Name: 治療用途のためのツールとしてのRGD官能ヒドロゲルの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶRGD官能化ヒドロゲルの合成法。銅触媒付加反応とマイクロ波ポリ縮合を用いて、組織工学や再生医療における細胞治療や脊髄損傷治療への応用可能性を探索する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、言語の編集のために実りある議論のための教授マウリツィオ瑪斯とミスキアラAllegrettiに感謝したいと思います。本研究は、坂東GIOVANI Ricercatori 2010（Ministeroデッラサルー​​テGR-2010- 2312573）によってサポートされています。

注：受信のような化学物質が使用されています。線形RGDを購入し、それは標準的なFmoc固相ペプチド合成16,19によって調製することができます。溶媒は分析グレードのものです。透析はカットオフに等しい3500にダワット Mを有する膜を使用する必要があります。合成された化合物は、溶媒、化学シフトとしてクロロホルム（CDCl 3中）または重水（D 2 O）を使用して400 MHzの分光計で記録された1 H NMRスペクトルにより特徴づけられる百万分率でδ値として報告されます。さらに、ヒドロゲルは、KBrペレット技術を使用してFT-IR分析に供し、その物理的特徴付けは、37℃で反転試験管を用いて評価し、ゲル化の研究を含むています。 4-Azidobutanoyl塩化物1の1の合成<ol><li>ジクロロメタン10ml及びジメチルホルムアミド0.5ml中の4- azidobutanoic酸（3.90ミリモル）の500ミリグラムを溶解します。 </li><li> 0°Cで溶液を冷却氷浴を使用して。 </li><li>攪拌しながら、反応系に滴下して加えるゆっくりジクロロメタン5mlに塩化オキサリル（5.85ミリモル）の505μLを加え、。 </li><li>氷浴を用いて0℃で1時間後、室温に戻します。 </li><li>ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します。 </li><li> CDCl 3中16試料を溶解し、1 H-NMR分光法により得られた生成物を特徴付けます。 </li></ol> RGD-アジド誘導体2の2の合成<ol><li> 1MのNaOH 1mlにRGDを50mg（0.145ミリモル）を溶解させます。 </li><li>テトラヒドロフラン2ml中の1（0.16ミリモル）の24ミリグラムを溶解します。 </li><li>氷浴を用いて0℃で溶液1を滴下してRGDソリューションのすべてを追加します。 </li><li>室温に戻し、一晩攪拌。 </li><li> 1MのHClの1ミリリットルを追加します。 </li><li>ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します。 </li><li> OBTを特徴づけますained 1 H-NMR分光法による製品、D 2 O 16でサンプルを溶解させます。 </li></ol> 3. PAAアルキン変形例3 <ol><li>蒸留水15ml中のPAA溶液（2.8ミリモル）のw / wの35％の200 mgの溶解。 </li><li>プロパルギルアミン塩酸塩（0.20ミリモル）の15.4 mgの追加。 </li><li> 1（v / v）のアセトニトリル：50°Cに加熱することにより、蒸留水溶液1 14mlの中の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（HOBT、0.28ミリモル）の42.8 mgの溶解。 </li><li>室温でのPAA溶液にHOBtをソリューションのすべてを追加します。 </li><li>反応混合物にethyldimethylaminopropylcarbodiimideの53.6 mgの（EDC、0.28ミリモル）を追加します。 </li><li> pHを5.5に調整し、室温で一晩反応系を撹拌し、1MのHClを使用してください。 </li><li>ソリューションを透析。蒸留水2リットルに塩化ナトリウムの11.2グラムを溶解し、その後、塩酸ワット/ wの37％の0.2ミリリットルを追加します。 3.5キロダルトンのM wのカットオフを有する膜を用いて溶液を透析。 </li><li> Perfo3日間のrm透析。塩酸w / wの37％の0.2ミリリットルを含む新たに調製した蒸留水2Lで毎日透析液を変更します。 </li><li> -80℃での最終溶液を保管してください。製造業者のプロトコルに従って凍結乾燥機でそれを凍結乾燥。 </li><li> D 2 O 16のサンプルを溶解し、1 H-NMR分光法によって官能化ポリマーを特徴付けます。 </li></ol> PAA-RGDポリマー4の4の合成<ol><li> PAAの78 mgを蒸留水10mlにアルキン3（1.083ミリモル）を改変溶かします。 </li><li>テトラヒドロフラン5mlにRGDアジド誘導体2（0.0722ミリモル）25mgを溶解させます。 </li><li>高分子溶液にRGDソリューションのすべてを追加します。 </li><li>ヨウ化銅（0.0116ミリモル）およびアスコルビン酸ナトリウムの2.2ミリグラム（0.0111ミリモル）の2.2 mgの追加。 </li><li>攪拌しながら、60℃で一晩、得られた混合物を還流。 </li><li> 25℃に混合物を冷却。 </li><li> Dialyzソリューションを電子。蒸留水2リットルに塩化ナトリウムの11.2グラムを溶解し、その後、塩酸ワット/ wの37％の0.2ミリリットルを追加します。 3.5キロダルトンのM wのカットオフを有する膜を用いて溶液を透析。 </li><li> 3日間透析を行います。塩酸w / wの37％の0.2ミリリットルを含む新たに調製した蒸留水2Lで毎日透析液を変更します。 </li><li> -80℃での最終溶液を保管してください。製造業者のプロトコルに従って凍結乾燥機でそれを凍結乾燥。 </li><li> D 2 O 16のサンプルを溶解し、1 H-NMR分光法により得られた生成物を特徴付けます。 </li></ol> 5. RGD官能ヒドロゲルの合成<ol><li> PBSを準備します。蒸留水50mlにPBS塩645 mgの溶解。 </li><li>カルボマーの40 mgであり、官能基化PAA 4の10 mgを完全に溶解（30分）まで、室温で、PBSの9ミリリットル（ステップ5.1）でブレンド。 </li><li>溶液に、PEGの400ミリグラムを加え、45分間攪拌し続けます。 </li><li>攪拌を停止し、システムが30分間沈降することを可能にします。 </li><li> pHを7.4に調整するために1NのNaOHを使用してください。 </li><li>得られた混合物の5ミリリットルに、アガロース粉末25mgを追加します。 </li><li>通常は30秒と1分の間の時間のために、沸騰するまで、500 Wのマイクロ波放射を使用してシステムを照射し、電磁的に80℃まで加熱します。 </li><li>その温度が50℃になるまで室温にさらされ、混合物のままにして、1の溶液を得るためには、PBS（ステップ5.1）の5ミリリットルを追加：1の体積比を。 </li><li> 1.1センチメートルの直径を有する鋼製シリンダーを含む12マルチウェルプレートを準備します。 </li><li>溶液から500μlのアリコートを取り出し、各鋼シリンダに配置します。 </li><li>システムを完全にゲル化するまで45分間安静にしておきます。 </li><li>ヒドロゲルを得るために、ステンレス製のピンセットを用いてシリンダーを削除します。 </li></ol>治療ツール（薬物または細胞）の6.のロード<ol><li>目を繰り返しEPS 5.1から5.7まで。 </li><li> 1の体積比（既にゾル状態で）、混合物を37°Cに達すると、1で最終的なシステムを得るために、所望の薬物溶液または細胞培養物を含む溶液5mlを加えます。 </li><li>繰り返しは、物理的にゲル内に捕捉biocompoundsを有するポリマーネットワークを得るために5.9から5.12を繰り返します。 </li></ol> 7.ヒドロゲルキャラクタリゼーション<ol><li> FT-IR分析<ol><li>ゲル形成後、24時間蒸留水2.5 ml中に合成さヒドロゲルのいずれかを浸します。 </li><li>ヒドロゲルが沈んでいる水性媒体を取り出して、凍結乾燥した液体N 2で。 </li><li> KBrペレット法に従ってヒドロゲルサンプルをラミネート。 <ol><li>瑪瑙乳鉢にKBrを完全へらを追加します。ヒドロゲル少量のサンプルを取り、のKBr粉末と混合（臭化カリウム量、またはスパチュラの先端をカバーするのに十分なだけの約0.1から2パーセント）。 </li><li>粉末が微細かつ均一になるまで混合物を粉砕します。&lt;/李&gt; <li> IRペレットを形成するために、KBrペレットキットを使用してください。手動の実験用プレスを使用した粉末を押す：5トンに等しい圧力容量で3分間、その後3分間10トンの圧力容量で。 </li><li>外観のように均質かつ透明な最終ペレットを得るために圧力を解放します。 IRサンプルホルダーにペレットを挿入し、スペクトル16を実行します。 </li></ol></li></ol></li><li>ゲル化研究<ol><li> PBSの900μlの2ミリリットルのマイクロチューブを記入し、37℃に平衡化。 </li><li>ヒドロゲルを形成し、37℃でインキュベートし製造された高分子溶液100μlを加えます。 </li><li>管を反転し、ゲルを1、2、5、10及び20分で流れる場合に観察。ゲルは、ゲル化時間として流れていない時刻を記録します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in Regenerative Medicine.</a> Adv. Mater. 21 (32-33), 3307-3329 (2009).</li>
