転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

この造血誘導プロトコルの全体的な目標は、転写因子の過剰発現を通じてマウス線維芽細胞の発生過程を扇動し、長期培養時に造血細胞を産生する造血前駆細胞をin vitroで生成することです。この方法は、マルチリネージとグラフトメントが可能な真正なHSCをde novoで取得するためのプロトコルを開発できるかどうかなど、造血プログラミング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、最小限の転写因子のセットを過剰発現させることにより、多能性中間体を通過する必要のない再プログラムされた細胞で発生プロセスを開始できることです。

マウス胚性線維芽細胞またはMEFSを培養し、テキストプロトコルに従ってウイルスを産生した後、PBS中の0.1%ゼラチンを使用して6ウェルプレートをプレコートします。ゼラチンが井戸の全領域を覆っていることを確認します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに少なくとも20分間置きます。

次に、プレートを取り外し、ゼラチンを吸引します。ウェルあたり25, 000細胞の密度で標準的なDMEMでMEFをプレート化し、細胞が摂氏37度で一晩沈殿することを可能にします。50マイクロリットルのM2RTTAと12.5マイクロリットルのGATA2、GFI1B、CFOS、ETV6をそれぞれ混合して、100マイクロリットルのウイルスカクテルを準備します。

MEFSから培地を吸引し、2ミリリットルの標準DMEMと1ミリリットルあたり8マイクログラムの臭化ヘキサジメトリンを加えます。次に、MEFの各ウェルに15マイクロリットルのウイルスカクテルを形質導入し、摂氏37度で一晩インキュベートします。16〜20時間のインキュベーション後、各ウェルの培地を2ミリリットルの新鮮な標準DMEMと交換し、DOX1ミリリットルあたり1マイクログラムを補充します。

37°Cで3日間インキュベートします。4日目に、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子、MFS関連チロシンキナーゼ3リガンド、インターロイキン3、インターロイキン6、DOXを添加した造血培養培地を準備します。次に、MEFから培地を吸引し、1ミリリットルのPBSを使用して細胞を洗浄します。

次に、PBSを吸引した後、ウェルごとに0.05パーセントのトリプシンを1ミリリットル加えて、細胞を解離して収集します。血球計算盤を使用して細胞を数え、300 g で 5 分間回転させ、細胞を再懸濁するために準備したばかりの造血培地 12 ミリリットルを使用します。次に、ゼラチン被覆された6ウェルプレート上のウェルあたり10,000個の細胞をプレート

6日ごとに、培養期間中、培地を新鮮な補充造血培地と交換します。テキストプロトコルに従ってセルを分析します。テキストプロトコルに従って妊娠中のマウスから胎盤を解剖した後、20%FBSを含むPBS中の0.2%コラゲナーゼ1型の2〜5ミリリットルを使用して組織を洗浄し、5ミリリットルの注射器に取り付けられた18ゲージの針を使用して、PBS溶液中の組織を機械的に解離します。

胎盤細胞を2〜5ミリリットルのコラゲナーゼ溶液に37°Cで1.5時間インキュベートします。次に、5ミリリットルの注射器に装着した20〜25ゲージの針に細胞を数回継代し、さらに機械的に細胞を解離させます。次に、70ミクロンのセルストレーナーでシングルセル懸濁液をろ過します。

次に、血球計算盤を使用して、細胞を数え、有糸分裂不活性化のために2, 000センチグレイボルトで照射します。10cmの皿に以下を補充した10ミリリットルの造血培地を加えます。0.65ミクロンのフィルターを皿の中の培地に直接置き、浮かせて液体と気体の界面を作り、皿を脇に置きます。

このビデオで前述したように、25日目に形質導入したMEFを解離し、形質導入されたMEFのうち33,000個を、有糸分裂的に不活性化された胎盤凝集体の167,000個の細胞と混合します。凝集体を生成するには、MEFと胎盤細胞の混合物をgの300倍で5分間スピンダウンします。培地を吸引し、30〜50マイクロリットルの標準DMEMを使用してペレット化された細胞を再懸濁し、単一細胞懸濁液を200マイクロリットルの斜めのないピペットチップに引き込みます。

次に、パラフィンフィルムでピペットチップを閉塞します。次に、詰まった先端を15ミリリットルの遠心分離チューブに入れ、300倍gで5分間回転させ、先端の蓋付き端にペレットが形成されるようにします。15ミリリットルのチューブからチップを慎重に取り外し、P200ピペットの端に置きます。

パラフィンフィルムを廃棄し、細胞ペレットを培地の皿に浮かべたフィルターに押し出します。浮遊フィルターで凝集体を摂氏37度と二酸化炭素5%で4〜5日間培養します。セルスクレーパーを使用して凝集体を回収し、それらを結合し、0.5%コラゲナーゼを使用して消化します。

解離後、2〜5ミリリットルのPBSと5%のFBSを使用して骨材を洗浄し、300倍のgで5分間スピンダウンします。凝集体をFBS、ペン連鎖球菌、またはL-グルタミンを含まない500マイクロリットルのDMEMに再懸濁します。懸濁液全体を、Tepoの1ミリリットルあたり10ナノグラムを補充したメチルセルロース培地の1パーセントに3ミリリットル加え、気泡の形成を慎重に避けます。

この混合物を等量で3つ、35 x 10 mmの未処理培養皿に充填し、CFUアッセイを行います。対照として、培養物にプラセンタ骨材を照射した。最後に、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度の培養で10〜14日間培養した後、顕微鏡下で造血コロニーを手動でカウントします。

MEFをHSCにリプログラミングする過程で、ここに示すように細胞に転写因子を形質導入します。3日間の増殖とDOXへの曝露による導入遺伝子の活性化開始後、細胞はゼラチンコーティングされたプレートと補充された造血培地上で解離、分裂、増殖します。培養の20日目に、リプログラミング培地による形質導入後、34/H2BGFP MEFは、MEFとは異なる内皮形態を含む明確な形態学的変化を採用します。

さらに35日目まで培養すると、内皮様中間体からいくつかの丸い造血様細胞が出現し、それらはGFP陽性で、造血マーカーであるSca1およびCD45に対して染色陽性です。さらに培養すると、細胞はヒトCD34レポーターの発現を維持しながらCD45を発現します。胎盤凝集時に、培養細胞はクローン形成能を獲得し、さまざまな造血形態と芽球様細胞を含むメチルセルロースにコロニーを生成します。

この手順を試みるときは、混乱しないように各セクションをゆっくりと実行することを覚えておくことが重要です。間違いは、再プログラミングを開始してから数週間後まで気付くのが難しいでしょう。この手順に続いて、誘導細胞が機能アッセイで実証されたように本当に造血機能を持っているかどうかなどの追加の質問に答えるために、丸石形成細胞アッセイや長期培養開始細胞アッセイなどの他の方法を実行することができます。

その開発後、この技術は、造血幹細胞プログラミングの分野の研究者が、血液、内皮、その他の細胞タイプにおける他のリプログラミング戦略と最適化プロトコルを探求する道を開きました。このビデオを見れば、マウス線維芽細胞に造血プログラムを誘導する方法、転写因子の過剰発現、および誘導細胞の機能アッセイの方法について十分に理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。