Name: マウスの卵巣脂肪パッドに移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶマウスの卵巣脂肪パッド移植法で女性生殖道上皮の分化・再生・腫瘍化を研究する手法。この技術は細胞と組織片の移植に適し、手術とイメージングが容易で、再生医療やがん研究への応用が期待されます。

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我々は、ヒト細胞HIO118を提供するために、博士アンドリューK.ゴドウィン、カンザス大学メディカルセンターに感謝したいと思います。 （; T028095 NYSTEM）と子の健康とAFNの人間開発（P50HD076210）の健康/国立研究所の国立研究所、およびNYSTEM（C028125、C024174からの助成金によってこれらの研究は、ニューヨーク幹細胞プログラムからの助成金によってサポートされていましたT028095）、アインへの健康/国立癌研究所（CA182413）および卵巣がん研究基金（327516）の国立研究所。

記載されている全てのin vivoでの作業は、コーネル大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 卵巣の脂肪パッドのアッセイのための1.サンプルの準備<ol><li>プライマリ卵管上皮の単離および培養（TE）細胞<ol><li> COにより8週齢の処女βアクチン強化緑色蛍光タンパク質（EFGP）またはβアクチンディスコソマ赤色蛍光タンパク質（DsRedの）マウスに頸椎脱臼に続いて2投与を供与6-安楽死させます。つま先のピンチによって成功した安楽死を確認します。 </li><li>吸収性ドレープの個々のマウスを置き、腹側を上にしてから、70％エタノールで腹部を拭いてください。身体正中線で横切開を行うことで、指先がマウスの頭部と尾​​部に向かって切開部の上下に皮膚を引っ張ると皮膚を開きます。 </li><li>鈍ピンセットを用いて腹膜を持ち、体腔を開くために細かいハサミでカットしてください。ゆっくりintestinのコイルをプッシュ脇電子と生殖器官を見つけます。 </li><li>細かい鉗子で1子宮角をピックアップし、子宮角が分離点以上0.5cmにカット。子宮角を保持しながら、子宮角、卵管、卵巣および卵巣の脂肪パッドに取り付けられた結合組織を離れて解剖。 6ミリリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で皿に解剖生殖器官を置きます。第二の生殖器官に進みます。 </li><li>バイオセーフティキャビネットに皿を移し、6ミリリットル滅菌PBSで組織を3回洗浄します。バイオセーフティキャビネットにある解剖顕微鏡下での作業を続行します。細かいピンセットで子宮角をつかみ、子宮卵管接合部で切断することによって卵管から子宮角を切断します。 25 G針を使用して卵巣を囲む卵嚢を切り取ります。 注：卵巣嚢を除去した後、切開が完了すると、個々の卵管にPBS溶液中に残ります。 </li><li> SINGLを転送3.5センチメートル皿にPBSの50μlのドロップでの電子の卵管と28ゲージの針を使用して、0.1ミリメートル片にミンチ。 200μlの消化緩衝液1（ダルベッコ改変イーグル培地300ユニットml -1のコラゲナーゼおよび100ユニットml -1のヒアルロニダーゼを補った（DMEM）F12（ハム）培地）に移し、5％CO中で37℃で1時間インキュベート2インキュベータ。 </li><li>インキュベーション後に1mlのを0.25％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加し、3分間、1mLのピペットチップ（別名ブルーチップ）の助けを借りて20倍溶液を中断する。 （ハム）培地は、2％ウシ胎児血清を含む5ミリリットル+ 4°C DMEM / F12を追加します。 </li><li> （（ハム）媒体は7ミリグラムml -1のディスパーゼIIおよび10μgml -1のデオキシリボヌクレアーゼIを補充し、遠心分離（600 RCF、5分間、室温（RT））、によって組織を収集し、1ミリリットルの消化緩衝液2（DMEM F12キーを追加します。 DNアーゼI））。 1ミリリットルピペットTIの助けを借りて、組織ペレットを20回サスペンドP。 </li><li> 5ミリリットルの無血清完全なマウス卵管上皮成長培地（M-TE-GM、表1）を追加します。 </li><li>遠心分離（600 RCF、5分、RT）によって細胞を収集します。中断し、血球計数器により細胞をカウントし、1ミリリットルM-TE-GMを追加します。シード1×10 5 24ウェル低接着プレートでウェルあたり1ミリリットル中の細胞と4日間、5％CO 2インキュベーター中37℃でM-TE-GMでインキュベートします。 </li><li>毎日培地を変更します。 </li><li> βアクチン-EGFPまたはβアクチンのDsRedマウスから培養された一次懸濁液TE細胞の単一細胞懸濁液を準備します。 <ol><li> 24ウェル低接着プレートからTE懸濁培養物を収集します。遠心分離（600 RCF、5分、RT）、そして1mlの0.25％トリプシン-EDTAで細胞ペレットを懸濁します。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で10分間インキュベートします。 </li><li> 5％ウシ胎児血清を含む（ハム）培地を5ミリリットルのDMEM / F12を追加することにより、トリプシン活性を停止します。遠心分離（600 RCF、5分、RT）によって細胞ペレットを収集します。 </li></ol></li><li>洗浄細胞ペレットを冷PBSで2回（4°C）の4ミリリットルで、細胞ペレットあたり1mlのPBSを追加し、一時停止します。