Name: 高スループット、石灰化組織のマルチイメージCryohistology (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶ高スループットCryohistologyプラットフォームを用いた石灰化組織のマルチイメージング法。同一スライドでの複数回の蛍光イメージングと染色により、複数の分子シグナルを特定細胞に関連付け、観察者非依存で効率的な組織学的解析を実現します。

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著者は、NIH R01-AR063702、R21-AR064941、K99-AR067283、T90-DE021989の資金源に感謝したいと思います。

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
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<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここでは、共局在し、単一のセクションに染色/イメージングの複数回の画像を位置合わせすることによっていくつかの生物学的措置を定量化するための詳細なcryohistologyプロトコルを提示しています。それはセクションの組織（ 例えば 、石灰化した骨および軟骨）に難しいの形態を維持するようcryotapeを使用して概説した方法は、特に便利です。また、切片組織は、同じセクションの染色/イメージングの複数のラウンドを可能にする、スライドガラスにしっかりと接着されています。シリアルセクションでは、各異なるプロトコルを用いて染色されている伝統的な方法とは異なり。セクション間の共局在信号しようとしたときに、連続切片を使用すると、複数のラウンドで染色し、画像化された単一のセクションの問題ではありません何かを問題を提起することができます。 市場に最初のテープで安定化した組織切片の製品は、テープ搬送システム16、17であった。それは、コーティングされたプラスチックテープを使用しています組織cryoblockの表面上に配置された低温接着剤です。テープの下クライオス...

生物学的研究は、多くの場合、頻繁に組織学的分析1-3のいくつかの並べ替えに関連付けられている効率的な表現型を、必要とします。この必要性は、マウスゲノム4における各遺伝子を破壊し、さらに明らかに野心的なプロジェクトです。これらの組織学的分析は、個々の細胞に特異的な遺伝子またはタンパク質のマッピング式に細胞形態および/または解剖学的特徴を評価するの範囲であり得ます。実際には、ゲノミクスのフィールドに組織学の基本的な貢献の一つは、特定の領域または細胞型に特異的な分子シグナルを関連付ける機能です。 特に筋骨格組織のための組織学の伝統的な方法、脱灰、修正するために数週間、時には必要、多くの場合、時間がかかり、面倒であり、セクション、汚れ、および画像標本は、その後、人間の解釈を経由して画像を解析。 その場 hybridizat に 、かどうかを免疫組織化学を介して、複数の分子シグナルの分析イオン、または特別な汚れは、適切に実行するために複数のセクション、さらには、複数の検体を必要とします。また、これらの複数の応答は、同じ細胞に同時局在することはできません、時には与えられた試料内の特定の領域に同時局在することはできません。ゲノミクス及びエピゲノミクス分野はデジタル時代に移動すると、組織学的フィールドはまた、効率的、高スループット、および単一の組織切片内の分子の各種信号の自動分析を提供するために、スーツに従わなければなりません。 確かに、与えられた試料内の特定のセルに複数の分子シグナルを関連付けることができる改良組織学的技術が求められています。最近、我々は鉱化組織5-14から与えられたセクション内のいくつかの対応策を評価するための新しい高スループットcryohistological方法を公開しています。プロセスは、顕微鏡スライドに固定的にテープで留め部分を接着し、冷凍cryotapeとの凍結切片を安定化させることを含む、および各セクションの染色およびイメージングのいくつかのラウンドを行います。画像のこのラウンドは、手動または画像解析の前に、コンピュータの自動化（ 図1）を介して位置合わせされます。ここでは、このプロセスの詳細なプロトコルを提示し、これらの技術は、異なる生物学的プロセスの理解を改善している例を提供します。