<li>Rossi, F., Perale, G., Papa, S., Forloni, G., Veglianese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+options+for+drug+delivery+to+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Current options for drug delivery to the spinal cord.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10 (3), 385-396 (2013).</li>
<li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell%2Fmatrix+interface+to+control+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li>
<li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+spinal+cord+by+transplantation+of+neural+stem+cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li>
<li>Khetan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation-mediated+cellular+traction+directs+stem+cell+fate+in+covalently+crosslinked+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels.</a> Nat. Mater. 12 (5), 458-465 (2013).</li>
<li>Ashley, G. W., Henise, J., Reid, R., Santi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+drug+delivery+system+with+predictable+and+tunable+drug+release+and+degradation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (6), 2318-2323 (2013).</li>
<li>Rossi, F., van Griensven, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Functionalization+as+a+Powerful+Tool+to+Improve+Scaffold+Performances%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Polymer Functionalization as a Powerful Tool to Improve Scaffold Performances.</a> Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2043-2051 (2014).</li>
<li>Gould, S. T., Darling, N. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+peptide+functionalized+thiol-ene+hydrogels+as+culture+substrates+for+understanding+valvular+interstitial+cell+activation+and+de+novo+tissue+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Small peptide functionalized thiol-ene hydrogels as culture substrates for understanding valvular interstitial cell activation and de novo tissue deposition.</a> Acta Biomater. 8 (9), 3201-3209 (2012).</li>
<li>Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Controlled+Photocleavage+for+the+Orthogonal+and+Sequential+Release+of+Multiple+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Controlled Photocleavage for the Orthogonal and Sequential Release of Multiple Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 52 (51), 13803-13807 (2013).</li>
<li>Larrañeta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-Assisted+Preparation+of+Hydrogel-Forming+Microneedle+Arrays+for+Transdermal+Drug+Delivery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Mater.+Eng%22%5BJournal%5D)">Microwave-Assisted Preparation of Hydrogel-Forming Microneedle Arrays for Transdermal Drug Delivery Applications.</a> Macromol. Mater. Eng. 300 (6), 586-595 (2015).</li>
<li>Cook, J. P., Goodall, G. W., Khutoryanskaya, O. V., Khutoryanskiy, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-Assisted+Hydrogel+Synthesis%3A+A+New+Method+for+Crosslinking+Polymers+in+Aqueous+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Microwave-Assisted Hydrogel Synthesis: A New Method for Crosslinking Polymers in Aqueous Solutions.</a> Macromol. Rapid Comm. 33 (4), 332-336 (2012).</li>
<li>Perale, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+drug+delivery+hydrogel+system+for+spinal+cord+injury+repair+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Multiple drug delivery hydrogel system for spinal cord injury repair strategies.</a> J. Control. Release. 159 (2), 271-280 (2012).</li>
<li>Rossi, F., Perale, G., Storti, G., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Library+of+Tunable+Agarose+Carbomer-Based+Hydrogels+for+Tissue+Engineering+Applications%3A+The+Role+of+Cross-Linkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">A Library of Tunable Agarose Carbomer-Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications: The Role of Cross-Linkers.</a> J. Appl. Polym. Sci. 123 (4), 2211-2221 (2012).</li>
<li>Frith, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+injectable+hydrogel+incorporating+mesenchymal+precursor+cells+and+pentosan+polysulphate+for+intervertebral+disc+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An injectable hydrogel incorporating mesenchymal precursor cells and pentosan polysulphate for intervertebral disc regeneration.</a> Biomaterials. 34 (37), 9430-9440 (2013).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 40 (11), (2001).</li>
<li>Sacchetti, A., Mauri, E., Sani, M., Masi, M., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-assisted+synthesis+and+click+chemistry+as+simple+and+efficient+strategy+for+RGD+functionalized+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">Microwave-assisted synthesis and click chemistry as simple and efficient strategy for RGD functionalized hydrogels.</a> Tetrahedron Lett. 55 (50), 6817-6820 (2014).</li>
