クローンのアッセイを用いて神経幹細胞の列挙

本手順の全体的な目的は、クローナル条件下でのニューロスフェア形成および分化を用いて、特定の集団における神経幹細胞の頻度を定量することです。この手法は、候補となる神経幹細胞マーカーの評価、神経幹細胞の精製、および神経幹細胞と神経前駆細胞の区別など、神経幹細胞分野において重要な有用性を有しています。本手法の利点は、所要期間が13日間であり、神経幹細胞の頻度を定量する既存の手法よりも短期間であること、およびクローナル条件下で実施されることです。

本手順を開始するため、1日目に、DMEM F12培地にB27、EGF、BFGF、およびペニシリン・ストレプトマイシンを加えてNSC増殖培地を調製します。次に、E14.5マウス神経球を、1 mLのNSC増殖培地および1 mLの0.05 N水酸化ナトリウム中で、室温で7分間解離させます。細胞を懸濁状態に保つため、適宜ピペッティングを行い、その後、1 mLの0.05 N塩酸を加えてアルカリを中和します。

その後、トリパンブルー染色と血球計数計を用いて細胞数を測定します。続いて、単一のE14.5マウスニューロスフェア細胞を、NSC増殖培地100 µLを用いて、96ウェルプレートに50 cells/mL以下の密度で播種します。細胞を37 °C、5% CO2で1週間インキュベートし、クローナルニューロスフェアを形成させます。

コンディショニング培地を調製するためのニューロスフィアの培養について、3日目にE14.5マウスニューロスフィアを分散させ、10 cmカルチャーディッシュ内の10 mLのNSC増殖培地に、単一細胞を20,000 cells/mLの密度で播種します。その後、細胞を37 °C、5% CO2で5日間インキュベートし、大量培養ニューロスフィアを生成します。8日目に、700 µLの0.01% poly-L-lysine、70 µLのlaminin（1 mg/mL添加）、および6,230 µLのPBSを混合してコーティング溶液を調製します。

次に、10 cmの培養皿に7 mLのpoly-L-lysine laminin溶液を加え、37 °Cで2時間コーティングします。10 mLセロロジカルピペットを用いて、大量培養したニューロスフィアをすべて15 mLコニカル遠心チューブに移します。ニューロスフィアを室温で171 ×gで1分間遠心分離し、上清を完全に除去します。

その後、DMEM F12培地にB27とFBSを混合して、NSC分化培地を調製します。ニューロスフェアに10 millilitersのNSC分化培地を加え、ピペッティングを数回行い、ニューロスフェアを再懸濁します。次に、10 centimeterカルチャーディッシュからポリ-L-リジンラミニンを吸引し、10 millilitersのPBSで1回洗浄します。

すべてのニューロスフィアをポリ-L-リシン・ラミニンコートされた10 centimeterの培養皿に移し、37 °C、5%CO2で一晩インキュベートし、ニューロスフィアを皿に接着させます。8日目に、顕微鏡下で各ウェルに形成されたニューロスフィアの数を数え、その後、50ウェルのチャンバー付きカバースリップの各ウェルに10 µLのポリ-L-リシン・ラミニンコーティング溶液を塗布し、37 °Cで2時間放置します。次に、30 mLのPBSをそれぞれ含む50 mLの円錐形遠心チューブを3本用意します。

滅菌済みピンセットを使用して、コーティング済みの50ウェルチャンバー付きカバーガラスを取り出します。コーティング溶液を洗い流すため、チャンバー付きカバーガラスを1本目、2本目、そして3本目のPBSチューブに順に浸します。その後、チャンバー付きカバーガラスのウェル内に残っている液体を吸引します。96ウェルプレートの各ウェルから、すべての培地とニューロスフェアを1枚の10 centimeter培養ディッシュに穏やかに移します。