血球計数器により細胞をカウントし、1.7ミリリットルの遠心分離管に移します。氷の上で作業し、10μlのPBSに1×10 5個の細胞を追加し、その後、10μlの基底膜マトリックスを追加します。動物室に氷上でサスペンドと輸送。 注意：滅菌条件下でバイオセーフティキャビネット内のすべての解剖および組織培養作業を実行します。 </li></ol></li><li>不死化ヒト細胞株の作製<ol><li>別に成長レンチウイルス-EGFPと-mCherry標識ヒト不死化卵巣表面上皮細胞lineHIO118は80時まで- 5％CO 2インキュベーター内で37℃で10センチの皿に90％の密集度。 </li><li> 10 mlのPBSで二回洗浄皿、皿毎に1 mlの0.25％トリプシン-EDTAを添加し、5％CO 2インキュベーター中で37℃で10分間インキュベートします。 10 mlのDMEM / F12 5％ウシ胎児血清を含む（ハム）培地を添加することにより反応を停止させます。収集します遠心分離により細胞ペレット（600 RCF、5分、RT）。 </li><li>洗浄細胞ペレットを冷PBSで2回（4°C）10mlで、細胞ペレットあたり1mlのPBSを追加し、一時停止します。血球計数器により細胞をカウントし、1.7ミリリットルの遠心分離管に移します。 </li><li>氷の上で作業し、1.0×10 6レンチ-mCherryを標識細胞+ 1.0×10 6レンチ-EGFPは、10μlのPBSに細胞を標識した追加します。 10μlの基底膜マトリックスを追加します。動物室に氷上でサスペンドと輸送。 </li></ol></li><li>卵管の調製<ol><li> 1.1.1-1.1.5の手順で説明するように、6-から、PBS中の8週齢の処女βアクチンのDsRedマウスに個々の子宮管を解剖。解剖顕微鏡下で200μlのPBSのドロップに単一の子宮管を転送します。そっと卵管間膜、卵管のセグメントをサポートする広範な靱帯の部分を除去することにより、ピンセットと28ゲージの針の助けを借りて、子宮管をほどきます。 2のドロップで単一の非コイル状子宮チューブを入れます00μlの氷冷PBS受信者の卵巣の脂肪パッドが露出し、移植を受けるために準備されるまで。 </li></ol></li></ol> 2.卵巣の脂肪パッド移植注：各動物の手術の間に器具を消毒します。事前にすべての機器を準備し、手配。これは脾臓を回避するように、右側の卵巣の脂肪パッドに背移植が優遇されています。ただし、受信者は両方の卵巣の脂肪パッドで移植を有することができます。 <ol><li>初代細胞のレシピエントとして同系マウスまたは重症複合免疫不全（SCID /のNCr）マウスを使用してください。ヒト細胞のようなHIO118細胞、使用NOD / SCID /γ（NSG）マウスまたはSCIDマウスの場合。 </li><li> 0.15ミリリットル/ 10g体重の用量で2,2,2-トリブロモエタノールの単一腹腔内注射でレシピエントマウスを麻酔。動物のフードに、加熱パッド上で動物を置き、ペダル反射（つま先ピンチ）の損失によって適切な麻酔を確認します。しばらく乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。動物は麻酔下です。術後疼痛のために治療するために、4ミリグラム/ g体重の用量で鎮痛剤ケトプロフェンと動物の皮下に注入します。 注：別の方法として、麻酔のためにイソフルランを使用しています。誘導室で動物を置き、0.8から1.5 L /分で2〜3％のイソフルラン気化器に酸素流量計を調整します。チャンバーから麻酔した動物を削除し、それがマスクからイソフルランを呼吸し、手術を開始した後、1.5％に0.4〜0.8リットル/分およびイソフルラン気化器に酸素流量計を設定してみましょう。 </li><li> ＃40バリカンで手術領域を剃ります。エリアから毛を取り除く2回手術領域、70％エタノールに続いポビドンヨードの3消毒スクラブで剃毛した皮膚を準備し、滅菌ドレープでカバー。 </li><li>バイオセーフティキャビネットにある解剖顕微鏡下で動物を移動します。直接卵巣の脂肪パッド上記背内側の位置で切開することにより生殖器官を公開します。 注：クリティカルiCalのステップ：正確な皮膚切開は創傷治癒を促進し、メスの使用は、ステップ2.4​​で推奨されています。 </li><li>鈍細かい鉗子を使用すると、神経や主要な血管へのダメージを最小限に抑え、正中線に向かって切開によって慎重に卵巣の脂肪パッドを引き出します。 重要なステップ：出血が発生した場合は、手術を中止し、別の宿主動物に移植することを検討してください。 </li><li> 28ゲージベベル針の助けを借りて、解剖顕微鏡の制御下で3〜4ミリメートル卵巣の上に、卵巣の脂肪パッドに2〜4ミリメートルの深い切開を行います。 重要なステップ：切開だけ脂肪パッドの半分を通過していることを確認してください。底面までのすべての方法を穿刺して、漏れが発生します。迅速であることと、この工程の後遅滞なく進行します。 </li><li>細胞移植のために、細胞基底膜マトリックス混合物の10から20μlのシリンジ（30ゲージの針）を記入し、脂肪パッドの切開部に注入します。卵管移植の場合、卵管のウィットを拾いますH細かい鉗子と10での場所 - 20μlの基底膜マトリックスは、氷上に保持しました。 0.1〜10/20μLをUsing XLは（3ミリメートル短縮）フィルターチップtissueと基底膜マトリックスサスペンションをピックアップし、脂肪パッド切開への放出を卒業し​​ました。 </li><li>基底膜マトリックスが固化し、バック腹膜への生殖器官を配置するための5分待ちます。 2外科手術用縫合糸のstichesと2小傷クリップまたは縫合糸で皮膚と筋肉を閉じます。 </li><li>繰り返して、コントロールとなる動物の対側脂肪パッドにPBS-基底膜マトリックス混合物を移植するために2.4から2.8を繰り返します。 重要なステップ：熱損失は、麻酔したマウスで急速であるため、手術後、加熱パッド上に動物を配置します。 </li><li>動物が本来のケージに加熱パッド上で回復し、麻酔から完全に目を覚ましまで動物を観察してみましょう。それは胸骨を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでくださいリットルの横臥。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。 </li><li>手術後のケージの上に食べ物を乾燥させるだけでなくケージの中にプリウェットフードペレットの一握りを置きます。必要に応じて、次の数日間、術後の鎮痛剤を適用し、毎日の傷を調べます。創傷感染が発生した場合、承認された動物プロトコルに従って抗生物質を適用します。傷が完全に閉じていたときに、10日手術後の創傷クリップを削除します。 </li></ol> 3.組織学および画像取得<ol><li>グラフト収集と保存<ol><li> 26ミリリットルのddH 2 Oで4ミリリットル10×PBSおよび10ミリリットル16％パラホルムアルデヒド溶液を混合することにより、4％パラホルムアルデヒド溶液を準備します。 </li><li>手順で説明するように、1つのブロック、移植した卵巣の脂肪パッド、卵巣、卵管0.5センチ子宮内解剖1.1.1-1.1.4。すぐに2ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド中に入れ、室温で、2時間固定します。同じ動物から、非生着解剖対照としてPBS-基底膜マトリックス混合物を移植した反対側の卵巣の脂肪パッドシステム（ステップ2.9参照）。同じように修正して、プロセス。 </li><li>固定の洗浄の後5分間、PBSで3回組織し、4℃でPBS中で一晩インキュベートします。 </li><li>卵巣の脂肪パッドのホールマウントイメージングのために3.2.1に進みます。 注：画像取得組織を凍結（3.3.1）またはパラフィン包埋（3.3.2）のために処理することができた後。 4℃でPBS中30％スクロース中で一晩インキュベートし、凍結組織の品質を改善します。 </li></ol></li><li>画像収集<ol><li>落射蛍光アタッチメントおよび高精細カラーカメラ4と、10倍対物レンズ、蛍光取り付け、カラーカメラとプランを備えた実体顕微鏡を備えた倒立顕微鏡を用いてPBS充填皿と、画像内の卵巣の脂肪パッドシステム全体マウント配置アポ1xWD70、EDプラン1.5xWD45目標。 </li></ol></li><li>組織学<ol><li>以下ホールマウント画像取得（3.2.1）実験用フィルムの2×1cmの片に凍結組織標本のための媒体を埋め込み、鉗子を使用しての200から500μlのドロップを置き、ドロップに組織を移します。一方の縁でフィルムをピックアップし、1.8ミリリットルの低温バイアルに組織培地ドロップを転送します。バイアルを閉じて、液体窒素に突入。 -80℃で凍結組織を保管してください。 </li><li>代わりに、標準的なパラフィン包埋を進めます。ステップごとに組織容積の20から40のボリュームを使用してください。 <ol><li>室温で穏やかに振盪しながら、30分間に一度65％エタノールで組織を浸し。 </li><li>室温で穏やかに振盪しながら、30分間に一度、70％エタノールで組織を浸し。この段階で、サンプルを室温でヶ月間保存することができます。 </li><li>室温で穏やかに振盪しながら、30分間に一度90％エタノールで組織を浸し。 </li><li>室温で穏やかに振盪しながら、30分間に一度、95％エタノールで組織を浸し。 </li><li>室温で穏やかに振盪しながら、30分間無水エタノール（200プルーフ）で二回組織を浸し。 </li> &lt;李&gt;は室温で穏やかに振盪しながら、30分間、クロロホルムで二回組織を浸し。 </li><li> 58℃で穏やかに振盪しながら、30分間パラフィンに一度組織を浸し。 </li><li> 58℃で穏やかに振盪しながら、12時間、パラフィンに一度組織を浸し。 </li><li> 58℃で、3時間、パラフィンに一度組織を浸します。 </li><li>金属組織学金型内の組織を置き、58℃のパラフィンと金型を埋めます。パラフィンの上にプラスチック製の組織学カセットを追加し、4℃にパラフィンをクールダウン。 RTでパラフィン組織ブロックや店舗を抽出します。 注：パラフィン温度は、免疫組織化学染色に適した組織の最適な保存のために58℃を超えてはなりません。 </li></ol></li><li>また、検体処理ジェルとパラフィン包埋のために準備します。 <ol><li> PBSを吸引し、70％エタノールにホールマウント組織を移します。 2時間室温でインキュベートします。水浴中、60℃に予熱検体処理ゲル中。 </li><li> Pipett実験用フィルムライニングペトリ皿上に検体処理ゲルのE 200μL。細かい解剖鉗子を使用すると、検体処理ゲルドロップにホールマウント組織システムを転送します。 </li><li>検体処理ゲルプラグは室温で固化、または4℃で10分間のプラグを固化することができます。 </li><li>生検フォームパッドの間に挟まれた組織学組織カセット内の検体処理ゲル包埋組織を置きます。ステップ3.3.2-3.3.2.10のようにパラフィンに埋め込みます。 注意：試料の処理ゲル埋め込みが損失を防止し、小さな脆弱な組織サンプルの保存を可能にします。 注：凍結またはパラフィン包埋によって保存組織は、免疫組織化学染色14,15に適しています。