<li>Ossipov, D. A., Hilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28vinyl+alcohol%29-based+hydrogels+formed+by+%26%2334%3Bclick+chemistry%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(vinyl alcohol)-based hydrogels formed by &#34;click chemistry&#34.</a> Macromolecules. 39 (5), 1709-1718 (2006).</li>
<li>Truong, V., Blakey, I., Whittaker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+and+Amphiphilic+Polyethylene+Glycol-Based+Hydrogels+with+Tunable+Degradability+Prepared+by+%26%2334%3BClick%26%2334%3B+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic and Amphiphilic Polyethylene Glycol-Based Hydrogels with Tunable Degradability Prepared by &#34;Click&#34; Chemistry.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 4012-4021 (2012).</li>
<li>Hou, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+synthetic+route+for+RGD+tripeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Prep.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">New synthetic route for RGD tripeptide.</a> Prep. Biochem. Biotechnol. 36 (3), 243-252 (2006).</li>
<li>Rossi, F., Chatzistavrou, X., Perale, G., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Degradation+of+Agar-Carbomer+Based+Hydrogels+for+Tissue+Engineering+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Degradation of Agar-Carbomer Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications.</a> J. Appl. Polym. Sci. 123 (1), 398-408 (2012).</li>
<li>Mauri, E., Rossi, F., Sacchetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+drug+delivery+using+chemoselective+functionalization+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Tunable drug delivery using chemoselective functionalization of hydrogels.</a> Mater. Sci. Eng. C. 61, 851-857 (2016).</li>
<li>Joaquin, A., Peppas, N. A., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+Polymer+Library+for+Developing+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiac+Patches%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Hydrogel Polymer Library for Developing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Patches.</a> Tissue Eng. Part A. 20, S55-S55 (2014).</li>
<li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+hydrogel-Nanoparticles+release+system+for+sustained+combination+therapies+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf.+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Tunable hydrogel-Nanoparticles release system for sustained combination therapies in the spinal cord.</a> Colloids Surf. B Biointerfaces. 108, 169-177 (2013).</li>
<li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 8 (24), 1128-1137 (2003).</li>
<li>Ossipov, D. A., Yang, X., Varghese, O., Kootala, S., Hilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+approach+to+functional+hyaluronic+acid+hydrogels+using+orthogonal+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Modular approach to functional hyaluronic acid hydrogels using orthogonal chemical reactions.</a> Chem. Commun. 46 (44), 8368-8370 (2010).</li>
<li>Anderson, S. B., Lin, C. C., Kuntzler, D. V., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+performance+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+cell-degradable+polymer-peptide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The performance of human mesenchymal stem cells encapsulated in cell-degradable polymer-peptide hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (14), 3564-3574 (2011).</li>
<li>Caron, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+three+dimensional+biomimetic+hydrogel+to+deliver+factors+secreted+by+human+mesenchymal+stem+cells+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new three dimensional biomimetic hydrogel to deliver factors secreted by human mesenchymal stem cells in spinal cord injury.</a> Biomaterials. 75, 135-147 (2016).</li>
<li>Lee, J. W., Kim, H., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+spacer+arm+length+between+adhesion+ligand+and+alginate+hydrogel+on+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Polym%22%5BJournal%5D)">Effect of spacer arm length between adhesion ligand and alginate hydrogel on stem cell differentiation.</a> Carbohyd. Polym. 139, 82-89 (2016).</li>
<li>Liu, Y., Fan, Z., Wang, Y., Yu, L. Controlled Release of Low Molecular Protein Insulin-like Growth Factor-1 through Self-Assembling Peptide Hydrogel with Biotin Sandwich Approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+Y+%22J.Biomed.+Eng%22">J.Biomed. Eng</a>. 32 (2), 387-392 (2015).</li>
</ol>

