準備とシリアルフェムト秒結晶学のための脂質立方相におけるタンパク質微結晶の配達

この手順の全体的な目的は、シンクロトロンおよびX線自由電子レーザー光源におけるシリアル結晶構造解析データ収集のために、リピディックキュービックフェーズ（LCP）中での膜タンパク質結晶試料を調製することです。この手法は、膜を介した輸送やシグナル伝達など、膜タンパク質の構造生物学分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、最小限の試料消費量かつ無視できるほどの放射線損傷で、室温での天然の脂質環境における膜タンパク質の構造決定を可能にする点にあります。

リピディックキュービック相は粘性の高いゲル状物質であり、専用の器具や事前の経験なしに扱うことは困難であるため、この方法に不慣れな方は苦労する可能性があります。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、シリンジ1およびシリンジ2を用いて、リピディックキュービック相（LCP）への膜タンパク質の再構成からこの手順を開始してください。透明で均質なLCPが形成された後、サンプル全体をシリンジ2に移します。

カプラーをシリンジ2に接続したまま、シリンジ1を取り外します。取り外し可能な針を、シリンジ3と呼ばれる別の清潔な100 µLシリンジに接続します。そこに沈殿剤溶液を約70 µL吸引します。

テフロン球をシリンジ内に保持したまま、シリンジ3から針を取り外します。カプラーを介してシリンジ2とシリンジ3を接続し、両方のシリンジ内でテフロン球が正しく配置されていることを確認します。カプラーを慎重にしっかりと締め付けます。

連結されたシリンジを垂直に立て、シリンジ2を下に配置します。シリンジ2からシリンジ3へ、タンパク質を含むLCPサンプルを、LCPストリングがシリンジ3のプランジャーに触れるまで、ゆっくりと一定の速度で注入します。注入されるLCPの量は、シリンジ3にある初期沈殿剤量の約1/10になります。両方のシリンジの目盛りを読み取り、注入量を確認してください。

次に、シリンジ2を切り離します。この時点で、カプラーは沈殿剤溶液に浸されたサンプルが入ったシリンジ3のみに接続されています。パラフィルムを使用して、プランジャーとシリンジの接合部、カプラーの開口端、およびニードルナットを含むシリンジ3を完全に密封します。

このステップでの封印が不完全な場合、沈殿条件が変化し、サンプルが脱水する可能性があります。タンパク質含有LCPサンプルの注入ステップを繰り返し、さらに6本のシリンジで結晶化のセットアップを行います。この際、LCPサンプルを合計で約50 microliters使用します。サンプルの脱水を防ぐため、水に浸した糸くずの出ないクリーニングティッシュを1〜2枚と共に、封印したシリンジをプラスチック製の密閉袋に入れて保存してください。

バッグを密閉し、結晶成長の間、シリンジを20 °Cのインキュベーターで保存します。結晶検出のためには、12〜24時間ごとにシリンジをインキュベーターから取り出し、直交ニコル下の実体顕微鏡を用いて、シリンジ内のLCPサンプルを直接観察します。結晶は、密集した光沢のある粒子として、または結晶サイズが小さい場合は、LCPフィラメントからの均一な輝きとして識別します。

密封したシリンジをバッグに戻し、今後の使用に備えて20 °Cで保存します。脂質滴定の手順は、過剰な沈殿剤溶液を吸収し、X線自由電子レーザービームへの注入時に脂質が凍結するのを防ぐために必要です。データ収集を開始する約1時間前に、サンプルが入ったシリンジを20 °Cのインキュベーターから取り出します。

結晶の外観や結晶化条件が類似していることに基づいて、試料の統合に使用するシリンジを2〜4本選択します。選択したシリンジからParafilmのシールを慎重に剥がします。シリンジカプラーを取り外し、1本目の選択したシリンジに清潔な取り外し可能な針を取り付けます。

プランジャーをゆっくりと慎重に押し込み、沈殿剤を針からマイクロ遠心チューブ内へ押し出します。このステップでは注意してください。プランジャーに強い圧力をかけると、沈殿剤溶液とともに結晶を含むLCPの一部が排出され、サンプルの部分的なまたは完全な喪失につながる可能性があります。沈殿剤の大部分が除去され、針の入り口にLCPが蓄積したところで、プランジャーを止めてください。

他の選択したシリンジについても、この操作を行います。得られたLCPサンプルをまとめるには、きれいなカプラーを介して2本のシリンジを接続します。一方のシリンジのプランジャーを押し、サンプル全体をもう一方のシリンジに転送します。

空になったシリンジを取り外します。この操作を繰り返し、結晶を含むすべてのLCP材料を1本のシリンジにまとめます。沈殿剤を可能な限り除去してください。

約 5 µL の 7.9 MAG または元の短鎖 MAG ホスト脂質を空のシリンジに加えます。このシリンジをシリンジカプラーで統合サンプルが入ったシリンジに接続し、シリンジプランジャーを交互に押して混合します。残りの溶液がすべて吸収され、均一で透明な LCP が形成されるまで、この操作を繰り返します。

混合したLCPサンプル全体を1つのシリンジに移し、空になったシリンジを取り外します。統合したサンプルが入ったシリンジに、LCPインジェクター用ローディングニードルを取り付けます。LCPサンプルを約1 µL、ガラススライド上に慎重に滴下し、ガラスカバーガラスで覆います。

カバーガラスをそっと押し、サンプルを挟み込みます。明視野照明と直交ニコルを用い、ステレオ顕微鏡の下で可能な限りの高倍率でLCPサンプルの画像を撮影します。可能であれば、UV蛍光顕微鏡およびイメージャーを用いて追加の画像を撮影し、サンプル中にタンパク質微結晶が存在することを確認してください。

結晶のサイズと密度を推定します。データ収集実験における理想的な結晶密度は、結晶サイズ、X線ビームの直径、およびLCPストリームの直径に依存し、結晶のヒット率が約10%から40%になるように調整する必要があります。最後に、LCPインジェクターに充填し、テキストプロトコルに記載されている通りにLCPシリアルフェムト秒結晶学（LCP SFX）データ収集を行います。ここでは、エルゴタミンと複合体を形成したセロトニン受容体のマイクロ結晶を、明視野顕微鏡モードおよび直交ニコル顕微鏡モードで撮影した画像を示しています。

セロトニン受容体エルゴタミン複合体の構造は、LCP SFX法によって得られました。ここでは、直交ニコチン受容体とシクロパミンとの複合体微結晶を、直交偏光顕微鏡モードで撮影した画像を示しています。受容体シクロパミン複合体の構造は、LCP SFX法によって得られました。

この手順を習得し、適切に実施すれば、2時間以内に完了させることができます。この手法は膜タンパク質標的の構造に関する知見を提供しますが、わずかな改変を加えることで、他のタンパク質にも適用可能です。本技術の意義は創薬にまで及びます。高解像度の構造は、標準的なリグナンとタンパク質の相互作用における優れたテンプレートとなり、より効率的な薬剤の設計に役立つためです。