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は、上皮細胞や組織の正確な配達および検出を可能にする卵巣の脂肪パッド移植アッセイを確立しています。卵巣の脂肪パッドアッセイ移植手順はintrabursal注入10-12未満技術的に困難であり、より均一で腹腔内注射9と比較して、移植された細胞の正確な位置を可能にします。それはまた、卵管などの臓器全体の長期移植に適しています。 重要なことは、卵巣の脂肪パッドは、女性の生殖器系の上皮のためのおなじみの微小環境を提供します。これは、再生および悪性形質転換の間に、ヒトおよびマウスの卵巣と卵管上皮細胞の分子および細胞特性の研究のために特に適していなければなりません。他の器官とは対照的に、いくつかの研究は、女性Rの上皮幹細胞の同定および特徴付けに焦点を当てていますeproductive管18,19。多くの癌は、成体幹細胞20に由来すると考えられるので、このような試験は特に重要です。しかし、上皮性卵巣癌の細胞の起源は、18非常に議論の余地が残ります。上皮性卵巣癌は、卵巣癌の大部分を占めると米国21の女性の全ての癌関連死の中で5位にあります。したがって、既存の移植技術に比べていくつかの利点を持つ同所アッセイの開発9-12が大幅にこの分野での研究を促進すべきです。 卵巣の脂肪パッドの表面的な場所を考えると、小動物イメージングシステムは、強い蛍光または生物発光レポーターで標識されたengraftmentsをフォローアップするために使用することができます。また、このような非線形顕微鏡22のような低侵襲性の高解像度ライブイメージングアッセイを確立することが可能であるべきです。卵巣の脂肪パッドも器官培養で維持することができ、それによって可能密接に細胞の組織と細胞外マトリックスを反復する条件の下で正常及び腫瘍性上皮の三次元培養をる。今後の研究では、これらの有望な可能性に対処すべきです。 いくつかの重要なステップを考慮しなければなりません。加熱パッドを提供し、手術中に暖かいげっ歯類を維持することが大幅に生存率を向上させます。脂肪パッドを扱う機器の無菌性は、移植されたシステムが無菌に保たれることが保証されます。我々の経験では、重大な出血は、移植の成長遅延をもたらします。重要なのは、脂肪パッドの切開が正確に脂肪パッドを引き裂くまたは出血の原因を介して穿刺するためなされるべきです。凝固剤は、必要に応じて出血を止めるために使用されるべきです。発達しないengraftments場合、注入された細胞のより高い濃度を考慮すべきです。最初に成功した派生物は、移植後1週間早けれとして観察され、最も目に見えるものでなければならないengraftmentsすることができます手続き後の月。移植のために、より大きな直径（23-25​​ G）を有する針は、大きなセル（直径10μm程度以上）の剪断を防止するために使用することができます。しかしながら、そのような針は、脂肪パッドに、より外傷性であってもよく、それらの使用は、事前に試験されるべきです。我々の実験のために我々は6〜8週齢のドナーとレシピエントマウスを使用しています。両方の目的のために、若いまたは古いマウスを使用することができます。しかし、注入した細胞の数を調整する必要があります。若年ドナーにおける卵巣の脂肪パッドの小型化も考慮される必要があります。 いずれの方法と同様に、マウスの卵巣の脂肪パッド移植アッセイのいくつかの制限があります。同系免疫適格マウスは、マウス初代細胞/組織のために使用することができますが、私たちの技術は、人間の体の移植のためのNSGまたはSCIDマウスが必要です。ヒト上皮細胞の増殖を支持するために脂肪パッドをヒト化することが可能と思われます。しかし、我々はまだこのアプローチをテストしていません。若いFEの使用男性は下繁殖コストをリードすることができ、しかし、成熟した処女雌マウス（年齢8〜10週間）は、それによって、より大きな標本の移植を可能にする、より大きな脂肪パッドを持っています。最後に、実験者は、手順のタイムリーで正常に実行されたことを確実にするために、動物の手術で訓練する必要があります。

マウスでの特定の身体部位への細胞および組織の導入を伴う移植アッセイは、組織再生および発癌の研究のために不可欠なアプローチを表します。細胞の同所性移植は、すなわち、天然の環境中へのそれらの配置は、成体幹細胞の特徴付けのために特に重要です。乳腺幹細胞の存在は、第1のマウスの腺無乳房脂肪パッドに上皮乳腺断片の移植によって示唆されました。ヒト化マウスの脂肪パッド2に移植アッセイは、ヒト初代乳房上皮細胞の再生能と正常な発達を再現するために使用しました。さらに、シリアルおよびクリア乳房脂肪パッドに、表現型の異なる細胞型の希釈移植を制限するには、自己再生能力および乳腺幹細胞3-5の多分化を試験することが重要でした。 combinatで移植アッセイ遺伝系統のトレースを持つイオンは乳腺発がん5に起源の細胞の証拠を提供しました。腎カプセル移植は、一般推定前立腺幹細胞6の特性を試験するために使用されます。正常及び腫瘍マウスおよびヒト膵臓オルガノイドの同所移植は、癌の進行7に変更された遺伝子および経路を明らかにしました。ネイティブ環境の重要性も後に、このような乳房脂肪パッド、肩脂肪パッド、および背中の皮膚8と異なる場所へ汗腺のengraftments多様な再生のデモンストレーションによってサポートされています。 腹腔および卵巣嚢は通常、女性の生殖管9-12の上皮細胞の同所移植のための場所として使用されています。これらの方法の両方は、多くの制限を有します。細胞の腹腔内注射は、腹腔の異なる領域にその注入をもたらし、それによってCOM細胞増殖を監視褶壁形成。また、微小環境の変化は、例えば、血管新生、神経支配および免疫細胞の表現の範囲として、腹腔内の異なる領域において非常に重要であり得ます。