著者は利益相反を述べておらず、この原稿の準備のために支払いを受け取っていません。

アルキン部分によるPAA後重合修飾とアジド基によるRGD官能基化により、ポリマーとペプチド間の安定した結合の形成が保証されます。実際、トリアゾールは炭素原子間の剛性結合単位として機能し、1,2,3-トリアゾール環の1,4位に結合し、加水分解またはその他の方法で切断することはできません。さらに、トリアゾールは、ベンゼノイドや関連する芳香族複素環24などの他の環状構造とは異なり、酸化および還元することが極めて困難である。このように、PAA-RGD生成物の化学的不安定性は、ヒドロゲル合成の実験条件下ではほとんど存在しません。ペプチドは、その化学結合の性質により3Dポリマーネットワークにグラフト化され、物理的に閉じ込められません(したがって、システムから離れる可能性があります)。
アルキンPAAは、EDCおよびHOBtの存在下で水溶液中でプロパルギルアミンを用いて調製し、アミン誘導体を得る。実験結果は、PAAに結合する三重結合の割合が使用されるアミンの量に比例することを示しています。NMR分析を参照すると、試薬PAAとプロパルギルアミンのモル比が1:1の場合、ポリマー...

ヒドロゲルは天然または合成された親水性架橋ポリマーで形成された三次元ネットワークであり、独特の三次元構造によって特徴付けられます。これらのデバイスは、薬物送達、組織工学、遺伝子キャリアとスマート・センサ1,2の生物医学分野でますます魅力的です。実際、その高い水含有量、ならびにそれらのレオロジーおよび機械的性質は、それらの適切な候補が軟組織微小環境を模倣し、水溶性のサイトカインまたは増殖因子の送達のためにそれらの効果的なツールにするために行います。最も有望な使用の一つは、細胞および生物活性化合物を運ぶ注射用生体材料としてです。 インビトロおよびインビボ実験3,4で観察されたようなヒドロゲルは、保持して正確な生理学的関連性の様式で幹細胞の調節シグナルを送達することによって、細胞の生存および制御幹細胞の運命を改善することができます。このの主要な利点は、可能性であります体の上にすべてを移行し、目標の目標5を失って 、循環急流にエリアとextravasatesを離れる細胞の量を最小限に抑え、（ その場で ）接種のゾーン内注入した細胞を維持します。三次元ハイドロゲルネットワークの安定性は、ポリマー鎖の6間の共有結合または凝集力によって形成され、その架橋部位です。 このフレームワークでは、直交選択的化学は、ポリマー鎖に適用されるが、ヒドロゲル公演7を向上させることができる汎用性の高いツールです。実際、適切な化学基を有するポリマーの修飾は、細胞生存率および組織形成におけるそれらの使用を強化するために適切な化学的、物理的および機械的特性を提供するのに役立つ可能性があります。同様に、ゲルマトリックス内の細胞または成長因子をロードするための技術のうち、RGDペプチドの使用は、細胞接着及び生存の改善を可能にします。 RGDは構成されるトリペプチドでありますアルギニン、グリシン、およびはるかに複数の細胞接着受容体と細胞アンカー、行動および生存8,9にその生物学的影響に対処する能力のために最も効果的でしばしば用いられるトリペプチドであるアスパラギン酸の。この作業では、RGD官能ヒドロゲルの合成は、もてなしの細胞微小環境のために十分な生化学的特性によって特徴付けネットワークを設計することを目的として検討されています。 ヒドロゲルの合成におけるマイクロ波照射の使用は、副反応を最小限に抑え、従来の熱プロセス10に比べて短時間でより高い反応速度と収率を得るための簡単な手順を提供します。この方法は、ポリマーとの相互作用及び反応システム11中の有機溶媒の非存在に起因する精製工程及び収率滅菌ヒドロゲルを必要としません。したがって、それは、MODためのポリマーネットワークに結合されたRGDの高い割合を確保しますificationsは、ゲル形成に関与するポリマーの化学基に必要とされます。カルボキシル基は、PAAおよびカルボマー、ならびにヒドロキシル基、PEGから、アガロースから、重縮合反応によりヒドロゲルの三次元構造を生じます。言及されたポリマーは、脊髄損傷の修復処理12におけるヒドロゲルの合成のために使用されます。以前に報告されているようにこれらのデバイスは、高い生体適合性だけでなく、多くの生体組織のとチキソトロピー性のものと似ている機械的および物理化学的特性を示し、13,14を動作します。さらに、それらは、注射ゾーンで、 その場に局在したままです。 この研究では、PAAのカルボキシル基は、アルキン部分（ 図1）を用いて修飾され、及びRGD -アジド化合物は、構造を用いて調製化合物とトリペプチドの末端基-NH 2（CH 2）の反応性を利用するn個合成されます- N 3（&lt;強い&gt;図2）。その後、変更されたPAAはCuAACのクリック反応15-17（ 図3）を介してRGD-アジド誘導体と反応します。銅（I）触媒の使用は、反応速度及び位置選択性の両方の主要な改善につながります。 