自己組織化反応押出、マイクロフルイディクス, 経由で複数の長さスケールでの分解性感温ハイドロゲルを加工・ エレクトロスピニング

このプロトコルの全体的な目標は、制御された長さスケールと形状を持つ熱応答性ヒドロゲルの分解性バージョンを製造することです。この方法は、長期的で低侵襲な局所薬物送達の促進、組織工学のための応答性足場の作成、標的ナノ治療薬の設計など、生物医学材料のシナリオにおける主要な課題に対処するのに役立ちます。私たちの技術の主な利点は、ポリマー前駆体の混合形状を変更することにより、分解性ヒドロゲルのサイズと形状を制御できる迅速な逆バイオヒドラゾン化学です。

この柔軟性により、葉ジェル、マイクロゲル、ナノゲル、ナノファイバーのすべてを同じ出発材料で作製することができます。まず、ヒドラジドとアルデヒド官能化熱応答性前駆体ポリマー溶液をそれぞれ約2ミリリットル調製し、濃度が5〜40重量%で、10ミリモルのリン酸緩衝生理食塩水を準備します。シングルバレルシリンジを使用して、前駆体ポリマー溶液を2.5ミリリットル、1:1ダブルバレルシリンジの別々のバレルにロードします。

次に、1.5インチのスタティックミキサーを2.5ミリリットルの1:1ダブルバレルシリンジに接続します。必要に応じて、18ゲージまたは20ゲージの1.5インチ針をスタティックミキサーに取り付けます。次に、希望の厚さの柔らかいシリコーンゴムシートから切り取ります。

標準的な顕微鏡のスライドほどの大きさの作品です。パンチセットを使用して、シリコーンゴムシートに目的の形状の少なくとも1つの穴を開けます。シリコーンゴムの型をきれいなスライドガラスの上に置き、すべての穴がガラスで支えられていることを確認します。

金型をスライドにそっと押し付けて、所定の位置に固定します。シリコーンゴムシートは、基材の良好な接着性を確保するためのバッキングとしても使用できます。ヒドラジドとアルデヒド官能化ポリマー溶液をスタティックミキサーでモールドウェルに押し出し、ウェルが完全に充填されるまでします。

型を2枚目のきれいなスライドガラスで覆い、ゲル化が完了するのを待ちます。次に、トップスライドを取り外し、へらを使用してシリコーンゴム型からハイドロゲルを分離します。金型をスライドから持ち上げて、ハイドロゲルを回収します。

手順の前に、微粒子生成用のマイクロ流体チップを作製します。ヒドラジドとアルデヒド官能化ポリNIPAMを合成します。まず、脱イオン水中のヒドラジドとアルデヒド官能化ポリNIPAMの6重量%溶液をそれぞれ2ミリリットル調製します。

ポリマー前駆体溶液を別々の5ミリリットルシリンジに入れます。次に、重質パラフィン油中のモノオレイン酸ソルビタンの1重量%溶液150ミリリットルを調製します。この溶液を2つの標準60ミリリットルシリンジに入れます。

4つのシリンジを別々の輸液シリンジポンプに取り付けます。次に、長さ45センチメートルのシリコンチューブをマイクロ流体チップ出口に接続します。アウトレットチューブの端を廃棄物容器に入れます。

ポリマー溶液シリンジを、長さ30cmのシリコンチューブでマイクロ流体チップのポリマーインレットチャネルに接続します。1つのパラフィン油溶液シリンジをシリコンチューブで上流の油入口チャネルに接続します。もう一方のオイルシリンジを、シリコンチューブとU字型シリンジジョイントを使用して、両方の下流のオイルインレットチャネルに接続します。

オイルシリンジを装備したポンプの流量を1時間あたり1.1〜5.5ミリリットルに設定します。マイクロ流体チップにオイルを少なくとも30分間流して、チップをプライミングし、チップに欠陥がないことを確認します。次に、両方のポリマー溶液をプライミングしたチップに1時間あたり03 mLで同時に送達します。

ポリマーとオイルの流れを30分から1時間平衡化させます。マイクロ流体ノズルでの前駆体ポリマーの早期ゲル化を防ぐためには、チューブを慎重にプライミングし、ポリマーの流れを正確に開始して、いずれかのポリマーリザーバーへの逆流を防ぐことが不可欠です。マイクロ流体チップのノズルで均一なゲル微粒子が形成されたら、アクティブマグネチックスターバーを備えたプラスチック遠心分離チューブに粒子を収集します。

オイルが消費されたら、シリンジポンプと攪拌モーターを停止します。ゲル微粒子がチューブ内に沈殿したら、ピペットでパラフィンオイルをデカントします。5mLの微粒子ごとに10ミリリットルのペンタンをフラスコに加えます。

エモルションを約1分間激しく混ぜます。粒子が1〜2時間沈殿するのを待ってから、ピペットでペンタンをデカントします。このペンタンウォッシュを少なくとも5回繰り返します。

洗浄したゲル微粒子を小さなガラスシンチレーションバイアルに移します。粒子を1〜2ミリリットルの脱イオン水に再懸濁します。この手順を開始するには、脱イオン水中のヒドラジドとアルデヒド官能化ポリNIPAMの1%溶液をそれぞれ5ミリリットル調製します。.