卵巣嚢は、液体のせいぜい10マイクロリットルの注入を可能にする、非常に限られた容積を有します。これは大幅に投与することができる細胞の量を制限します。また、卵嚢への注射は非常に技術的に挑戦することができ、手順はかなりの時間を必要とします。 これらの制限に対処するために、我々は、卵巣の脂肪パッドの特性を利用してきました。マウスの卵巣の脂肪パッドは、大きなサイズを有し、卵巣と卵管に隣接しており、手術で簡単にアクセスできます。ウマ栄養膜は、マウスの卵巣脂肪パッド13に移植できることが報告されています。しかし、この方法の詳細は記載されませんでした。また、この私の場合は報告されませんでしたTHODは成体細胞および組織に適用することができます。ここでは、女性の生殖器官のマウスおよびヒト細胞の移植のための信頼できる方法を説明し、この方法は、長期の臓器移植にも適用可能であることを示しています。

<table><tbody><tr><td>25 ゲージ針</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>28 ゲージ針 (針付き皮下注射器付き</td>)<td>Kendall</td><td>30339</td><td>部品番号: 8881500014</td></tr><tr><td>基本的な線維芽細胞成長因子-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9786</td><td></td></tr><tr><td>基底膜マトリックス (Geltrex)</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actin-DsRed マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>6051</td><td>B6。Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J</td></tr><tr><td>&beta;-actin-EGFPマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>3291</td><td>C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J</td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>ウシアルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR</td><td>EM-CX1058-1</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ</td><td>幹細胞テクノロジー</td><td>7912</td><td></td></tr><tr><td>極低温バイアル</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>dispase II</td><td>Worthington</td><td>NPRO2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12 (HAM's)</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (Deoxyribonuclease I)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>凍結組織標本用埋入培地 (O. C. T.)</td><td>サクラファインテック&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>エタノール200プルーフ</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td>を70%&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>filter tip 0.1-10/20 &micro;l XL&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>FOXJ1</td>抗体 <td>eBioscience</td><td>E10109-1632</td><td>濃度 1:1,000 (マスキングなし)</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Zoetis</td><td>4396H</td><td></td></tr><tr><td>ラボフィルム (パラフィルム M)</td><td>American National Can</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-亜ナトリウム 亜セレン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I884</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン、250 ml</td><td>サンタクルス アニマルヘルス</td><td>sc-363629Rx</td><td></td></tr><tr><td>低アタッチメントプレート 24-well</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>コーニング</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>金属組織学 