<table><tbody><tr><td>10%中性緩衝ホルマリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>HT501128-4L</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。毒性。4%パラホルムアルデヒドで置換できます。</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>、シグマ、アルドリッチ</td><td>、S9378</td>、<td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P5368</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>クライオモールド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>フィッシャーブランド #22-363-554</td><td>組織によって異なるサイズを使用可能</td></tr><tr><td>クライオマトリックス</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>6769006</td><td>他のクライオマトリックスと交換することができます。しかし、PVA/PEGベースの樹脂は、私たちの手の中で最も効果的でした。</td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M32631</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>3050s</td><td>他のブランド/モデルと交換できます。</td></tr><tr><td>試料ディスク</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14037008587</td><td>他のブランド/モデルと交換できます。</td></tr><tr><td>クライオスタットブレード</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>他のブランド/モデルと交換できます。</td></tr><tr><td>クライオテープ</td><td>セクションラボ</td><td>クライオフィルム 2C</td><td></td></tr><tr><td>ローラー</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>62800-46</td><td>他のブランド/モデルで代用できます。</td></tr><tr><td>プラスチック顕微鏡スライド</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71890-01</td><td>他のブランド/モデルと交換できます。</td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>他のブランド/モデルと交換できます。</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td>Norland Optical</td><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td></td></tr><tr><td>UV Black Light</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>InSpeck red microscopheres</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>InSpeck green microspheres</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>カルセイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C0875&nbsp;</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>アリザリンコンプレックス</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A3882&nbsp;</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>デメクロサイクリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp;</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>ELF 97 黄色蛍光酸ホスファターゼ基質</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>62247</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。Hoechst 33342または他の核染料で代用できます。</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (Cy5核対比染色)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R37108</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>無水酢酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>酒石酸ナトリウム二塩基性二水和物&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T6521</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>15504</td>複数の<td>サプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>MgCl2六水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M9272</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>ファストレッド TR ソルト</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F8764</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。また、Vector Blue(Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naphthol AS-MX&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>N4875</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>N、Nジメチルホルムアミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D158550</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>トルイジンブルー O</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T3260</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>他のリニアスキャナーやタイルスキャナーも使用できます。</td></tr><tr><td>DAPIフィルターセット</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>CFPフィルターセット</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>GFPフィルターセット</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>YFPフィルターセット</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>カスタムイエロー(ELF97)フィルターセット</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td>習慣;HQ409sp、HQ555/30m、425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>TRITCフィルターセット</td><td>クロマテクノロジー(株)</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5フィルターセット</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJaneテープ転送システム</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>62800-10</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>CryoJaneテープWindows</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>62800-72</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>CryoJane接着剤スライド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>62800-4X</td><td>複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr></tbody></table>

高スループット、石灰化組織のマルチイメージcryohistology

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

さまざまな組織の効率的な表現型と組織病理学に対するニーズが高まっています。この表現型のニーズは、マウスゲノムのすべての遺伝子を破壊するという野心的なプロジェクトで明らかです。研究コミュニティは、組織学を通じて組織を表現型決定するための迅速で安価な手段を必要としています。骨格組織の組織学的解析は、多くの場合、時間がかかり、せいぜい半定量的であり、訓練を受けた個人のスライドの主観的な解釈が定期的に必要になります。ここでは、石灰化組織の効率的かつ安価な表現型のための凍結組織学的パラダイムを提示します。まず、石灰化組織の形態を維持するテープ安定化凍結切片の新しい方法を紹介します。次に、これらの切片をスライドガラスに固く接着し、数回の染色で繰り返し画像化します。得られた画像は、手動またはコンピューターソフトウェアを介して位置合わせされ、複数のレイヤー化された画像の合成スタックが生成されます。このプロトコルにより、特定のセクション内の特定の細胞に対する多数の分子シグナルの共局在化が可能になります。さらに、これらの蛍光シグナルは、コンピュータソフトウェアを介して客観的に定量することができます。このプロトコルは、石灰化組織の組織学に関連する多くの欠点を克服し、筋骨格組織のハイスループット、ハイコンテントな表現型を前進させるためのプラットフォームとして機能します。

高スループット、マルチイメージCryohistologyのための一般的なワークフロー 図1は、この技術に使用される一般的なワークフローを示します。これは、イメージング、最終的には画像の位置合わせ/分析のいくつかのラウンドを経て固定からいくつかのステップを含みます。プロセスは、サンプルのこれらのタイプを脱灰するのにかかるよりも短い時間であるイメージングの4ラウンドを通る試料固定から行くために一週間ほど少しを取ることができます。イメージングの順序は、典型的には、（ 例えば 。 など 、TRAP、AP、）蛍光酵素活性アッセイに続いて多重蛍光免疫染色その後、試料（ 例えば 、GFPを、鉱化のラベルなど ）に既に存在する内因性のシグナルで始まりますおよび細胞周期分析アッセイ（ 例えば 、EDU）、最後に...

この原稿では、石灰化組織の凍結切片に対する数回の蛍光イメージングから、複数の応答測定値の整列した合成画像を生成するためのハイスループットの半自動凍結組織学プラットフォームを紹介します。