CuAAC反応は広く、有機合成およびポリマー科学において使用されます。これは、官能基を高効率、高耐性を兼ね備え、かつ、有機溶剤を使用することによって影響を受けません。高選択性、速い反応時間および簡単な精製手順は、所望の部分18を移植する星型ポリマー、ブロックコポリマーまたは鎖の取得を可能にします。このクリック戦略は、最終的な生化学的用途に応じて物理化学的性質をカスタマイズするために重合後のポリマーを修正することが可能となります。 CuAAC実験条件は簡単に（銅の酸化を最小限に発生する可能性があるのに対し、反応は、水の影響を受けない）、再現性、および自然のです形成されたトリアゾールは、製品の安定性を確保します。銅金属の使用は、細胞に対する潜在的な毒性効果および生物学的微小環境において、臨界点と考えることができるが、透析は、触媒残留物の完全な除去を可能にするための精製方法として使用されます。最後に、PAAは、RGD細胞または薬物担体としてのこれらのシステムの潜在的な機能を確認するために、検討されているヒドロゲルの合成（ 図4）、得られたネットワークの物理化学的特性で使用される修飾しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" /> 図1：PAAは、アルキンの合成を修正アルキン基とPAAの官能化のスキームを;。 「n」はプロパルギルアミンと反応するカルボキシル基を有するモノマーを示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>この図の拡大版。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" /> 図2：RGD- アジド合成 RGD-アジド誘導体の合成<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" /> 図3：RGD-アジド誘導体とアルキン-PAA間のクリック反応の反応スキームをクリックしてください 。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" /> 図4：ハイドロゲルSYNThesis。RGD官能ヒドロゲルの合成手順。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>ポリ(アクリル酸)溶液平均 Mw ~100,000, H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>523925</td><td>CAS 9003-01-4</td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール) 2,000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84797</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Carbomeer 974P</td><td>Fagron</td><td>1387083</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>インビトジェン株式会社</td><td>16500-500</td><td>UltraPure Agarose</td></tr><tr><td>RGD peptide</td><td></td><td>abcam ab142698</td><td></td></tr><tr><td>4-アジドブタン酸</td><td>Aurum Pharmatech</td><td>Z-2421</td><td>&nbsp;CAS 54447-68-6</td></tr><tr><td>塩化オキサリル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O8801</td><td>CAS 79-37-8</td></tr><tr><td>塩酸プロパルギラミン 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50919</td><td>CAS 15430-52-1</td></tr><tr><td>ヨウ化銅(I) Sigma</td><td>Aldrich</td><td>3140</td><td>CAS 7681-65-4</td></tr><tr><td>アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0000039</td><td>CAS 134-03-2</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>透析膜</td><td>スペクトラム研究所</td><td>132725</td><td>Spectra/Por 3透析膜&nbsp;標準RCチューブ MWCO:3.5 kD</td></tr></tbody></table>

