Name: 聴覚HEI-OC1細胞を使用した作業 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶHEI-OC1細胞の標準培養法と薬理学的薬剤の細胞毒性評価、モーター蛋白質プレスチンの機能解析手法。聴覚研究における再現性向上とデータ比較の基盤となる実験プロトコルを解説します。

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この作業はNIH助成金R01-DC010146およびR01-DC010397によって支援されました。その内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

<ol><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
<li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells%3A+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li>
<li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li>
<li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li>
<li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li>
<li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
<li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).</li>
<li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li>
<li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li>
<li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%2221st+Midwinter+Meeting+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li>
<li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis%3A+in+vitro+and+in+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necrosis%3A+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
<li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+necrosis%3A+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
<li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+signaling+of+the+Fas+receptor%3A+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin%27s+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li>
<li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+Oxygen+Tension%3A+Relation+to+Blood+Flow+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li>
</ol>

著者は、既存または潜在的な利益相反がないことを宣言しています。

このレポートでは、どのように文化HEI-OC1細胞をに説明し、薬剤誘発性細胞毒性のメカニズムを評価するためにそれらを使用し、プレスチン、蝸牛OHCSの分子モーターの機能特性を調査します。技術的手順は、しかしながら、容易に別の試験に適合することが十分に一般的です。 ここで説明するすべてのプロトコルは、十分に確立された細胞培養技術10の正しい使用を必要とします。ただ、他の細胞株と同様に、HEI-OC1細胞での作業は認定生物学的安全キャビネット、冷却遠心機、水浴、および細胞培養物の検査のための1つの倒立顕微鏡を用いてカウントを細胞について適切に装備した細胞培養施設を必要とし、 hemocytometric技術を使用している場合。固有の要件は、しかしながら、NP-HEI-OC1細胞39℃/ 5％CO 2でのP-HEI-OC1細胞を33℃/ 10％CO 2で2加湿インキュベータ、一組の利用可能性およびその他であります秒。計画された研究のみがP-HEI-OC1細胞を含む場合、第二のインキュベータを37℃/ 5異なるアッセイについ...