ヒドラジド官能基化ポリNIPAM溶液の5ミリリットルを攪拌しながら摂氏70度に加熱します。溶液が不透明になるのを監視し、目に見える沈殿物が形成されていないことを確認します。次に、0.25ミリリットルのアルデヒド官能化ポリNIPAM溶液を、加熱したヒドラジド官能化ポリNIPAM溶液に5〜10秒間かけて滴下します。

混合物を摂氏70度で15分間攪拌します。次に、混合物をオイルバスから取り出し、一晩室温まで冷まして、精製用のナノゲルを取得します。ナノゲル混合物を分子量3500キロダルトンのカットオフ透析膜に入れます。

ナノゲルをイオン化水に対して6時間サイクルで6回透析し、架橋されていないポリマーを除去します。必要に応じて、精製したナノゲルを凍結乾燥して保存します。ゲルナノファイバー作製手順を開始するには、脱イオン水中のヒドラジドおよびアルデヒド官能化POEGMAの15重量%溶液をそれぞれ1ミリリットル調製します。

次に、脱イオン水中に高分子量ポリエチレンオキシドの5重量%溶液を2ミリリットル調製します。各POEGMA前駆体溶液を1ミリリットルのポリエチレンオキシド溶液と組み合わせます。前駆体溶液をダブルバレルシリンジの別々のバレルにロードします。

次に、1.5インチのスタティックミキサーと先端が鈍い18ゲージの針を2.5ミリリットルの1:1ダブルバレルシリンジに接続します。ダブルバレルシリンジを輸液シリンジポンプに取り付けます。次に、針の端から10cmのところにアルミディスクエレクトロスピニングコレクターを取り付けます。

高電圧電源をコレクターで接地し、電源を針に接続します。シリンジポンプを0.48ミリリットル/時に設定し、電源を10キロボルトに設定します。シリンジポンプと電源を同時に始動して、エレクトロスピニングを開始します。

所望の厚さに達するか、前駆体が使い果たされるまで続けます。ナノファイバーの製造が終了したら、エレクトロスピニングアセンブリの電源を切り、切断します。回収したゲルナノファイバーを脱イオン水に24時間浸し、ポリエチレンオキシドを除去します。

ダブルバレルシリンジ送達により、前駆体ポリマー濃度、反応性官能基密度、およびモノマー上のエチレンオキシドリピート単位の数に応じて、さまざまな力学、ゲル化時間、および透明性を備えたヒドラゾン架橋POEGMAバルクヒドラゲルが作製されました。パラフィン油とポリマー前駆体溶液の両方の流速は、マイクロ流体デバイスで作製されたハイドロゾーン架橋ポリNIPAMゲル微粒子のサイズに影響を与えました。可逆的な温度依存性の腫脹がホットステージ光学顕微鏡法で観察されました。

ゲルマイクロ粒子は、時間の経過とともにオリゴマー前駆体に分解されました。自己組織化ヒドラゾン架橋ポリNIPAMナノゲルのサイズは、アルデヒドとヒドラジド官能基化ポリマーのプレカーサー質量比によって異なりましたが、高度にモノ分散したままでした。質量比が増加するにつれて、熱膨張が少なく観察されました。

ゲル微粒子と同様に、ナノゲルは時間の経過とともにオリゴマー前駆体に分解されます。反応性エレクトロスピニングにより、直径300ナノメートルオーダーのヒドラゾン架橋POEGMAハイドロゲルナノファイバーを作製しました。ナノファイバーの水和は、同じポリマー組成のバルクゲルの水和よりも約2桁速かった。

ナノファイバーは、生理学的条件下で分解する前に、ナノファイバーの形態を8週間以上保持しました。酸性環境では、より速い劣化が起こりました。ナノファイバーは、乾燥状態と膨潤状態の両方で機械的に堅牢でした。

このビデオをご覧になった後、ゲル前駆体ポリマーが作られる形状を制御することにより、分解性で熱応答性のあるハイドロゲルを作成する方法について十分に理解していただければ幸いです。ポリマー前駆体のゲル化時間が各粒子のニーズに一致していることを確認することを忘れないでください。ゲル化が速すぎると、マイクロゲル化とナノファイバー製造が阻害されます。

ゲル化が遅すぎると、完全に凝集した形態になります。これらの技術は、薬物送達と組織工学の分野の研究者に道を開きます。また、薬物放出の速度や位置を制御したり、組織再生を刺激したりするための、明確に定義されたハイドロゲルスキャフォールドを設計します。