縮したウイルス200μlのアリコートし、-80℃で凍結または直ちに使用してください。 </li></ol> 3. MEFの再プログラミング<ol><li>当たりPBS中0.1％ゼラチンの0.5ミリリットルでプレコート6ウェルプレートだけでなく、ゼラチンがウェルの全領域をカバーすることを保証します。 37℃のインキュベーターに置き、少なくとも20分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを除去し、ゼラチンを吸引します。 </li><li>ウェルあたり25,000細胞の密度で、標準的なDMEMとプレートのMEF（15万細胞糊化6ウェルプレート（複数可）上の）6ウェルプレート当たりステップ3.1から、37℃のインキュベーター中でO / Nを解決することができます。 </li><li> GATA2、Gfi1b、のCFO、およびETV6のミックス（12.5μLずつ）50μlのM2rtTAを混合し、残りの50μlの100μlのウイルスカクテルを準備します。 </li><li> MEFのから吸引メディアとは、8 / mlの臭化ヘキサジメトリンと2 mLの標準DMEMを追加します。 </li><li>ウイルスカクテルの15μlのMEFプレートの各ウェルに形質導入し、37℃でO / Nインキュベートします。 注：これは、再プログラミングプロセスの0日目です。 </li><li> 1日目に、インキュベーションの16から20時間後、2ミリリットルとよくを1μg/ mlのDOXあたりを補った新鮮な標準DMEMを、メディアを交換してください。 </li><li>ヒドロコルチゾン（10 -6 M）を100ng /幹mlの細胞因子（SCF）、100ng / mlのFMS関連チロシンキナーゼ3リガンド（のFlt3L）を20ng / mlのインターロイキン-3（IL-を補充した造血培地を準備3）、20 ngの/ mlのインターロイキン-6（IL-6）、を1μg/ mlのDOX。 </li><li> 4日目aspirat上各ウェル及びウェルあたり1mlのPBSで細胞を洗浄から電子媒体。 </li><li>吸引除去し、PBSは、ウェル当たり0.05％トリプシンの1ミリリットルを用いて細胞を解離し、細胞を収集します。 </li><li>ウェル当たり2ミリリットルウェルあたり、10,000細胞（血球計算板を用いて細胞をカウントし、5分間300×gでスピン、ステップ3.7で説明した造血メディアの12ミリリットル中に再懸濁し、0.1％ゼラチンコーティングしたプレート上で6ウェルプレート当たり60,000細胞をプレー）。 </li><li>文化の持続時間（35〜36日）6日ごとに新鮮な補充造血培養培地で培地を交換してください。 </li><li>造血内皮細胞またはHSC-ようなマーカーおよび遺伝子発現の獲得を確認するために免疫染色12、FACS分析8,12、定量RT-PCR 12、およびmRNAシークエンス12を介して中間細胞または新興造血細胞様細胞のいずれかを分析します。 </li></ol>メチルセルロース4.胎盤集約とコロニー形成単位（CFU）アッセイ<ol><li>妊娠C5から胎盤を解剖7BL / 6マウスは、以前にE12.5で18を説明し、氷上で組織を維持します。 </li><li>胎盤解離19を起動するには、私は、20％FBSを含むPBS中で2〜5ミリリットルの0.2％コラゲナーゼタイプで胎盤組織を洗浄し、機械的に針を通して胎盤およびPBSを継代することにより5ミリリットル注射器に取り付けた18G針を用いて解離少なくとも3回。 </li><li>機械的解離後、1.5時間、37℃でコラゲナーゼ溶液2-5 ml中に胎盤細胞を維持します。 </li><li> 20-25 G針通過細胞を5mlの上に取り付けられ、さらに機械的に胎盤細胞を解離するために数回注射器。 </li><li> 70μmのセルストレーナーを介して単一細胞懸濁液をフィルタリングします。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし、有糸分裂不活化20のために2000 cGyでで照射します。 </li><li> 10 cmの100ng / mlのSCF、100ng / mlののFlt3L、20 ngの/ mlのIL-3、20 ngの/ mlのIL-6および10ng / mLのトロンボポエチン（TPO）を補充した造血培地10 mlを加え皿。 注：DOXは、この段階では必要ありません。 </li><li>それは液体 - 気体界面を作成し、脇の皿を設定するためにフロートすることができ、皿の中で造血培養培地に直接0.65μmフィルターを置きます。 </li><li>ステップ3.8から3.10に記載されているように（ステップ3.11から派生）25日目に形質導入したMEFを解離し、ステップ4.6から胎盤凝集体の167,000細胞を形質導入したMEFの33000をミックス（1：6の比）。 </li><li> 300×gで5分間のステップ4.9からMEFと胎盤細胞ミックスダウン18,21-集約、最初のスピンを生成するには。培地を吸引し、200μlnonbevelledピペット先端に単一細胞懸濁液を描く、P200のピペットを用いて、標準的なDMEMの30-50μlのでペレット化した細胞を再懸濁します。 </li><li>パラフィンフィルム付きピペットチップを塞ぎます。 15ミリリットルの遠心管にブロックされたチップを配置し、先端の被覆された最後にそう300×gで5分間ペレットフォームをスピンダウン。 </li><li>慎重に15ミリリットルチューブからチップを取り外し、場所P200ピペットの端部に先端。パラフィンフィルムを捨て、ステップ4.8から浮動フィルター上に細胞ペレットを押し出します。 注：フィルタあたりせいぜい3骨材プレート。 </li><li> 5％CO 2で37℃で4-5日間培養浮遊0.65μmのフィルター上の凝集体を。 </li><li>細胞を解離するために全体の胎盤で行ったように同じプロトコル（4.2から4.5ステップ）以下、セルスクレーパーで凝集体（フィルタあたり最大で3）を収集し、それらを組み合わせて、0.2％のコラゲナーゼで消化します。 </li><li>解離した後、PBS 2〜5 mlの凝集体を洗い、5％FBSを補充し、5分間、300×gで細胞をスピンダウン。 </li><li> FBSを含まないDMEM500μlの中で凝集体、P / S、またはL-GLUTを再懸濁します。この500μlの再懸濁を取り、慎重に気泡の形成を回避し、TPOの10ng / mLのを補充し3ミリリットルの1％メチルセルロースメディアに追加します。 3 35×10ミリメートル、非処理培養皿中でこの混合物のプレート等容積CFUは12をアッセイ。 </li><li>対照として、文化は、ステップ4.7から4.16に上記のようにCFUアッセイで再プログラムされたMEFに4〜5日と場所を混合することなく胎盤凝集体を照射します。 注：これらの凝集体は、単独でコロニーを形成しません。 </li><li> 5％CO 2で37℃での培養の10〜14日後に顕微鏡下で手動で造血コロニーを数えます。 </li><li>サイトスピン22は、単一細胞の形態学的表現型を示すために、コロニーを選びました。 </li></ol>