コルチ1のハウス耳研究所-臓器（HEI-OC1）細胞は、トランスジェニックマウスの1,2の聴覚器官に由来しています。 33℃/ 10％CO 2（許容条件）で、このトランスジェニックマウスからの任意の細胞のインキュベーションは、脱分化と加速増殖をトリガーする不死化遺伝子の発現を誘導します。 39℃/ 5％CO 2の少なくともHEI-OC1、細胞死2,3の場合には、増殖、分化を減少した（非許容条件）リードに対して細胞を移動させます。 HEI-OC1細胞をクローニングし、十年以上前に私たちの研究室で特徴付けられ、そして初期の研究は、彼らが特定のそのようなプレスチン、ミオシン7aと、のAtoh1、BDNF、カルビンジンおよびカルモジュリンなどの蝸牛有毛細胞のマーカーだけでなく、支援のマーカーを発現することが示されましたコネキシン26及び線維芽細胞増殖因子受容体（FGF-R）2のような細胞です。したがって、それはHEI-OC1はのCommoを表すことが示唆されましたコルチ2の器官の感覚と支持細胞のためのn個の前駆細胞。薬は、非耳毒性考えながら並列研究はペニシリンのように、2,3なかった、シスプラチン、ゲンタマイシンおよびストレプトマイシンのような典型的な耳毒性薬が誘発されることをこれらの細胞におけるカスパーゼ3活性化を強力な証拠を提供しました。従って、この細胞株は、耳毒性に関与する細胞および分子機構を調査し、新しい薬理学的薬剤の潜在的な耳毒性またはotoprotective特性のスクリーニングするためのインビトロ系として提案されました。 HEI-OC1細胞を、過去10年間に発表された百以上及び五十の研究において使用されていると推定されます。 異なる薬剤の潜在的なプロアポトーシス効果を見ているが、この細胞株を含む研究のほとんどの主要な目標であったが、オートファジーと老化のような他の重要な細胞プロセスはちょうどHEI-OC1細胞4-7で調査され始めています。私naが我々の研究室8からの最近の研究では、我々は頻繁に診療所で使用される異なる薬理学的薬剤によって誘導される細胞死、生存、増殖、老化およびオートファジーに関するデータの包括的なセットを収集するためにHEI-OC1の細胞を使用しました。我々はまた、同一の治療を受けてHEK-293（ヒト胎児腎臓細胞）およびHeLa細胞由来のもの（ヒト上皮細胞）でHEI-OC1細胞の応答の一部を比較しました。我々の結果は、HEI-OC1細胞を、試験下のメカニズムの少なくとも1つに特有の用量及び時間依存性の感度で、特性ようにザ各薬物に応答することが示されました。また、実験結果の正しい解釈は、複数の技術8と平行した研究を行う必要がありますことをその研究に強調しました。 別の研究では、プレスチンの機能的応答を評価するためのHEI-OC1細胞の使用、蝸牛外有毛細胞のモータータンパク質（OHCS）9を調査しました</s&gt;アップ。私たちは、許容（P-HEI-OC1）および非で培養HEI-OC1細胞におけるプレスチン発現パターンと同様に、非線形容量（NLC）および全細胞パッチクランプ研究にフローサイトメトリーおよび共焦点レーザー走査顕微鏡研究報告しました許容（NP-HEI-OC1）条件。我々の結果は、NP-HEI-OC1細胞で時間依存的に総プレスチン発現および原形質膜局在化の増加の両方。興味深いことに、我々はまた、全細胞発現の有意な変化なしに細胞質への形質膜からトランスロケーションのNa + K + ATPアーゼの減少と相関NP-HEI-OC1の細胞の細胞膜でのプレスチンの局在の増加ことがわかりました。また、我々は、P-HEI-OC1細胞は原形質膜に存在するプレスチン分子の密度が増加したときに減少し、運動機能を、プレスチンに関連付け堅牢なNLCを有することを実証しました。要するに、これらの結果は、HEI-OCの有用性をサポート1細胞は、聴覚タンパク質を調査します。 このビデオの記事では、我々は文化HEI-OC1細胞に、なぜ薬剤誘発性細胞毒性のメカニズム/秒を評価する方法、細胞毒性研究のために許容条件（P-HEI-OC1）で増殖する細胞を使用するのが便利であるとどのように方法について説明します電気生理学的研究を行うために（ 例えば 、パッチクランプ、非線形キャパシタンス（NLC））はプレスチン、蝸牛OHCSの分子モーターの機能的特性を調べました。

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1細胞</td><td></td><td></td><td>すべてのアッセイキット、機器&nbsp;</td></tr><tr><td>クラスII 生物学的安全キャビネット</td><td>Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>と</td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PREVIOUS 2 COLUMNSに示されている企業は、</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXAMPLESのみであり、他の同様の</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>製品を使用することができます。</td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>2つのセルインキュベーター、1つは33°C;C/10% CO2 およびその他 39°C;C/5% CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ、PS、100 mm x 20 mm ベント付き</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ、PS,&nbsp; 60 mm x 15 mm ベント付き&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar組織培養フラスコ&nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar組織培養フラスコ550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;6ウェル細胞培養プレート、蓋付き-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 組織培養プレート、96ウェル、蓋付き平底</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate、チミー、96ウェル白、クリアボトム</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml キャップ付きポリプロピレン円錐管 Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml ポリプロピレン コニカル チューブ キャップ付き-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル」s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25%&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay&nbsp; キット</td><td>Promega</td><td>&nbsp;G8091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU細胞増殖アッセイキット&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>非酵素的細胞解離溶液&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit</td><td>Promega</td><td>&nbsp;G8741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII機器&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>&nbsp;FACSAriaIII</td><td>488 nm励起(青色レーザー)</td></tr><tr><td>デジタルブロットスキャナー</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動およびブロッティングユニット</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Puller for preparationパッチ電極</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