モールド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>62527-22</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡、倒立</td><td>型ニコン</td><td>エクリプスTS 100</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡、ステレオ</td><td>ニコン</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nod/SCID/γ(NSG)マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>05557</td><td>NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16% 溶液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン (パラプラスト、X-TRA)</td><td>フィッシャー サーモ サイエンティフィック</td><td>23-021-401</td><td></td></tr><tr><td>PAX8 抗体</td><td>プロテインテック</td><td>10336-1-AP</td><td>濃度 1:1,000 で使用 (マスキング解除なし)</td></tr><tr><td>PBS (リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>コーニング</td><td>&nbsp;21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>コーニング</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>重症複合免疫不全症 (SCID/NCr) マウス、BALB/C 背景)</td><td>NCI-Frederick 動物生産プログラム</td><td>01S11</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>コーニング</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>検体処理ゲル (HISTOGEL)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA、25%</td><td>コーニング</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの卵巣脂肪パッドに移植

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

>jove_content<マウスの同所性移植アッセイは、細胞再生と腫瘍性形質転換の研究に非常に貴重です。卵巣表面および卵管上皮の同所性移植の一般的なアプローチには、細胞の腹腔内および滑液腔内投与が含まれます。これらの方法のそれぞれの制限には、注入された細胞の位置が十分に定義されていないこと、およびスペースボリュームが限られていることが含まれます。さらに、移植臓器の長期構造保存にはあまり適していません。これらの課題に対処するために、マウスの脂肪パッドに細胞と組織片を導入することに基づく代替アプローチを開発しました。マウス卵巣脂肪パッドは、卵巣と子宮管(別名卵管、卵管)のすぐ近くにあり、これらの臓器の細胞や組織に身近な微小環境を提供します。私たちのアプローチでは、蛍光標識されたマウスとヒトの細胞、および子宮管の断片を、最小限の外傷性背側切開手術を使用して生着させます。移植された細胞とその増殖物は、40日以上にわたって卵巣脂肪パッドに容易に位置付けられます。子宮チューブ全体の長期移植により、すべての主要な組織成分を正しく保存することができ、線維症や炎症などの有害な副作用を引き起こすことはありません。私たちのアプローチは、特定の細胞集団の分化、再生、腫瘍性の可能性などの重要な生物学的質問に答えるために独自に適用できるはずです。さらに、正常な発生やがんにおける微小環境因子の研究にも適しているはずです。

実験的細胞および組織を正確に解剖顕微鏡（ 図1）の下で卵巣脂肪パッドに移植することができます。例としては、遍在EGFP（ 図2A）またはDsRedの（ 図2B）とHIO118 16,17細胞はmCherryをし、EGFPレンチウイルスで標識したヒト不死化卵巣表面上皮細胞（ - F 図2C）を発現するマウス由来の初代マウス卵管上皮細胞が含まれます。アプローチはまた、マウスの卵管などの臓器の長期移植、（ 図3）に適用可能です。免疫組織化学染色によると、（FOXJ1正14）繊毛および分泌の両方（PAX8正15）細胞が移植された組織（ 図3DおよびE）の卵管上皮に保存されています。 <imgALT = &quot;図1&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54444 / 54444fig1.jpg&quot; /&gt; 図1：卵巣の脂肪パッド移植移植の（A）露出面積（矢印）。 （B）切開は28 G針（矢印）によって行われます。ピペットチップ（矢印）により、（C）UT /基底膜マトリックス混合物の生着。 （D）UT生着（矢印、明るい赤、βアクチンのDsRedマウスのUT）。 FP、脂肪パッド。 OV、卵巣; UT、卵管。スケールバー= 2ミリメートル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig2.jpg" /> 図2： 移植マウスプライマリ卵管上皮細胞の検出と人間が卵巣表面上皮細胞を不死化 （A、B）アウト。