高スループット、石灰化組織のマルチイメージCryohistology

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

本技術の目的は、筋骨格系生物学者にとって費用対効果が高く有意義であり、かつ複雑なモデルシステムをハイスループットで観察者の主観を排除した完全デジタル方式で統合できる組織学的ツールを提供することです。組織学は、ほとんどの生物学的研究者にとって極めて重要ですが、多くの場合、労力がかかり定量的ではありません。したがって、効率的でハイスループットな自動解析を可能にする組織学的手法が求められています。当社のクライオヒストロジー・プラットフォームを使用すると、同一のスライドをハイスループット方式で繰り返しイメージングおよび染色することで、研究者は特定の標本内の特定の細胞に複数の分子シグナルを関連付けることができます。本手順の実演は、これらの技術の開発と実施を先導してきた私の研究室のリサーチアシスタントであるXi Jiang博士とLi Chenが行います。本手順を開始するには、標本をホルマリンから取り出し、余分な組織を切り除いてから、1x PBSで調製した30% sucroseに移します。検体をショ糖溶液中で4°Cで12〜24時間インキュベートします。次に、クライオモールドに埋め込み剤を満たし、検体をモールド内に配置します。その後、関心領域の切断面がモールドの底面と平行になるように、サンプルをモールド内で調整します。その後、凍結埋没剤の薄い層が凍結して検体が固定されるまで、クライオモールドをドライアイスの上に置きます。次に、クライオモールドをドライアイスペレットの上に置いたまま、残りの容量を凍結埋没剤で満たします。続いて、ドライアイスで予冷した2-メチルブタンが入った容器にクライオモールドを入れます。検体が完全に凍結したら、クライオモールドを取り出し、余分な2-methylbutaneを振り落とします。クライオモールドをセロファンで包み、-20 °Cまたは-80 °Cで保存します。本手順では、検体ブロックをフリーザーから-20 °Cから-25 °Cに設定したクライオスタットへ移します。次に、クライオモールドからブロックを取り出し、カミソリで過剰な凍結包埋剤を切り落とします。その後、標本ディスク上に凍結包埋剤を少量加え、標本ディスクの表面がブロックの底面と平行になるようにブロックを配置します。凍結包埋剤が凍結するまで待ちます。その後、検体ディスクを検体ヘッドに装着し、ブレードが検体ブロックの表面と平行に切断するようにヘッドを調整します。次に、関心領域を覆うのに十分な長さのクライオテープを切り、クライオスタット内で予冷しておきます。その後、必要に応じて調整を繰り返しながら、関心領域内のレベルまでブロックをトリミングします。目的の領域に到達し、薄切が可能な状態になったら、ブロック表面の削りカスをブラシで取り除きます。次に、粘着性のない銀色または金色のタブを持って、クライオテープから剥離紙を取り除きます。その後、粘着面を下にしてテープをブロックに貼り付けます。ローラーを使用してクライオテープに圧力をかけ、クライオスタットの自動モーターまたは手動の切断ホイールを用いて切片を作成します。その後、切片の組織面を上にして、クライオスタット内のプラスチック製顕微鏡スライドに載せます。プラスチックスライドをクライオスタットから取り出し、クライオ埋没剤を融解させて、切片がスライド表面に付着するようにします。連続切片または他の関心領域について、切断操作を繰り返します。完了後、切片をスライドボックスに入れ、保存期間およびその後の解析手法に応じて、4℃、-20℃、または-80℃で保存します。UV硬化接着剤法を行うには、まず顕微鏡スライドにラベルを貼ります。UV硬化光学接着剤を2枚のガラススライドに1滴ずつ滴下し、別のスライドの端を用いて、ガラススライドの表面に接着剤を薄く広げます。次に、銀色または金色のタブを切り取り、テープを貼った切片の組織面を上にして、1枚目のスライドの接着層の上に置きます。テープの下に気泡が閉じ込められるのを最小限に抑えるため、端から端へ転がすようにして切片を貼り付けます。その後、1枚目のスライドからテープで固定した切片を取り除き、2枚目のスライドの接着層の上に配置します。この際、気泡が混入しないよう注意してください。各スライドに、当該実験に必要な切片の枚数が配置されたら、周囲の余分な接着剤を拭き取ります。次に、テープの下に気泡や繊維が混入していないか、切片を詳しく点検してください。次に、顕微鏡スライドをUVブラックライトの下に5～10分間置き、接着層を架橋させます。このステップで、緑色のマイクロスフィア50 µLと赤色のマイクロスフィア50 µLを100 µLの水に溶解し、リファレンスマーカー溶液を調製します。この溶液は4 °Cで遮光保存してください。次に、ピペットチップをマイクロスフィア溶液に浸し、関心領域に隣接する各セクションにマイクロスフィア溶液を少量点付けします。続いて、スライドを室温で乾燥させ、その日に処理を行う場合は、アルミホイルで覆って30分間遮光して保護してください。その日に処理しない場合は、スライドをスライドボックスに入れ、4°Cで保存してください。切片の染色後、mounting mediumを用いてカバーガラスをスライドに封入します。イメージングを行うには、スライドを顕微鏡トレイにセットし、そのトレイをスライドスキャニング顕微鏡のトレイスタックに挿入します。次に、顕微鏡ソフトウェアのプロファイルリストをクリックし、各蛍光色素に適した露光時間が設定された各スライドのプロファイルを読み込みます。Start Preview Scanボタンをクリックし、各スライドのプレビュー画像を取得します。ソフトウェアは、スライドラベルに貼付されたバーコードを読み取り、自動的にファイル名を割り当てます。あるいは、各スライドに手動でファイル名を割り当てることも可能です。組織検出ウィザードに入り、描画ツールを使用して各領域を描画し、必要に応じて調整を行った後、以降のイメージングラウンドで使用するために保存して、関心領域（ROI）を設定します。各スライドの設定が完了したら、[Start Scan]ボタンをクリックしてスキャンプロセスを開始します。各ラウンドのイメージング後、次の染色ステップに進む前に、カバーガラスが自然に脱落するまで、1x PBSを満たしたコップリンジャーにスライドを浸漬させます。すべてのイメージングラウンドが完了した後、画像のアセンブリおよび解析のために、各個別チャネルの画像をTIFまたはJPGファイルとしてエクスポートします。この図では、3ヶ月齢のマウス大腿骨の切片をカルセインブルーで染色し、第1ラウンドのイメージングで蓄積ミネラル（白色）およびミネラル化標識（緑色および赤色）を撮影しました。その後、第2ラウンドでTRAP活性（黄色）、第3ラウンドでAP活性（赤色）をそれぞれ撮影しました。最後に、第4ラウンドでスライドをトルイジンブルーで染色しました。発色ラウンドを含むすべてのイメージングラウンドでリファレンスマーカーを撮影し、カスタムソフトウェアを用いて位置合わせを行いました。この手法を習得すれば、一般的な試料を脱灰させるよりも短い時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、骨格系研究コミュニティで幅広く活用されることが期待される、石灰化組織の高画質なハイコンテンツ画像の作成方法について、十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