治療用途のためのツールとしてのrgd官能ヒドロゲルの合成

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

生体材料としてのポリマーの使用は、治療用途において大きな利点を提供してきました。特に、生体適合性、機械的特性、または細胞生存率を向上させることができる化合物でポリマー鎖を修飾および官能基化する可能性により、生物医学分野における新たな課題に対応するための新しい材料の設計が可能になります。ポリマー官能基化戦略により、クリックケミストリーは、ポリマーデバイスの細胞適合性と薬物送達特性を改善するための強力なツールです。同様に、生物医学では、毒性や生物学的環境の汚染などの潜在的な悪影響を避けるために無菌ツールを使用するという基本的なニーズがあるため、マイクロ波支援戦略への関心が高まっています。
クリックケミストリーとマイクロ波支援法の組み合わせは、生物医学用途で望ましい機能と改善された性能を持つ生体適合性のハイドロゲルを生成するのに適しています。この研究は、RGD官能化ハイドロゲルの合成を目的としています。RGD(アルギニルグリシルアスパラギン酸)は、細胞接着タンパク質を模倣して細胞表面受容体に結合するトリペプチドであり、ハイドロゲルの3Dポリマーネットワーク内の細胞にとって快適な微小環境を作り出します。RGD官能基化は、Huisgen 1,3-双極子環化付加によって行われます。一部のPAAカルボキシル基はアルキン部分で修飾されていますが、RGDはペプチド配列の末端残基としてアジド酸で官能基化されています。最後に、両方の生成物を銅触媒クリック反応で使用して、ペプチドをPAAに永久的に結合します。この変性ポリマーは、カルボマー、アガロース、ポリエチレングリコール(PEG)とともに使用され、ヒドロゲルマトリックスを合成します。この3D構造は、PAA由来のカルボキシル基とアガロースおよびPEG由来のカルボマー基およびヒドロキシル基がマイクロ波支援重縮合によりエステル化反応を起こすことで形成されます。ゲル化メカニズムの効率性により、高度なRGD機能化が保証されます。さらに、この官能基化されたネットワーク内に治療用化合物または生物学的ツールをロードする手順は非常に簡単で再現性があります。

nは、カルボキシル基のアミンと反応するモノマーラベル図1に示したようにPAAのアルキン誘導体を効率的に、ポリアクリル酸、およびプロパルギルアミンから合成されます。生成物の同定は、1 H-NMR分光法によって確認される。 図5は、三重結合で変性されたPAAの1 H-NMRスペクトルを示す図 。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig5.jpg" /> 図5：PAA の 1 H-NMRスペクトルは、アルキン部分に関連する信号が強調表示されているアルキンを変更しま...

私たちは、細胞および薬物送達のためのデバイスとしてRGD官能化ハイドロゲルを合成するためのプロトコールを提示します。この手順には、アルキン修飾ポリアクリル酸(PAA)とRGD-アジド誘導体との間の銅触媒アルキン-アジド環化付加(CuAAC)が含まれます。ハイドロゲルは、マイクロ波支援重縮合を使用して形成され、それらの物理化学的特性が調査されます。