聴覚hei-oc1細胞を使用した作業

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1は、研究目的で利用可能な数少ないマウス聴覚細胞株の一つです。もともとは耳毒性薬物のスクリーニングのためのin vitroシステムとして提案されましたが、これらの細胞は、薬物活性化アポトーシス経路、オートファジー、老化、細胞保護のメカニズム、炎症反応、細胞分化、薬理学的薬物の遺伝的およびエピジェネティックな影響、低酸素症の影響、酸化および小胞体ストレスの影響、および分子チャネルと受容体の発現の研究に使用されてきました。蝸牛有毛細胞のいくつかの重要なマーカーの中で、HEI-OC1細胞は、外側の有毛細胞のパラダイムモータータンパク質であるプレスチンを内因的に発現します。したがって、この重要な聴覚タンパク質の新たな機能的側面を解明するのに非常に有用です。HEI-OC1細胞は非常に堅牢で、通常、その培養は大きな合併症をもたらさない。ただし、ストレプトマイシンやその他の抗生物質を含む一般的な抗菌カクテルの使用を避けることや、細胞増殖を刺激するために33°Cでインキュベーションしたり、細胞分化を誘発するために39°Cでインキュベーションしたりするなど、いくつかの特別な条件が必要です。ここでは、HEI-OC1細胞の培養方法と、細胞増殖、生存率、死死、オートファジー、老化などの一般的なアッセイでの使用方法、およびパッチクランプおよび非線形静電容量測定の実施方法について説明します。

最近の出版物のカップルで、私たちはいくつかの一般的に使用される薬理学的薬剤へのHEI-OC1細胞の応答を評価するだけでなく、プレスチン機能8,9を調査することを目的とした研究の包括的なセットを報告しました。これらの研究において、我々は、前のセクションで説明したすべてのプロトコルを利用しました。 これらの先行研究の結果の一つは、非許容条件下で培養HEI-OC1細胞を、（39℃/ 10％CO 2 = NP-HEI-OC1）は細胞生存率の非常に有意な減少、および同様に有意な増加を示したことでした細胞死で、許容条件下で培養した細胞に対して、（33℃/ 10％のCO 2 = P-HEI-OC1）（ 図1）。したがって、任意の細胞毒性試験は、培養条件の影響から識別薬物効果にかなりの努力を捧げべきNP-HEI-OC1細胞上で行いました。 additioで細胞に対する薬...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) は、現在研究目的で利用可能な数少ないマウス聴覚細胞株の一つです。このプロトコルでは、HEI-OC1細胞を使用して、薬理学的薬物の細胞毒性効果と内耳タンパク質の機能特性を調査する方法について説明します。