<html> 8日同系マウスに移植した後、一次βアクチン-EGFPマウス （緑A）のマウス卵管上皮細胞（矢印）およびβアクチンのDsRed（B、赤）の成長。 （C、D）は、10日目移植後NSGマウスにレンチEGFP（緑色）またはレンチmCherryを（赤）のいずれかで標識された混合HIO118細胞（矢印）のEngraftments。 （D）（C、矢印）から拡大エリア。 （E、F）グラフトは、SCIDマウス（矢印）にD、Cのように43日、同じ細胞の移植後に発症しました。 AD、F、蛍光。 E、明視野、FP、脂肪パッド。 OV、卵巣; UT、卵管。 （A、B、DF）スケールバー=500μmの。 （C）スケールバー= 1600ミクロン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 広告/ 54444 / 54444fig3.jpg &quot;/&gt; 図3： 卵管移植のキャラクタリゼーション。 （A）βアクチン-DsRedをマウス6日卵巣の脂肪パッドに移植した後の完全な卵管（矢印）（矢印を、明るい赤）。 （B）（A）に示される移植で脂肪パッドの蛍光凍結切片。レッド、のDsRed。ブルー、4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、核対比染色。 （C）40日NSGレシピエントマウス（矢印）への移植後の子宮管移植片（矢印）。パラフィン切片。正しいすべての原則卵管コンポーネントの保存、および移植関連線維症および炎症性の欠如に注意してください。ヘマトキシリン​​およびエオシン染色。 （D、E）検出卵管上皮マーカーペアボックス遺伝子8（PAX8）とフォークヘッドボックスJ1の（FOXJ1;茶色の核の色、矢頭）に示すグラフト（矢印）の細胞内で（ <strong&gt; C）。イムノシステム。メチルグリーンで対比染色。 FP、脂肪パッド。 OV、卵巣; UT、卵管。 （A）スケールバー=1000μmで。 （B）スケールバー=200μmの。 （CE）のスケールバー=100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 1×DMEM F12（ハム）培地 </td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td> 2 mMの</td></tr><tr><td>ナトリウムpruvate </td><td> 1 mMの</td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td> 10 ngのmlの-1 </td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞成長因子-2 </td><td> 10 ngのmlの-1 </td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td> 500 ngのmlの-1 </td></tr><tr><td>インスリン</td><td> 5μgのmlの-1 </td></tr><tr><td>トラnsferrin </td><td> 5μgのmlの-1 </td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td> 5 ngのmlの-1 </td></tr><tr><td>ウシアルブミン</td><td> 0.10％ </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> 100単位ミリリットル-1 /100μgのミリリットル-1 </td></tr><tr><td>最小必須培地イーグル（MEM）非必須アミノ酸</td><td> 0.1 mMの</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td> 10 -4 M </td></tr></tbody></table> 表1：マウスの卵管Epithelim増殖培地（M-TE-GM）コンポーネント左の列に表示されているが、1×DMEM F12を示した濃度の（ハム）培地、右欄に溶解されています。最終的な培地組成は、無血清です。

私たちは、女性の生殖器官の正常な形質転換上皮の研究に適した卵巣流行パッド移植アッセイを説明します。マウスの脂肪パッドは、大規模な組織片の移植を可能にする手術とイメージングのために簡単にアクセスでき、およびミュラー管由来の組織のための最も有利なネイティブ環境を提供します。

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

この卵巣脂肪組織移植アッセイの全体的な目的は、女性生殖器系の正常および形質転換した上皮を、最も好ましい天然の環境で研究できるようにすることです。この手法は、女性生殖器系の特定の細胞集団における分化能、再生能、および腫瘍形成能など、この分野における重要な疑問の解明に役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの卵巣脂肪組織によって、細胞および大きな組織断片の移植が可能であることです。ここは手術やイメージングにおいて容易にアクセス可能です。腹腔および卵巣嚢は、女性生殖器の上皮細胞の同所移植部位として頻繁に利用されています。しかし、これらの手法にはいくつかの制限があります。テキストのプロトコルに従ってbeta-actin EGFPまたはbeta-actin DS redマウスを安楽死させた後、個々のマウスを吸収性ドレープの上に腹側を上にして置きます。側方正中切開を行い皮膚を開き、切開部位の上下の皮膚を指先でマウスの頭側と尾側にそれぞれ引っ張ります。鈍端鑷子で腹膜を保持し、精細鋏を用いて体腔を開きます。