からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装エシェリヒア・コリ：デザイン、生産および精製

この手順の全体的な目標は、in vitro触媒試薬として使用するための酵素充填細菌外膜小胞を精製し、特性評価することです。この酵素単離技術により、細菌のOMVを培地から回収し、有機リン化合物の無細胞触媒作用に使用することができます。細菌のOMV内での指向性パッケージングは、酵素活性の段階的かつ継続的な損失をもたらすことが多い従来の技術とは異なり、さまざまな反応および保存条件で酵素の安定性を大幅に向上させます。

この技術の意味するところは、治療薬の開発、修復、無細胞触媒システムの開発など、複数の分野で関連性のあるタンパク質のパッケージングにまで及びます。このプロトコールでは、大腸菌からのOMVの精製について詳しく説明していますが、パッケージング戦略を修正した技術は、さまざまな微生物細胞培養からのOMV精製に容易に使用できます。テキストプロトコルに従って細菌の外膜小胞またはOMVを生成した後、無傷の細菌培養培地を7, 000倍Gおよび摂氏4度で15分間遠心分離します。

上清を取り出して保存し、細胞ペレットを乱さないように注意してください。次に、上清を2回目のスピンにかけ、すべての細菌が培地から除去されていることを確認します。保存した培地からタンパク質凝集体と大きな細胞材料を除去するには、溶液を滅菌済みの10〜50ミリリットルのシリンジに引き込みます。

0.45ミクロンのフィルターを取り付けて、シリンジの端をおびき寄せます。次に、プランジャーを押し下げ、フロースルーを新しいチューブに集めます。あるいは、培地を滅菌ろ過装置に移すことにより、培地を真空ろ過します。

ユニットを真空ポンプまたはシンクアスピレーターに取り付けて、吸引を生成します。ろ過した媒体を新しい容器に移します。OMVを単離するには、ろ過した培地を超遠心チューブに移します。

媒体を約150,000倍Gおよび摂氏4度で、利用されるチューブに対応するローターを使用して3時間回転させます。超遠心分離の直後に、ペレットの質量の損失を避けるために、OMVが枯渇した培地をわずかに茶色のOMVペレットからデカントします。超遠心分離後に形成されたOMVペレットは、遠心分離小胞に緩く接着するのみ可能です。

デカンテーションするときは、ペレットが外れて失われないように注意する必要があります。上清は、後の動的光散乱のために保存して、OMV 粒子が媒質から完全に枯渇したことを確認します。0.5〜1ミリリットルの滅菌ろ過済みPBS、PH 7.4、または実験の必要性や条件によって決定される他のろ過済み緩衝液をペレットに加え、室温で30分間インキュベートします。

次に、精製したOMV溶液を慎重にピペットで滴下し、ペレット全体が可溶化したことを確認するために穏やかに混合します。OMVサイズ分布を決定するには、使用している機器のDLSナノ粒子追跡ソフトウェアを開きます。顕微鏡の電源を入れ、顕微鏡とナノ粒子追跡ユニットのすべての表面を清掃します。

1ミリリットルの滅菌シリンジを使用して、約0.5ミリリットルのOMVサンプルを下部フィッティングを通じて粒子追跡装置の視認窓に直接追加し、システムに気泡を注入することなく視認窓全体を覆うように注意します。ナノ粒子追跡ユニットを顕微鏡ステージに置き、レーザーをオンにします。次に、ソフトウェアの[キャプチャ]をクリックします。

顕微鏡の焦点とステージを調整して、ソフトウェアウィンドウに表示されるプレビュー画面で粒子を視覚化します。暗い背景に明るい粒子がはっきりと見えるようになるまで、カメラのシャッターとカメラのゲインを調整します。キャプチャ時間を 60 秒に調整し、[録画] をクリックします。

プロンプトが表示されたら、サンプルデバイスの温度を入力し、サンプルにラベルを付け、各実行の完了時にビデオデータをユーザー指定のフォルダーに保存します。すべての解析パラメータを自動検出モードに保ち、[プロセスシーケンス]をクリックします。ソフトウェアによって決定された粒子径分布と濃度をミリリットルあたりの粒子として記録します。

OMVタンパク質含有量を測定するには、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットを使用してOMV純度酵素産生とSpyCatcherまたはSCからSpyTagまたはSTへの架橋効率を評価します。標的酵素とアンカータンパク質の発現を確認することが不可欠です。組換えタンパク質の発現は、さまざまな理由で失敗することが多く、OMVの特性評価の前にタンパク質産生の成功を確認する必要があります。

ホスホトリエステラーゼまたはPTE活性アッセイを実施するには、CHESの90マイクロリットルの精製OMVの5マイクロリットルに、CHESバッファー中のパラオキソンの1〜1,000希釈の5マイクロリットルを追加します。20秒ごとに405ナノメートルと348ナノメートルで吸光度を約2時間、総反応時間で測定し、発色性パラオキソン分解生成物p-ニトロフェノールの進行を監視します。最後に、テキストプロトコルに従ってデータ分析を実行します。

ここに示されているのは、SEMを介して大腸菌から精製されたOMVの形態の例です。OMVのサイズは、粒子追跡装置を使用して決定された50〜250ナノメートルの範囲です。このグラフでは、絶対OMV濃度が示されています。

N末端のOMP-A-STをアラビノースおよびIPTGの存在下でPTE-SCと共形質転換すると、対照サンプルと比較してOMV産生の有意な増加が観察されました。ここで見られるSDS-PAGEおよびウェスタンブロットは、OMP-A-ST、ネイティブOMP-A、PTE-SC、およびOMP-A-ST-PTE-SCのOMVタンパク質含有量と組換えタンパク質発現をさらに特徴付けています。この図では、パラオキソンを発色基質として用いた初速度測定により、細胞ペレット、UC上清、精製UC OMVペレットにおける全体的なPTE発現レベルとOMVパッケージング効率を決定しました。

ここでは、Triton X-100を使用して、無傷のOMV二重層を介したパラオキソンの転座を確認しました。洗剤の有無にかかわらず活性差はほとんどなく、パラオキソンがOMVの内因性細孔を自由に通過することを示しています。最後に、この実験で見られるように、PTE-SCの速度論的データは、アラビノースの存在下でPTE-SCと共変換されたN末端OMP-A-STの標準的なMichaelis-Menten酵素速度論方程式に適合し、アラビノース活性化の存在下ではIPTGおよびPTE-SC

すべての遺伝子コンストラクトが作成され、確認されたら、酵素パッケージングとOMV精製を2日間で完了できます。新しいコンストラクトが開発されるたびに、OMVを確認し、特性評価するために3日目が必要です。この手順を試行する際には、すべての材料と遠心分離装置の安全性評価を確認することを忘れないでください。

さらに、次のステップに進む前に、各ステップの成功を確認することが重要です。ここで説明する特性評価ステップは、酵素パッケージングとOMV形態を確認するために、他のステップで補完することができます。タンパク質濃度、脂質含有量、LPS濃度、およびその他の多くの特性は、ペイロードや付加条件によって異なる可能性があり、下流のアプリケーションに影響を与える可能性があります。

このビデオを見れば、酵素充填OMVの精製方法と特性評価方法、および酵素カーゴの活性を評価するための予備アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。バクテリアや化学試薬の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、適切な無菌技術や個人用保護具などの予防措置を常に使用する必要があることを忘れないでください。