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著者には開示すべき利益相反はありません。

容易に達成体細胞から生成HSPCs デノボは、in vitroで造血を研究するためのユニークな方法、および潜在的に人間のシステムにこの技術を適用する機会を提供しています。この変換は、皿の中で、人間の血液学的疾患を研究するだけでなく、新規治療薬またはHSC移植で多数の障害を治療するための機会をターゲットに薬物検査プラットフォームと遺伝子を提供するための新しいツールを生成するであろう。フィールドでは、最近の研究では、再プログラミングプロセスのいくつかの機能の重要性を実証し、 デノボ HSPCsを生成する能力に拡大しています。これらは、出発細胞集団とTFカクテルの選択だけでなく、どのような培養条件（共培養ニッチ）と補給（サイトカイン、小分子など）が有意に24から26を再プログラミングの効率に影響を与えるが含まれます。いくつかの研究が通って移動することなく、人間のシステムに再プログラミング技術を適用していますこれらのプロセスで多能性中間、27,28望ましくないステップ。 ここ...

造血は、造血幹細胞（HSC）の複雑な発達過程は、大動脈-生殖腺-中腎および胎盤1,2-として胚造血の様々な部位に存在する造血内皮を出芽されています。 体外培養のHSCにできないことは、このプロセスの深さの分析だけでなく、これらの研究の臨床応用を防ぐことができます。この制限を回避するには、以前の研究を導出することを試みてきたのHSC デノボ再プログラミングメディア4,5を使用して、多能性幹細胞（PSCに）3、または体細胞における誘起塑性と向かう分化の分化を介しました。これらの研究は、しかし、臨床的に安全なengraftable細胞を生成したり、決定的な発達造血の研究ができない」皿の中を。」 体細胞、線維芽細胞のpから人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成するために、山中らによって確立された新規の仕事転写因子（TF）の再プログラミング細胞の運命6,7におけるベースの過剰発現戦略の枠組みをrovides。この作品は、容易に得られる体細胞のTFの再プログラミングを経由して、選択した細胞型を生成するために、いくつかの分野での研究者を求めています。ここで説明する再プログラミング戦略の目的は、 インビトロでヒト造血を研究するために、患者特有の線維芽細胞を再プログラムするために人間のシステムにこれらの結果を変換する目的でTF基づく再プログラミングアプローチを用いて、マウスの体細胞から造血プロセスを誘導することであると疾患モデル、薬物試験のための患者特有の血液製剤を生成し、幹細胞移植。 このマウス系で適切な再プログラミングを確保するための最初のステップは、CD34発現、内皮前駆細胞と造血幹細胞の既知のマーカーの読み出しを務めレポーターラインを開発することでした。これを行うには、huCD34-のtTAとのtetO-H2BGFPトランスジェニックマウス系統は、グラムに使用されましたenerateダブルトランスジェニックマウス胚線維芽細胞（MEFが）、今CD34プロモーター8の起動時に緑色の蛍光を発する34 / H2BGFPを表します。これは、造血仕様と開発中の異なるポイントで必要とされることが知られているTFの様々なスクリーニングを可能にしました。 pMX retrovialベクターにおける18のTFを皮切り34 / H2BGFP MEFがAFT024間質細胞をHSCが支持上のすべての要因と培養で形質導入した、（34 / H2BGFPマウスを記載した文献マイニングと以前からHSCを保持GFPラベルのプロファイリングにより決定）。レポーター活性化TFの最適なセットが同定されるまで34 / H2BGFP活性化を検出した後、のTFは、その後、再プログラミングカクテルから除去しました。この初期画面の後、要因はTFの制御可能な発現を可能にするDOX誘導性pFUWベクター系に移しました。これら2 DOXの制御システムは、からのMEF（34 / H2BGFP細胞とpFUW誘導性ベクター）は互換性がありませんので、野生型C57BL / 6マウスを必要としました。 hemogenesisが進行し、多クローン原性前駆細胞を作成することを可能にするための適切な微小環境を提供するためにも必要でした。 造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）に体細胞を再プログラムしようとする現在の研究は、成功9-11の様々なレベルを満たしています。現在までに、マウスおよび長期自己更新再増殖能力を有するヒト移植HSPCs両方の生成がTFの同じセットを使用して達成されていません。このプロトコルでは、再現性MEFにおけるhemogenesisを誘導する以前に確立された戦略の詳細な説明を提供します。私たちは、最小限のTFのセット（GATA2、Gfi1b、のCFO、およびETV6）の導入は、造血再プログラミングの発達造血及び臨床応用は、さらに12を研究することが可能なプラットフォームを提供し、in vitroでの複雑な発生プログラムを扇動することが可能であることを示しています。