シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計
2016年8月13日
流体成分と統合された微細加工デバイスは、in vivoの微小環境を模倣した細胞研究のためのin vitroプラットフォームを提供します。私たちは、単一または共存する化学的/電気的/せん断ストレス刺激下での細胞応答を研究するためのポリメチルメタクリレートベースのマイクロ流体チップを開発しました。
この手順の全体的な目的は、細胞が環境刺激にどのように反応するかを観察するためのマイクロ流体デバイスを設計し、作製することです。この手法は、化学物質、せん断応力、電場などの異なる環境刺激下で細胞がどのように反応するかといった、細胞生物学およびバイオメディカルエンジニアリングにおける重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、チューブの作製と組み立てが容易であることです。また、これらのマイクロ流体デバイスは、非常に優れた能力でin-vivo条件を再現することができます。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の学部生であるTzu-Yuan Chouさんと、Dr. Julian Chungの研究室のポストドクターであるHsien-San Houさんです。まず、二酸化炭素レーザースクライバーの電源を入れ、コンピュータとの接続を確認します。次に、ここに示されているパターンのような、あらかじめ描かれたクリスマスツリーパターンをスクライバーにロードします。次に、PMMAシートまたは両面テープをスクライバーのステージの上に置きます。キャリブレーションバーと可視ヘリウムネオンレーザーを使用して、二酸化炭素レーザーの焦点を調整します。その後、基板にパターンを刻みます。完了したら、パターン基板を取り出し、不要な部分を取り除き、窒素気流を用いて表面に残った破片を洗浄します。チップの各コンポーネントについてこのプロセスを繰り返します。化学せん断応力マイクロ流体チップを組み立てます。これを行うには、刻印済みの両面テープ2枚を使用して、化学せん断応力パターンが形成されたPMMAシート3枚を貼り合わせます。ネジ山と穴の位置を合わせ、瞬間接着剤を使用して、ネジ山付きのアクリルアダプターをチップの最上層のPMMA層に取り付けます。これらのアダプターは、培地入口、出口、およびソルトブリッジコネクタとして機能します。次に、0.7 mm厚の両面テープをもう1枚チップの底に追加し、チップを直径10 cmのペトリ皿に取り付けます。組み立て後、チップを真空チャンバーに入れ、一晩放置します。次に、化学-電場チップを組み立てます。化学-電場チップ用の刻印済みPMMAシートを両面テープで直径10 cmのペトリ皿に取り付けます。チップを使用する前に、UV照射を30分間行い、滅菌します。次に、プラスチックチューブとフィンガータイトナットを介して、チップの入口を3 mlのPBSを満たしたシリンジに接続します。同様に、出口を廃棄チューブに接続します。シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げ、流路をPBSでプライミングします。シリンジを前後に動かして気泡を取り除き、その後、チップをインキュベーターに入れ一晩放置します。化学-電場チップをセットアップするには、チューブ状のナットに3%アガロースを満たしてソルトブリッジを構築します。その後、銀-塩化銀電極をチューブ状のナットに挿入します。肺がんCL1-5細胞を、10% FBSを添加したD-MEMで、コンフルエンシーが90%に達するまで培養します。その後、培地を吸引します。あらかじめ温めておいたPBSで細胞を1回洗浄します。そして、0.05%トリプシン緩衝液2 mlを直径10 cmのプレートに加えます。細胞を再び37
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概要
本研究では、流体コンポーネントを統合したマイクロファブリケーションデバイスを提示し、生体内の微小環境を密接に模倣した細胞研究用のin vitroプラットフォームを構築しました。本研究では、さまざまな刺激に対する細胞応答を調査するために設計されたポリメタクリル酸メチルベースのマイクロ流体チップに焦点を当てています。
研究の主要構成要素
科学分野
- マイクロフルイディクス
- 細胞生物学
- in vitro 研究
背景
- 微細加工デバイスは、細胞環境の研究を向上させます。
- 流体コンポーネントにより、実験条件を精密に制御することが可能です。
- 細胞応答を理解することは、さまざまな生物学的応用に不可欠です。
- ポリメチルメタクリレートは、マイクロフルイディクスへの応用に汎用性の高い材料です。
研究目的
- 制御された環境下で細胞応答を研究するためのプラットフォームを構築すること。
- マイクロ流体技術を用いてin vivoの条件を模倣すること。
- 化学的、電気的、およびせん断ストレス刺激が細胞に及ぼす影響を調査すること。
使用した手法
- ポリメチルメタクリレートを用いたマイクロ流体チップの設計および作製。
- 実験的制御を向上させるための流体コンポーネントの統合。
- 細胞応答を評価するためのさまざまな刺激の適用。
- in vivo条件を模倣するためのin vitro実験。
主な結果
- 細胞研究用マイクロ流体チップの開発に成功した。