治療用途のためのツールとしてのRGD官能ヒドロゲルの合成

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

本手法の総合的な目的は、組織工学への応用のためのハイドロゲルを極めて容易に合成することです。この方法は、三次元細胞培養システムにおいて高い細胞生存率を維持できるかといった、組織工学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、迅速な反応を利用することで、細胞生存能を維持する能力を向上させるためにハイドロゲルシステムを容易に修飾できる点にあります。この手法の意義は、足場内に封入された細胞が損傷組織を再構築できるため、脊髄損傷の治療へと展開されます。本法は、再生医療としての細胞治療および、多くの手法におけるその有用性について重要な知見を提供することが可能です。また、骨、心臓、軟骨などの他のさまざまな組織系にも応用できます。RGD-アジド誘導体を合成するには、50 mgのRGDを1 Mの水酸化ナトリウム1 mLに溶解します。次に、24 mgの4-アジドブタノイルクロリドを2 mLのテトラヒドロフランに溶解します。0 °Cで、RGD溶液すべてを4-アジドブタノイルクロリド溶液に滴下して加えます。室温に戻し、一晩攪拌する。1 M の HCl を 1 mL 加える。エバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去する。得られた生成物を、サンプルを重水またはD2Oに溶解させてプロトン核磁気共鳴分光法により特性評価します。PAAのアルキン修飾を行うには、35 wt% PAA溶液200 mgを蒸留水15 mLに溶解させます。そこに、塩酸プロパルギルアミン15.4 mgを加えます。次に、42.8 mgのHOBtを、アセトニトリルと蒸留水の1:1混合液14 mLに溶解させます。この際、50 °Cまで加熱してください。このHOBt溶液をすべて、室温にあるPAA溶液に加えます。続いて、反応混合物に53.6 mgのEDCを加えます。1 MのHClを使用してpHを5.5に調整し、反応系を室温で一晩撹拌します。次に、2 Lの蒸留水に11.2 gの塩化ナトリウムを溶解させます。その後、37% (w/w) HClを200 µL添加します。分画分子量 3.5 kilodaltons のメンブレンを用いて、溶液を透析します。透析を3日間行います。透析液は毎日、200 microliters の 37%weight by weight HCL を含む、新しく調製した 2 liters の蒸留水に交換してください。最終溶液を-80°Cで保存します。サンプルのD2Oへの溶解後、プロトン核磁気共鳴分光法により機能化ポリマーの特性評価を行います。PAA-RGDポリマーを合成するには、78 mgのアルキン修飾PAAを10 mLの蒸留水に溶解します。次に、25 mgのRGD-アジド誘導体を5 mLのテトラヒドロフランに溶解させます。このRGD溶液のすべてをポリマー溶液に加えます。続いて、2.2 mgのヨウ化銅を加えます。さらに2.2 mgのアスコルビン酸ナトリウムを加えます。得られた混合物を60 °Cで一晩撹拌しながら還流させます。その後、混合物を25 °Cまで冷却します。溶液を透析するため、11.2 gの塩化ナトリウムを2 Lの蒸留水に溶解させ、37% (w/w) HClを200 µL加えます。透析を3日間行います。透析液は、37% (w/w) HClを200 µL含む、新しく調製した2 Lの蒸留水で毎日交換してください。その後、最終溶液を-80°Cで保存します。得られたPAA-RGDポリマーを、その構成成分と同様の方法で特性評価し、保存します。40 mgのカルボマーと10 mgの機能化PAAを、室温で9 mLのリン酸緩衝生理食塩水に加え、完全に溶解するまで混合します。溶液に400 milligramsのPEGを加え、45分間攪拌し続ける。攪拌を停止し、系を30分間静置させる。その後、1 molarの水酸化ナトリウムを用いてpHを7.4に調整する。得られた混合液5 mLに、アガロースパウダー25 mgを加えます。沸騰するまで、500 Wの電子レンジで30秒から1分間加熱します。その後、溶液を80 °Cまで加熱します。混合物を室温に放置し、温度が50 °Cまで下がるまで待ちます。次に、PBSを5 mL加え、体積比1:1の溶液にします。直径1.1 cmのスチール製シリンダーを含む12ウェルプレートを用意します。溶液から500 µLずつ分注し、各スチールシリンダーに入れる。系が完全にゲル化するまで、プレートを45分間静置する。ステンレス製ピンセットを用いてシリンダーを取り出し、ハイドロゲルを回収する。RGD機能化ハイドロゲルの物理化学的特性の評価については、テキストプロトコルを参照してください。マイクロ波照射後、Carbomer 974P、PAA-RGD、およびPEGが、アガロースと共に統計的なランダム重縮合反応を起こします。PEGとアガロースに含まれるヒドロキシ基が、Carbomer 947PおよびPAA-RGDに存在するカルボキシ基と反応し、ACPEG-RGDハイドロゲルが形成されます。レオロジー特性を検討したところ、貯蔵弾性率が損失弾性率よりも約1桁高いことが分かり、粘性よりも弾性的性質を持つ材料であることが示されました。さらに、低ひずみ領域では、ハイドロゲルの挙動が弾性率によって支配されていることが明確に見て取れます。走査型電子顕微鏡により、RGD機能化ハイドロゲル試料と非機能化ハイドロゲルの形態が示されています。どちらのハイドロゲルにおいても、相互に連結した細孔からなる高度に絡み合った構造を有しており、一部の大きな細孔の中に小さな細孔が含まれていることや、細孔壁に繊維状のネットワークが存在することが明らかになりました。これらの同様の特性は、RGDの存在がポリマーネットワークを変化させないことを示しています。この開発後、本手法は、組織工学の分野において、他のいくつかの疾患におけるこれらの細胞培養システムの安定性を探索する研究への道を開きました。このビデオを視聴することで、ハイドロゲルを機能化し、幹細胞の生存維持能力を向上させる方法について深く理解することができます。