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;Mフィルター</td><td>コーニング430625</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini's Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>18 G 針</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>20 G 針</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>25 G 針</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I 型</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>骨髄培地</td><td>幹細胞技術</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R&Dシステムズ</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&Dシステムズ</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R&Dシステムズ</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ488-TO</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>シグマ</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)</td><td>シグマ</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>デュラポア0.65 &mu;Mメンブレンフィルター</td><td>ミリポア</td><td>DVPP14250</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース培地</td><td>幹細胞技術</td><td>メトカルト M3434</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>幹細胞技術</td><td>07904</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma</td><td>G-1890 100g</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>Addgene</td><td>プラスミド #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>Origene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>Origene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>Origene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #20342</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm 培養料理</td><td>Thermo Scientific</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

このプロトコルは、転写因子(TF)の過剰発現によるマウス胚性線維芽細胞(MEF)における造血プログラムの誘導を詳述しています。まず、ヒトCD34-tTA/TetO-H2BGFP(34/H2BGFP)ダブルトランスジェニックマウスのMEFを用いてレポータースクリーニングを設計しました。これらのマウス由来のCD34+細胞は、H2BヒストンをGFPで標識し、ドキシサイクリン(DOX)を添加すると標識を停止します。MEFSは候補TFとともに形質導入され、その後、造血細胞または内皮細胞の運命の獲得を示すGFP+細胞の出現が観察されました。18の候補TFから始めて、組み合わせ排除のプロセスを通じて、GFP+細胞の割合が最も高いものを誘導する最小限の因子セットを得ました。Gata2、Gfi1b、およびcFosが必要であり、Etv6の追加が最適な誘導を提供することがわかりました。リプログラミングプロセスの異なる時点で行われた一連の遺伝子発現解析により、これらの細胞は、内皮から造血への移行(EHT)を受けた前駆細胞を通過しているように見えることが明らかになりました。このように、このリプログラミングプロセスは「皿の中で」発生的な造血を模倣し、in vitroでの造血の研究を可能にし、この仕様の根底にあるメカニズムを特定するためのプラットフォームを提供します。この方法論は、この研究をヒトシステムに変換するためのフレームワークも提供し、血液疾患の治療と研究における多くのアプリケーションのための患者特異的造血幹細胞(HSC)の代替供給源を生成することを期待しています。