骨髄の組織学的データを定量的に分析する戦略が提示されます。組織切片中の蛍光標識細胞の共焦点顕微鏡検査により、2次元画像が得られ、自動的に解析されます。異なる細胞タイプの共局在解析をシミュレーション画像からのデータと比較し、細胞相互作用に関する定量的な情報を提供します。...

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

この研究は、共焦点イメージングモダリティの完全な利用を可能にする、厚い3次元組織断面分析のための新規な処理およびイメージングプロトコルを提示する。このプロトコールは抗原性を保持し、皮膚組織学および潜在的に他の組織型を分析するための堅牢なシステムを表す。...

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

このプロトコルは、走査型電子顕微鏡 (SEM) を用いたナノスケールの分解能でイメージングのための組織の特定のセルを対象します。多数の生物学的素材の樹脂包埋切片に SEM...

大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング

2 つのサンプル処理技術、高圧凍結を組み合わせることのためのプロトコルの紹介、マイクロ波試料処理は続いて集束イオンビームのビーム走査型電子顕微鏡 (FIB SEM)...

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

この方法は、R26R-Confetti(Confetti)マウスモデルを使用してミネラル化された組織を研究し、繁殖戦略から画像取得に至るすべてのステップをカバーすることを説明します。含まれているすべての軟部組織に適用することができる一般的なプロトコルおよびミネラル化されたティッシュに適用することができる改変されたプロトコル。...

ミネラル化組織を研究するために紙吹雪マウスを用いてクローン遺伝トレース

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。...

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

このプロトコルは、人間の心臓から得られたサンプルを微視的スケールと巨視的スケールで分析するための包括的なパイプラインを提供します。...

ヒト心臓のマルチスケール3次元解剖学的研究のためのパイプライン

反復漂白拡張多重性(IBEX)と市販のヌクレオチド標識アッセイ(Click-iT...

組織サンプル中の皮膚細胞の表現型と増殖状態を評価するためのハイスループットイメージングおよび分析ワークフロー

網膜は、その層状構造全体で複雑な空間構成を示します。最新の空間トランスクリプトミクスおよびシーケンシング技術では、厚さ20μm&lt;組織切片が必要であり、網膜研究の適用性は限られています。この新鮮凍結凍結切片法は、平面的な空間的関係を維持しながら、マウス網膜の薄い 顔...

顔面 高次元空間分子解析のためのマウス網膜の凍結切片

このプロトコルには、Nanostring...

デジタル空間プロファイリングのための形態学およびRNA保存された石灰化動脈の準備・処理

このプロトコルは、高圧凍結(HPF)とワッフル法、低温集束イオンビーム(cryo-FIB)リフトアウト、線量対称の並列取得を統合することで、厚組織のクライオ電子断層撮影(cryo-ET)を標準化し、マウス海馬での再現可能な 現地...

マウス海馬における厚組織のクライオ電子断層撮影ワークフロー

学ぶ高スループットCryohistologyプラットフォームを用いた石灰化組織のマルチイメージング法。同一スライドでの複数回の蛍光イメージングと染色により、複数の分子シグナルを特定細胞に関連付け、観察者非依存で効率的な組織学的解析を実現します。

高スループット、石灰化組織のマルチイメージCryohistology

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