聴覚HEI-OC1細胞を使用した作業

このプロトコルの全体的な目標は、HEI-OC1細胞を使用するための基本的な手順を説明することです。これは、聴覚細胞に対する薬理学的薬物の影響を研究し、モータータンパク質プレスチンの機能特性評価を支援するために使用できます。HEI-OC1細胞は、世界中の多くの研究者によって、さまざまな目標や技術を用いてさまざまな実験で使用されています。うまくいけば、ここで説明する手順が、これらの研究を比較可能にするための共通の基盤を提供するでしょう。

もちろん、これらの実験手順はさらに改善される可能性があります。しかし、ここで説明したものとの違いが、矛盾する可能性のある結果を理解し、説明するための鍵となる可能性があります。このデモンストレーションでは、凍結アリコートからサンプルの準備が整い、広く利用可能な技術でさまざまな研究を行う準備が整うまで、HEI-OC1細胞の操作方法について説明します。

この手順を開始するには、凍結保存されたHEI-OC1細胞のバイアルを液体窒素から取り出し、摂氏37度の水浴に入れます。バイアルの下半分だけを沈め、バイアルに少量の氷が残るまで解凍します。生物学的安全キャビネットで、バイアルの外側を70%アルコールで拭きます。

次に、バイアルから細胞をピペットで移動し、10%FBSを添加したDMEMなどの予熱培地10ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐管に、全容量を一滴ずつゆっくりと送液します。次に、チューブを5分間遠心分離してDMSOを取り出します。5分後、上清を捨て、細胞を9ミリリットルの新鮮な増殖培地に再懸濁します。

ピペットの先端がチューブの底に触れるようにして、懸濁した細胞をピペットと培地の間で3〜4回フラックスおよび還流することにより、細胞の塊またはシートを解凝集します。次に、増殖培地に懸濁した細胞の全量を、直径100mmの未処理のプラスチック細胞培養皿に入れます。細胞を摂氏33度で10%CO2とインキュベー

このステップでは、古い培地を取り出し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。次に、細胞単層を0.25%トリプシンで覆います。倒立顕微鏡を使用して、細胞の40%が分離された状態で細胞を検査します。

必要に応じて、培養皿を静かに揺らして、残っている付着細胞を放出します細胞を再懸濁し、チューブを5分間遠心分離してトリプシンを除去します。その後、上清を捨て、細胞を9ミリリットルの新鮮な増殖培地に再懸濁します。次に、ピペットの先端がチューブの底に触れるようにして、懸濁した細胞をピペットと培地の間で3〜4回フラックスおよび還流することにより、細胞の塊またはシートを解凝集します。

直径100mmの細胞培養皿に細胞を播種します。摂氏33度で10%CO2でインキュベートし、計画された実験や新しいストックの生成に必要な回数だけ分割します。分化のためには、HEI-OC1細胞を許容条件でインキュベートし、約80%のコンフルエントに達するまで培養します。

その後、細胞を摂氏39度で5%CO2で2〜3週間インキュベートし、1日おきに培地を交換して死んだ細胞を取り除きます。この手順は、自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞をカウントし、細胞濃度を必要な値に調整することから始めます。次に、96ウェルクリアフラットボトムプレート、白壁の96ウェルプレート、または6ウェルプレートに細胞を播種する。

特定のアッセイで必要な場合は、目的の薬物で細胞を処理する前に、細胞を一晩インキュベートして基質を付着させます。次に、フローサイトメトリーまたは別の適切な技術によって治療の結果を測定します。細胞を採取するには、10ミリリットルのカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで細胞を2回洗浄します。

酵素を含まないデタッチャー溶液を2ミリリットル加え、細胞を摂氏37度で5%CO2で3分間インキュベートします。必要に応じて、細胞培養皿を静かに動かしてより多くの細胞を切り離し、振らないように注意してください。

次に、10ミリリットルのDMEMと10%FBSを加え、細胞を5回静かに上下にピペットで動かします。その後、顕微鏡で細胞を見てください。細胞の80%以上がすでに分離されている場合、それ以上のピペッティングは必要ありません。

細胞がまだクラスターにある場合は、細胞の80%以上がクラスターからなくなるまで、ゆっくりとピペッティングを続けます。細胞の光学制御は、滑らかな膜エッジを持つ多くの単一の丸い細胞を示すはずです。その後、テキストプロトコルで説明されているように、パッチクランプとNLC測定に進みます。

非許容条件で培養したHEI-OC1細胞は、細胞生存率が非常に有意に低下し、許容条件での細胞培養と比較して細胞死が同様に有意に増加しました。すでに死滅している細胞や生存率が低下した細胞に対する薬物効果は、健康な細胞に対する同じ薬物の影響とは異なる可能性があるため、NP-HEI-OC1細胞に対して実施される細胞毒性試験では、薬物効果と培養条件の影響を区別するためにかなりの努力を払う必要があります。そのため、特に分化細胞を必要としない実験には、許容条件で培養したHEI-OC1細胞を使用することをお勧めします。

ここに示す共焦点画像は、摂氏33度および摂氏39度で培養したHEI-OC1細胞における聴覚モータータンパク質プレスチンの発現を確認しています。プレスチンは、主に許容条件で増殖するHEI-OC1細胞の細胞質で免疫局在化し、より分化した細胞では原形質膜により集中することに注意してください。フローサイトメトリーの研究では、両方の条件でプレスチン発現が明らかに増加していることが示され、転座がより多くのプレスチン分子の合成を伴うことが示唆されています。

一方、電気生理学的研究では、摂氏33度で増殖するHEI-OC1細胞では、細胞が1週間と2週間非許容条件に移動すると、ピーク値が減少し、ピーク容量の電圧がより脱分極した値にシフトする、堅牢なNLCが示されました。興味深いことに、これらの結果は、原形質膜内のプレスチン分子の密度が高すぎると運動機能が損なわれる可能性があることを示唆しています。ここで説明するプロトコルでは、確立された細胞培養技術を正しく使用する必要があることを覚えておくことが重要です。

また、抗生物質の使用を避けることを忘れないでください。さらに、HEI-OC1細胞の表現型と応答は、培養パラメータに強く依存することを忘れないでください。