造血は、様々な胚のサイトで開始する複雑な発達過程です。造血内皮細胞は、これらのサイトに存在し、23出芽セルを介して造血幹細胞を生じさせます。このプロセスは、現在HSPC拡張エクスビボまたは生成デノボのいずれかによって、何らかの形で、インビトロでこれらの細胞を得るための方法が必要、培養中のHSCまたは造血前駆体を配置することによって再生することができません。このプロトコルは、MEFにおけるTFの過剰発現を介して、これらの細胞を取得しようとする私たちの新たな技術を実証します。 図1は、全体的な再プログラミングのプロセスを示します。 MEF発生と拡大した後、細胞をGATA2、Gfi1b、のCFO、ETV6とFUW-M2rtTAで形質導入されています。ゼラチンコーティングしたプレート上にDOXへの拡大と暴露導入遺伝子の活性化を開始するの3日後、細胞が...

ここで説明するプロトコルは、転写因子の最小セットの過剰発現によるマウス胚性線維芽細胞における造血プログラムの誘導を詳述しています。この技術は、造血、血液疾患、造血幹細胞移植の将来の研究のためのプラットフォームを提供するために、人間のシステムに変換される可能性があります。

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

この造血誘導プロトコルの全体的な目的は、転写因子の過剰発現を通じてマウス線維芽細胞に分化プロセスを誘発し、長期培養によって造血細胞を産生する造血前駆細胞をin vitroで生成することです。この手法は、多系統分化能および生着能を持つ真正なHSCをde novoで取得するためのプロトコルを開発できるかという、造血プログラミング分野における重要な問いへの答えを得るのに役立ちます。本技術の主な利点は、最小限の転写因子セットを過剰発現させることで、多能性の中間段階を経ることなく、リプログラミングされた細胞において分化プロセスを開始できることです。マウス胎児線維芽細胞（MEF）を培養し、テキストプロトコルに従ってウイルスを作製した後、PBSで調製した0.1%ゼラチンを用いて6ウェルプレートをプリコートします。その際、ゼラチンがウェルの全領域を覆っていることを確認してください。プレートを37 °Cのインキュベーターに少なくとも20分間置きます。次に、プレートを取り出し、ゼラチンを吸引して除去します。MEFを標準的なDMEMを用いて1ウェルあたり25,000 cellsの密度で播種し、37 °Cで一晩静置して細胞を接着させます。M2RTTAを50 µL、GATA2、GFI1B、CFOS、ETV6をそれぞれ12.5 µLずつ混合し、100 µLのウイルスカクテルを調製します。MEFから培地を吸引し、8 µg/mLのヘキサジメトリンブロミドを含む標準DMEMを2 mL添加します。次に、各MEFウェルにウイルスカクテルを15 µL導入し、37 °Cで一晩インキュベートします。16〜20時間のインキュベーション後、各ウェルの培地を、1 µg/mLのDOXを添加した新鮮な標準DMEM 2 mLに交換します。37 °Cで3日間インキュベートします。4日目に、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子（SCF）、MFS関連チロシンキナーゼ3リガンド、インターロイキン3、インターロイキン6、およびDOXを添加した造血培養培地を調製します。次に、MEFから培地を吸引し、1 mLのPBSを用いて細胞を洗浄します。次に、PBSを吸引後、細胞を解離させて回収するため、各ウェルに0.05%トリプシンを1 mLずつ加えます。血球計数計を用いて細胞数を数えた後、300 ×gで5分間遠心分離し、先ほど調製した造血培地12 mLを用いて細胞を再懸濁します。その後、ゼラチンコートした6ウェルプレートに、1ウェルあたり10,000個の細胞を播種します。培養期間中、6日ごとに培地を新鮮な添加済み造血培養培地と交換します。テキストプロトコルに従って細胞を解析してください。テキストプロトコルに従って妊娠マウスから胎盤を摘出した後、PBSに20% FBSを添加した0.2%コラゲナーゼtype Iを2～5 mL使用して組織を洗浄し、5 mLシリンジに装着した18ゲージの針を用いて、PBS溶液中で組織を機械的に分散させます。胎盤細胞を2〜5 mLのコラゲナーゼ溶液中で37°C、1.5時間インキュベートします。次に、5 mLシリンジに取り付けた20〜25ゲージの針を用いて細胞を数回パスし、さらに機械的に解離させます。その後、単一細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過します。