ピペットの量を2 µLに設定し、一度に1つのニューロスフェアのみを回収するようにしてください。10 µLのピペットチップを装着したP10マイクロピペットを使用し、顕微鏡下でサンプルとなるニューロスフェアを回収します。ニューロスフェアの回収は、顕微鏡下、層流クリーンベンチ内、またはベンチトップ上で行うことができます。その後、回収したニューロスフェアを、コーティング済みの50ウェルチャンバーカバースリップのウェル中央に転移させます。

チャンバー付きカバーガラスの各ウェルにニューロスフィアが含まれるまで、この手順を繰り返します。その後、チャンバー付きカバーガラスの各ウェルに10 µLのNSC分化培地を添加します。チャンバー付きカバーガラスを10 cm培養皿に配置します。

10 cm ディッシュに、チェンバー付きカバーガラスを最大2枚まで配置できます。NSC分化培地が乾燥するのを防ぐため、ディッシュの縁に沿って PBS をピペットで加えます。チェンバー付きカバーガラスを 37 °C、5% CO2 で一晩インキュベートします。

9日目に、大量培養したニューロスフェアから条件付き培地を15 mLコニカル遠心チューブに移します。20 mL滅菌シリンジを用いて、条件付き培地を0.2 µmフィルターに通し、細胞やデブリを除去します。その後、ろ過した条件付き培地を10 cm培養ディッシュに戻します。

その後、滅菌済みピンセットを使用して、サンプルとなるニューロスフィアが下を向くように、チャンバー付きカバーガラスをコンディショニング培地の上に反転させて静かに配置します。チャンバー付きカバーガラスを37°C、5% CO2で3日間インキュベートします。12日目に、滅菌済みピンセットを用いて10 cm培養ディッシュからチャンバー付きカバーガラスを静かに取り出します。

カバースリップをPBSにそっと浸し、条件化培地を洗い流します。次に、カバースリップからシリコンガスケットを剥がします。この操作は、カバースリップを破損させないよう、慎重にゆっくりと行ってください。分化したニューロスフィアが付着している面を確認してください。

その後、カバーガラスのサイズに切ったパラフィンフィルム上に、4%パラホルムアルデヒドを1 mmピペットで滴下します。カバーガラスを、ニューロスフィアがパラホルムアルデヒドに接するように下向きにしてパラフィンフィルム上にそっと置き、室温で20分間ニューロスフィアを固定します。ここでは、単一のニューロスフィアをピックアップし、50ウェルチャンバー付きカバーガラス内で3日間分化させました。

これは、DAPIで染色し、GFAP、TUJ1、およびO4で免疫染色した三能性ニューロスフィアの代表的な画像です。この画像は、DAPI、GFAP、TUJ1、およびO4の重ね合わせを示しています。このプロトコルは、既知のNSCマーカーであるLeXが、NSCを濃縮できる能力があるかを評価するために使用されます。このグラフは、LeX陽性細胞およびLeX陰性細胞から生成された単能性、二能性、および三能性ニューロスフィアの割合を示しています。そして、LeX陽性細胞はLeX陰性細胞よりも有意に多くの三能性ニューロスフィアを生成します。

この表は、LeX陽性細胞およびLeX陰性細胞のNSC頻度が、NFUと三能性ニューロスフィアの割合の積として算出されたことを示しています。このビデオを視聴することで、ニューロスフィアをクローン条件下で培養および分化させ、神経幹細胞の頻度を定量する方法について十分に理解できるはずです。この手法を実施する際は、ニューロスフィアに最適な増殖および分化条件を確保するために、調製直後の増殖培地、分化培地、およびコーティング溶液を使用することが重要です。

この手法に習熟すれば、神経幹細胞の頻度を算出する現行の手法よりも短期間の13日間で実施することが可能です。本手法を、神経コロニー形成細胞アッセイなどの現行の手法と併用することで、より新しい幹細胞の濃縮や、確定的な神経幹細胞マーカーの同定に利用できると考えられます。