次に、腸管のコイルをそっと脇に押しやり、生殖器官を確認します。精巧なピンセットで片側の子宮角をつかみ、子宮角が分かれる点から0.5 cm上の位置で切断します。その後、子宮角を保持したまま、子宮角、卵管、卵巣、および卵巣脂肪体に付着している結合組織を剥離します。摘出した生殖管を6 mLの滅菌PBSを入れたディッシュに置き、テキストプロトコルに従って一次卵管上皮（TE）細胞を培養する前に、2本目の生殖管の処理に進みます。テキストプロトコルに従い、解剖顕微鏡下で6〜8週齢の未交配beta-actin DS redマウスの子宮角から個々の卵管をPBS中で摘出した後、単一の卵管を200 µLのPBSドロップに移します。ピンセットと28G針を用いて、卵管のセグメントを支持している広靭帯の一部である卵管間膜を除去し、卵管をゆっくりとほどきます。受容側の卵巣脂肪体が露出し、移植の準備が整うまで、部分的に解いた単一の輸卵管を200 µLの氷冷PBS液滴の中に置いておきます。動物をバイオセーフティーキャビネットに移し、脂肪体移植を行います。本文のプロトコルに従って同系マウスを麻酔した後、40番のバリカンを使用して、手術部位の2倍の広さの範囲を除毛します。ポビドンヨードを使用し、続いて70% ethanolを用いて、外科的洗浄を3回行います。次に、動物を解剖顕微鏡の下に移動させます。その後、メスを用いて、卵巣脂肪体（ovarian fat pad）の直上の背内側に切開を加え、生殖管を露出させます。その後、患部を滅菌ドレープで覆います。次に、鈍端の精密ピンセットを用いて、神経や主要血管への損傷を最小限に抑えながら、卵巣脂肪 pads を切開口から正中線に向かって慎重に牽引します。移植後の成長遅延を防ぐため、脂肪 pads の切開は可能な限り正確に行う必要があります。脂肪 pads を完全に引き裂いたり穿孔したりすると出血の原因となるためです。必要に応じて、止血剤を使用して出血を止めてください。28ゲージの斜辺針を用い、卵巣の3～4 mm上の卵巣脂肪組織に、深さ2～4 mmの切開を加えます。この際、針が脂肪組織のほぼ半分までしか到達しないように注意してください。細胞移植を行う場合は、30ゲージ針を装着したシリンジに細胞と基底膜マトリックスの混合液を10～20 µL充填し、脂肪組織の切開部へと注入します。卵管の移植には、微小ピンセットを用いて卵管を採取し、氷上に保持した10～20 µLの基底膜マトリックスに入れる。次に、0.1～10～20 µLのXL graduatiedフィルターチップで組織と基底膜マトリックスの懸濁液を吸い上げ、脂肪組織の切開部位に注入する。基底膜マトリックスが凝固するまで5分間待ち、生殖管を腹腔内に戻す。外科用縫合糸で2針縫い、筋肉を閉鎖し、小型の皮膚ステープラーまたは外科用縫合糸を用いて皮膚を閉鎖します。移植後、テキストのプロトコルに従って動物を回復させます。移植片を回収し保存するために、2重蒸留水26 mLに10X PBS 4 mLと16% PFA溶液10 mLを混ぜ合わせ、4%パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を調製します。移植した卵巣脂肪体、卵巣、卵管、および子宮を一つのブロックとして摘出した後、直ちに組織を2 mLの4% PFAに入れ、室温で2時間固定します。同一個体から、移植されていない対側卵巣脂肪体のコントロール移植組織についても、同様に固定および処理を行います。固定後、組織をPBSで5分間×3回洗浄し、4 °CのPBS中で一晩インキュベートします。テキストプロトコルに従って、ホールマウントイメージングおよび組織学的検査を行います。この実験では、beta-actin DS redマウスの輸卵管を、この蛍光画像に示すように卵巣脂肪体へ移植し、生着させました。ここでは、同系マウスへの移植から8日後の、beta-actin EGFPマウスおよびbeta-actin DS redマウス由来の一次マウス輸卵管上皮細胞の増殖を示しています。この画像は、NSGマウスへの移植から10日後の、Lenti-eGFPまたはLenti-mCherryで標識された混合HI0118細胞の生着を示しています。これらのパネルにおいて、矢印はSCIDマウスへの混合HI0118細胞の移植から43日経過したグラフトを指しています。この蛍光画像は、卵巣脂肪体に移植してから6日後の、beta-actin DS redマウスからの完全な卵管を示しています。このパネルでは、蛍光脂肪組織の凍結切片をDAPIで対比染色しています。NSGレシピエントマウスへの移植後40日目のこの輸卵管移植片は、輸卵管構成要素が完全に保存されており、線維化や炎症が見られません。最後に、切片を輸卵管上皮マーカーであるPax8およびFOXJ1で染色し、メチルグリーンで対比染色することで、それぞれ繊毛細胞および分泌細胞が保存されていることを示しました。この手技に習熟すれば、適切に行うことで20～30分で完了させることができます。本手順を実施する際は、手術用プレート、試薬、および器具を事前に準備しておくことが重要です。本手順に続き、生体内イメージングや抗がん剤の投与などの他の手法を組み合わせることで、がんの形成や抗がん剤治療の効果といった追加の疑問を解消することが可能です。本手法は、生殖生物学および卵巣がん分野の研究者が、女性生殖管組織における正常な幹細胞機能やがんの発生を探索するための道を切り拓くものです。このビデオを視聴することで、細胞および輸卵管組織を単離し、それらを脂肪体へ移植する方法について十分な理解を得ることができます。生存手術において、無菌状態で動物を扱うことが、良好な結果を得るために極めて重要であることを忘れないでください。加熱パッドを提供して齧歯類を保温することで、生存率が大幅に向上します。

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