π-πスタッキング相互作用によって安定化されたブロック共重合体ミセルの調製のための両親媒性共重合体のアニオン重合

本研究の全体的な目的は、開環アニオン重合によるブロック共重合体材料の合成に必要な重要なステップを実証し、疎水性薬物のブロック共重合体ミセル製剤化に向けた必要な研究フローを示すことです。本プロトコルでは、アニオン重合によるブロック共重合体合成に必要なステップおよび手順の適切な実行方法を実証します。開環アニオン重合の大きな利点は、高収率かつ低分散性の材料を合成できることです。

また、プロセスのスケールアップ可能性についても同様です。多くの薬剤が製剤化やブロック共重合体ミセルに依拠しており、現在は前臨床試験の最終段階または臨床開発段階にあり、高分子薬物輸送システムにとって刺激的な時期となっています。

テキストプロトコルに従って、転移に必要な試薬と材料を準備します。分子量5,000のメトキシポリエチレングリコールを秤量します。スターバーを入れた乾燥フラスコにmPEGを加え、上部のフラッシングアダプターをセプタムで密封します。

フラスコをマニホールドに接続し、アルゴンで2～3分間パージします。バルブを真空位置に回し、フラスコをパージします。フラスコを手動で回転させながら、mPEGが溶けるまで、ドライヤーまたはヒートガンを用いて反応容器を均一に乾燥させます。

1分後、マニホールドのバルブをアルゴン側へ数回素早く切り替えて真空を破り、フラスコを冷却します。ポリマーマクロ開始剤を約2時間真空下に保持し、反応開始前にアルゴン置換を行います。次に、あらかじめオーブンで乾燥させた2台の高真空蒸留装置をフード内に設置します。

一方の装置はDMSOの蒸留用、もう一方はモノマーであるフェニルグリセロールエーテルの蒸留用に使用します。それぞれのフラスコを2つの装置に接続し、半球状の加熱マントルまたはオイルバスに設置します。各装置の上部およびマニホールドに冷水を接続します。

各装置が確実に固定され、十分に密封されていることを確認します。バルブを操作して真空状態にします。温度コントローラーで加熱を設定し、溶液の攪拌を開始します。

DMSOの循環蒸留を2時間行った後、高真空バルブを閉じて約20 mLの溶液を回収します。その後、この分画をフラスコに戻し、後で回収する目的分画の純度を確保するために、この操作をもう一度繰り返します。mPEGが入ったフラスコを真空下でヒートガンを用いてポリマーが溶解するまで加熱し、再度アルゴンで充填します。

2時間後、高真空バルブを閉じ、溶媒量を回収します。加熱を停止し、マニホールドの真空を解除します。前述の手順に従い、チャンバー内にアルゴンを導入します。

アルゴンの正圧下で、カニューレの一端をメスシリンダーに、または同様にアルゴン下にあるmPEGを含むフラスコに直接接続し、もう一端を慎重に蒸留直後の画分に浸します。フラスコに予備のバブラーを接続し、アルゴンの供給を遮断して、蒸留装置内のアルゴン圧のみを利用します。アルゴン圧による事故を避けるため、ガラス製ストップコックを1〜2秒間開いてから再び閉め、DMSOの全量転移が完了するまで液の流れを継続させます。

次に、アルゴン雰囲気下で、セプタムで密閉した乾燥済みのメスシリンダーから、0.3 M ナフタレンカリウムストック溶液へカニューレの一端を接続します。その後、メスシリンダーに予備のバブラーを追加し、シリンダーへのアルゴン流量を遮断します。そして、アルゴンの正圧を利用して、ストック溶液からメスシリンダーへ 5 mL の 0.3 M ナフタレンカリウムをカニューレを用いて移送します。マニホールドからの別の針をシリンダーに挿入し、予備のバブラーを取り除きます。

ストックソリューションに接続されているカニューレを慎重に取り外し、速やかに反応フラスコに挿入して、予備のバブラーを接続します。次に、前述の手法に従い、溶液が暗色になるまで塩基を滴下します。色がゆっくりと消失した後、再び暗色が現れるまでさらに塩基を加え、全量を移し終えるまでこの操作を繰り返します。

前述の通り、ポリフェノールグリコールエーテルの重合度が約18〜20ユニットになるよう、必要な量のモノマーを反応容器に移します。完全な重合を確実にするため、アルゴン雰囲気下で絶えず攪拌しながら、80 °Cで48時間反応させます。色の消失が確認されるまで、1 N 塩酸とメタノールを数滴加えて反応を停止させます。