聴覚HEI-OC1細胞を使用した作業

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

本プロトコルの目的は、聴覚細胞に対する薬理学的薬剤の影響の研究や、モータータンパク質であるprestinの機能特性解析に利用可能なHEI-OC1細胞を扱うための基本手順を記述することです。HEI-OC1細胞は、世界中の多くの研究者によって、さまざまな目的で、異なる手法を用いた多様な実験に利用されています。ここに記載する手順が、これらの研究の比較可能性を高めるための共通の基盤となることが期待されます。もちろん、これらの実験手順はさらに改善される可能性があります。しかし、ここでの記述との相違点こそが、矛盾する可能性のある結果を理解し説明するための鍵となる場合があります。本デモンストレーションでは、凍結保存された分注試料から開始し、広く普及している手法を用いてさまざまな研究を実施可能なサンプルを準備するまでの、HEI-OC1細胞の取り扱い方法について説明します。この手順を開始するには、液体窒素から凍結保存されたHEI-OC1細胞のバイアルを取り出し、37°Cのウォーターバスに入れます。バイアルの下半分のみを浸し、バイアル内に少量の氷が残るまで解凍します。バイオセーフティキャビネット内で、バイアルの外側を70%アルコールで拭き取ります。次に、バイアルから細胞をピペッティングし、10% FBSを添加したDMEMなどの予熱した増殖培地10 mLが入った15 mLコニカルチューブに、全量をゆっくりと一滴ずつ滴下します。続いて、チューブを5分間遠心分離してDMSOを除去します。5分後、上清を捨て、新鮮な増殖培地9 mLで細胞を再懸濁します。ピペットの先端をチューブの底に触れさせながら、懸濁した細胞をピペットと培地の間で3〜4回吸引・吐出（フラクシングおよびリフラクシング）し、細胞の塊やシート状の凝集を分散させます。次に、増殖培地に懸濁した細胞の全量を、直径100 mmの未処理プラスチック細胞培養ディッシュに移します。細胞を33 °C、10% CO2条件下でインキュベートします。このステップでは、古い培地を除去し、2 mLのPBSで細胞を洗浄します。次に、細胞単層を0.25% trypsingで覆います。細胞の40%が剥離した時点で、倒立顕微鏡を用いて細胞を確認してください。必要に応じて、培養皿を静かに揺らして、付着して残っている細胞を遊離させます。細胞を再懸濁し、チューブを5分間遠心分離してトリプシンを除去します。その後、上清を捨て、9 mLの新鮮な増殖培地で細胞を再懸濁します。次に、ピペットチップをチューブの底に接触させながら、懸濁した細胞をピペットと培地の間で3〜4回吸い上げと吐き出しを繰り返し、細胞の凝集塊やシート状の集団を分散させます。細胞を直径100 mmの細胞培養ディッシュに播種します。10% CO2、33 °Cでインキュベートし、計画している実験や新しいストックの作成に必要な回数だけ継代してください。分化させる場合は、HEI-OC1細胞が約80%コンフルエンスに達するまで許容条件下でインキュベートします。その後、細胞を39 °C、5% CO2条件下で2〜3週間インキュベートし、死細胞を除去するために1日おきに培地を交換します。まず、自動細胞カウンターまたは血球計数器を用いて細胞数を計測し、細胞濃度を必要量に調整します。次に、96ウェル透明平底プレート、96ウェル白壁プレート、または6ウェルプレートに細胞を播種します。特定のアッセイで必要な場合は、目的の薬剤で処理する前に、基質への接着のために細胞をオーバーナイトでインキュベートします。その後、フローサイトメトリーまたはその他の適切な手法を用いて、処理の結果を測定します。細胞を回収するには、カルシウムおよびマグネシウム不含PBS 10 millilitersで2回洗浄します。酵素不含のデタッチャー溶液を2 mL加え、37 °C、5% CO2条件下で3分間インキュベートします。倒立顕微鏡を用いて、細胞が剥離しているかを確認してください。必要に応じて、細胞培養ディッシュを静かに動かしてさらに細胞を剥離させますが、激しく振らないように注意してください。次に、10%FBSを含むDMEMを10 milliliters加え、細胞を緩やかに5回ピペッティングします。その後、顕微鏡下で細胞を確認してください。80%以上の細胞がすでに分離していれば、それ以上のピペッティングは不要です。細胞がまだ凝集している場合は、80%以上の細胞が凝集から解消されるまで、緩やかにピペッティングを続けてください。光学的に細胞を確認した際、膜の縁が滑らかな単一の円形細胞が多く見られる必要があります。その後、テキストプロトコルに記載されている通り、パッチクランプおよびNLC測定に進みます。非許容条件で培養したHEI-OC1細胞は、許容条件で培養した細胞と比較して、細胞生存率の著しい低下と、同様に著しい細胞死の増加を示しました。すでに死滅しつつある細胞や生存率が低下している細胞に対する薬物の効果は、健全な細胞に対する同一薬物の効果とは異なる可能性があるため、NP-HEI-OC1細胞を用いて細胞毒性試験を行う際は、培養条件による影響と薬物による効果を区別することに十分な注意を払う必要があります。したがって、分化細胞を特に必要としない実験には、許容条件で培養したHEI-OC1細胞を使用することを推奨します。ここに示す共焦点画像により、33 °C および 39 °C で培養した HEI-OC1 細胞における聴覚運動タンパク質 prestin の発現が確認されました。permissive 条件で増殖している HEI-OC1 細胞では、prestin の免疫局在は主に細胞質にあるのに対し、より分化した細胞では細胞膜に高度に集積していることに注目してください。フローサイトメトリーによる解析では、両条件において prestin の発現が明らかに増加しており、転位に伴ってより多くの prestin 分子が合成されたことが示唆されました。一方で、電気生理学的研究により、33 °Cで培養したHEI-OC1細胞に強固なNLCが認められましたが、細胞を非許容条件に1週間および2週間置くと、ピーク値は減少し、ピークキャパシタンス時の電圧はより脱分極側にシフトすることが示されました。興味深いことに、これらの結果は、細胞膜におけるprestin分子の密度が高すぎると、モーター機能が損なわれる可能性を示唆しています。本稿で述べているプロトコルを遂行するには、確立された細胞培養技術を正しく使用することが重要であることに留意してください。また、抗生物質の使用を避けるようにしてください。さらに、HEI-OC1細胞の表現型および反応性は、培養条件に強く依存することを忘れないでください。

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生物学

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