- 環境条件を効果的に制御できることを実証した。
- 異なる刺激に対する明確な細胞応答を観察した。
- 細胞と微小環境との相互作用に関する知見を提供した。
結論
- マイクロ流体プラットフォームは、細胞の挙動を研究するための有用なツールです。
- 得られた知見は、制御された環境における細胞応答の理解に寄与します。
- 今後の応用として、薬物試験や疾患モデリングなどが考えられます。
よくある質問
産業上の重要性
化学的、電気的、およびせん断応力の刺激を精密に制御できるマイクロ流体プラットフォームは、複雑な生体内の微小環境を模倣することで、標的バリデーションのリスクを低減させるスケーラブルなアプローチをバイオ医薬品の研究開発に提供します。これらのPMMAベースのデバイスは、共存する刺激下での細胞応答のスクリーニングにおける実験スループットを向上させ、初期創薬段階におけるメカニズムの解明を支援します。この技術により、リード化合物の同定にリソースを投入する前に、より高い予測信頼性を持って標的に優先順位を付けることが可能になります。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 化学勾配、電場、およびせん断応力に対する細胞応答の解析を可能にし、疾患メカニズムにおけるパスウェイの関与を明らかにします。
- 運用上の価値： PMMA基板を用いることで、レーザーアブレーションによる低コストかつ迅速な作製が可能となり、標的仮説検証における反復的な設計をサポートします。
- 予測的価値： 定義された刺激下での活性酸素種の産生量と細胞遊走を定量化し、標的のデリスク（リスク低減）のための機能的なリードアウトを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： せん断応力または電場勾配を同時に付加した5つの濃度勾配を生成でき、単一のデバイスでマルチパラメトリックなスクリーニングを可能にする。
- 運用の価値： 複数の刺激条件を統合することで実験の繰り返し回数を削減し、化合物やsiRNAライブラリーのスクリーニングにおけるアッセイ効率を向上させる。
- 拡張性： 標準的な顕微鏡観察およびインキュベーションのワークフローと互換性があり、スクリーニングカスケードへの導入を容易にする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 並進的連続性：肺がんCL1-5細胞を疾患関連モデルとして使用し、微小環境駆動型の表現型を研究する。
- メカニズム的なリスク低減：化学的、電気的、および機械的刺激が細胞応答に寄与する要因を分離し、併用療法の戦略に情報を供する。
- 前臨床段階との整合性：遊走や酸化ストレスなどの出力結果は、転移や浸潤に関連する特徴と相関する。
パイプラインおよびワークフローの統合
このマイクロ流体チップは、刺激応答性の定量的細胞表現型を提供することで、ターゲットバリデーションと初期リードスクリーニングを橋渡しする探索段階のアッセイプラットフォームとして機能します。
- 探索生物学：がんやその他の疾患モデルにおいて、微小環境のシグナルが細胞挙動をどのように調節するかという仮説検証を支援します。
- スクリーニング：化学物質の濃度勾配や物理的刺激の勾配にわたる細胞応答の並列試験を可能にし、1回の実験あたりのデータ密度を高めます。
- 分析：客観的な比較のために、蛍光ベースのROS検出やタイムラプスでの遊走指標などの測定可能な出力を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：転移性肺がん細胞株を用いて、微小環境への応答と疾患に関連する浸潤表現型を結びつけます。
- 組織的な再利用：PMMAベースの設計により、メカノバイオロジーや薬理学研究において、一貫した刺激提供を目的としたラボ間およびプロジェクト間での再現が可能です。
運用の影響および企業への影響
- 科学的価値：単一または共存する刺激を制御して適用することで、変数の寄与を分離し、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用の価値：再現性のあるグラジエント生成を通じて刺激の提供を標準化し、繰り返し実験間のばらつきを最小限に抑える。
- 戦略的価値：生理学的に適切な条件下で、多パラメータ的な有効性と毒性の読み取り値を提供し、go/no-go決定の精度を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：刺激特異的な細胞応答を調節する化合物を特定することで、リスク調整後のターゲット優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- マイクロ流路設計、PMMAのレーザーアブレーション、および流体インターフェースの組み立てに関する専門知識が必要です。
- CO2レーザースクライバー、UV滅菌装置、およびシリンジやチューブなどの流体プライミング設備を利用できる必要があります。
- チーム間での細胞播種、刺激適用タイミング、および読み取り値の標準化が必要です。
- 他の細胞タイプに適応させる場合は、せん断応力と勾配の完全性を維持するために、チャネル寸法と流速の最適化が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、プロトコルに記載されている通り、プライミング中の気泡形成や電界設定における電極の剥離が挙げられます。