次に、血球計数計を用いて細胞数をカウントし、有糸分裂不活性化のために2,000 centigray voltsで照射します。以下を添加した造血培養液10 millilitersを10 centimeterディッシュに加えます。0.65 micronフィルターをディッシュ内の培養液に直接載せ、浮遊させて気液界面を作成し、ディッシュを置いておきます。このビデオの前の手順で示した通り、導入後25日目のMEFを解離させ、導入済みMEF 33,000個と有糸分裂不活性化胎盤凝集細胞 167,000個を混合します。凝集塊を作成するため、MEFと胎盤細胞の混合液を300 ×gで5分間遠心分離します。培地を吸引し、30〜50 µLの標準的なDMEMを用いてペレット化した細胞を再懸濁させ、単一細胞懸濁液を200 µLの非研磨済みピペットチップに吸い取ります。次に、パラフィンフィルムでピペットチップを塞ぎます。次に、塞いだチップを15 milliliter遠心チューブに入れ、300 ×gで5分間遠心分離し、チップの塞いだ末端にペレットを形成させます。15 milliliterチューブからチップを慎重に取り出し、P200ピペットの先端に取り付けます。パラフィンフィルムを取り除き、細胞ペレットを培地が入ったディッシュに浮かべているフィルター上に押し出します。浮遊フィルター上の凝集塊を、37 °C、5% CO₂条件下で4〜5日間培養します。セルスクレイパーを用いて凝集塊を回収してまとめ、0.5% collagenaseを用いて消化します。解離後、5% FBS含有PBSを2〜5 mL用いて凝集塊を洗浄し、300 ×gで5分間遠心分離します。FBS、Pen-Strep、またはL-グルタミンを含まないDMEM 500 µLで凝集塊を再懸濁します。気泡の形成に十分注意しながら、懸濁液全量を、10 ng/mLのTepoを添加した1%メチルセルロース培地3 mLに加えます。CFUアッセイのため、この混合液を等量ずつ3枚の35 x 10 mm非処理培養皿に播種します。対照として、放射線照射した胎盤凝集塊を培養します。最後に、37 °C、5 % CO₂条件下で10〜14日間培養した後、顕微鏡下で造血コロニー数を手動でカウントします。MEFをHSCにリプログラミングする過程において、ここに示すように転写因子を細胞に導入します。3日間の拡大培養およびDOXへの曝露によって外来遺伝子の活性化を開始した後、細胞を分散させ、分割してゼラチンコートプレート上で補完造血培地を用いて培養します。リプログラミング培地での導入後、培養20日目において、34/H2BGFP MEFは、MEFとは異なる内皮細胞様形態を含む明確な形態的変化を示します。35日目まで培養を継続すると、内皮様中間体から複数の円形の造血様細胞が出現し、これらはGFP陽性であり、造血マーカーであるSca1およびCD45に対して陽性に染色されます。さらに培養すると、ヒトCD34レポーターの発現を維持したまま、CD45を発現する細胞となります。胎盤凝集を行うと、培養細胞はクローン形成能を獲得し、メチルセルロース中で、多様な造血形態および芽球様細胞を含むコロニーを形成します。本手順を実施する際は、混同を避けるため、各セクションをゆっくりと丁寧に行うことが重要です。誤りがあったとしても、リプログラミングを開始してから数週間経つまで気づくことは困難です。本手順の後、誘導された細胞が機能解析で示されたように真に造血機能を有しているかといった追加の疑問を解決するために、コブルストーン形成細胞アッセイや長期培養開始細胞アッセイなどの他の手法を実施することが可能です。この手法の開発により、造血幹細胞プログラミング分野の研究者が、血液細胞、血管内皮細胞、およびその他の細胞型における他のリプログラミング戦略や最適化プロトコルを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、マウス線維芽細胞において血液生成プログラムを誘導する方法、転写因子の過剰発現、および誘導された細胞の機能評価方法について深く理解していただけたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

reprogramming-mouse-embryonic-fibroblasts-with-transcription-factors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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