the-synthesis-rgd-functionalized-hydrogels-as-tool-for-therapeutic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

bioprinter、犠牲型に基づいてパターン化されたハイドロゲルを作成するために使用された。ポロキサマー型は第二のヒドロゲルで埋め戻した後、溶出し、第三のハイドロゲルを充填した空隙を残していた。この方法では、生体高分子から複雑なアーキテクチャを生成する高速溶出及びポロキサマーの良い印刷適性を使用しています。...

模様の作成3D細胞培養のための2つの成分​​のために温度応答性ハイドロゲルリバース金型の印刷

このビデオは、連鎖重合ヒドロゲル合成を可能にする、ポリ（エチレングリコール）メタクリレートするための迅速、効率的な方法を説明します。それは同様に、機能化効率を評価、トラブルシューティングや高度な修正のための提案を提供し、典型的なハイドロゲルの特性評価技術を実証するために、ペプチド、詳細一般的な分析方法にメタクリルの機能を導入する方法を紹介します。...

マイクロ波支援ポリの機能化（エチレングリコール）と連鎖重合で使用するためには樹脂ペプチドおよびヒドロゲル形成

私たちは、三次元細胞培養アプリケーションのための合成ハイドロゲルマトリックスの光媒介形成とその後の生化学的パターニングの連続的なプロセスについて説明します。細胞適合性フォトクリックケミストリーによるハイドロゲルの構築と修飾が実証されています。さらに、これらのハイドロゲル内のパターンを定量化および観察し、細胞生存率を決定するための容易な技術が紹介されています。...

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

分解性感温ハイドロゲル ヒドラゾン架橋高分子オリゴマー バルク スケール、マイクロ スケール、およびナノスケール、ゲル粒子・...

自己組織化反応押出、マイクロフルイディクス, 経由で複数の長さスケールでの分解性感温ハイドロゲルを加工・ エレクトロスピニング

蛋白質ベースのヒドロゲルの三次元のアーキテクチャを操作するさまざまな方法は、材料特性に関してここで評価されます。マクロポーラス ネットワーク修飾が細胞接着ペプチドと細胞培養での実現性は、2...

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

この方法は、光重合を用いてクリック化学の手法を提供するポリエチレング リコール (PEG) ゲルの表面にタンパク質やペプチドのパターンを作成する生体外での細胞の研究のため生体信号を固定化、.

生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

現在の二層文化モデルは模倣する生体内微小機能の in vitro研究できないようにします。ポリエチレング リコール、酸化亜鉛テンプレート...

デュアルのバイオミメティック基底膜として極薄 Porated 弾性ゲルの細胞培養

このプロトコルは、注射可能な、上分子ポリマーナノ粒子(PNP)ヒドロゲルバイオマテリアルの合成および処方を記述する。これらの物質の薬物送達、バイオ医薬品安定化、細胞カプセル化および送達への応用が実証されている。...

細胞および薬物送達用途のための注射可能な高分子ポリマーナノ粒子ヒドロゲル

ここで提示されたプロトコルは、強力な接着性ヒドロゲルゼラチンo-ニトロソベンズアルデヒド(ゼラチン-NB)の合成を示しています。ゼラチンNBは、迅速かつ効率的な組織接着能力を有し、創傷表面を保護するための強力な物理的障壁を形成することができるため、傷害修復バイオテクノロジーの分野への応用が期待されています。...

強接着性ハイドロゲルゼラチンO-ニトロソベンズアルデヒドの合成

ここでは、外液相を必要とせずに、無細胞タンパク質合成反応をマクロスケールのヒドロゲルマトリックスに組み込むための2つのプロトコルを紹介します。...

マクロスケールハイドロゲルへの無細胞タンパク質合成反応の埋め込み法

学ぶRGD官能化ヒドロゲルの合成法。銅触媒付加反応とマイクロ波ポリ縮合を用いて、組織工学や再生医療における細胞治療や脊髄損傷治療への応用可能性を探索する。

治療用途のためのツールとしてのRGD官能ヒドロゲルの合成

さらに動画を探す