ヘキサンを用いてDMSO溶液からナフタレンを抽出します。減圧蒸留により、DMSOを約70 milliliters除去します。スラリー溶液を冷却し、15 millilitersのTHFを加えます。

5,000 ×gで10分間遠心分離し、スラリー溶液から塩を除去します。上澄み液を回収し、冷えた500 mLのジエチルエーテルに滴下します。濾過または遠心分離によって沈殿物を回収します。

沈殿操作を2回繰り返した後、沈殿物をドラフト内で室温にて一晩乾燥させ、次いで30 °Cの真空下で24～48時間乾燥させると、収率は85%となります。これで共重合体の特性評価を行う準備が整いました。手順はテキストプロトコルに記載されている通りです。12 mgのdoxorubicinを1 mLのアセトニトリルに溶解します。10 µLのトリエチルアミンを加え、溶液を暗所で2時間撹拌します。

45 mgの共重合体を1 mLのTHFに溶解し、同様の時間だけ攪拌します。共重合体溶液をドキソルビシン溶液に加え、共重合体が残っているバイアルを少量のTHFで洗浄します。次に、共重合体と薬剤の混合液を、15 mLの0.9%生理食塩水が入った20 mLバイアルに、攪拌しながら滴下します。

溶液を透析袋に移し、0.9% saline 500 milliliters に対して透析を行います。透析液を15 milliliterチューブに移し、5,000 ×g で15分間遠心分離します。その後、上清を透析膜を含む超ろ過システムに移します。

撹拌アダプターを限外ろ過システムにセットし、蓋を閉じて、窒素気流を導入します。ブロック共重合体ミセル溶液を4 mLまで濃縮し、新たに6 mLの生理食塩水を加えます。その後、再びブロック共重合体ミセル溶液を4 mLまで濃縮し、チャンバーを0.5 mLの生理食塩水で洗浄し、それを溶液に加えます。

得られた溶液を、次に使用するまで室温・遮光条件下で茶色のバイアルに保存します。mPEGマクロ開始剤を用いたフェニルグリセロールエーテルの開環アニオン重合により、mPEGのヒドロキシル基を深くプロトン化することで、両親媒性ジブロック共重合体を調製しました。ナフタレンカリウムをラジカルアニオンとして用い、続いてフェニルグリセロールエーテルモノマーの重合を行いました。

ゲル浸透クロマトグラフィーおよびプロトンNMR分光分析によるブロック共重合体の特性評価により、フェニルグリセロールエーテルの重合度が15ユニットであり、分子量分布が狭いことが確認されました。水性媒体中において、この両親媒性ブロック共重合体は自己組織化して、疎水性コアを親水性シェルが囲むミセルを形成します。透過型電子顕微鏡により球状の形態が確認され、動的光散乱法では25 nano metersの流体力学的直径が示されました。

ドキソルビシンをブロック共重合体ミセル内に封入することに成功した。溶液中の遊離したプロトン化薬物と比較して、蛍光分光法で観察されたドキソルビシンの自己消光により、薬物がポリマーミセルに組み込まれたことが確認され、薬物封入量は最大14%に達した。ブロック共重合体ミセルからのドキソルビシンの放出プロファイルは、中性pHにおいて本製剤が高い安定性を有することを示しており、生理的に適切な条件下で4日間にわたる薬物の徐放が確認された。

この手法を習得することで、薬学系の研修者は薬物輸送への応用に向けたジブロック共重合体の合成を準備できるようになります。ここに記載される手順は、PEGを開始剤とする幅広い共重合体の合成に適用可能です。ここでは、無水条件を確保し、高品質な材料を得るための良好な実験室習慣（GLP）を徹底することに重点を置いています。

このビデオを視聴後、無水条件下での操作方法を十分に理解し、これらの手順をPEGポリエステルまたはPEGポリエステル材料の合成に適用できるようになるはずです。記載されている研究を遂行する際は、潜在的に有害な有機溶媒やその他の薬剤を用い、制御された条件下で作業していることを忘れないことが不可欠です。さらに、すべての薬剤には毒性があるため、必要な予防措置を講じて取り扱わなければなりません。

例えば、手袋、白衣、つま先の隠れた靴を着用し、薬物を秤量する際はマスクを着用してください。