のpH依存性活性の検出エシェリヒア・コリシャペロンHdeBインビトロとインビボ

これらのin vivoおよびin vitroシャペロンアッセイの全体的な目標は、酸性pH条件下での大腸菌シャペロンHdeBのpH依存性活性を特徴付けることです。酸活性化シャペロンの仕事はただ一つ、酸によって誘発されるタンパク質のアンフォールディングと分解からタンパク質を保護する必要があります。この機能は腸内細菌にとって特に重要であり、腸内細菌は腸にうまくコロニーを形成するために胃の酸性環境を生き残る必要があります。

ここで紹介する方法により、酸活性化シャペロンを特定して特性評価し、その活性化につながるpH条件を定義することができます。このビデオを見た後、HdeB in vitro や in vivo などのシャペロンの特性評価方法を十分に理解できるはずで、その活性化のメカニズムを解読するのに役立ちます。これらの方法は、HDAなどの他の酸保護シャペロンにうまく適用されており、他のシャペロンやストレス条件で動作するようにさらに変更することができます。

精製されたHdeBが、異なるpH値での熱的に展開するブタミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼの凝集に及ぼす影響をモニターします。4リットルの緩衝液C.Thenに対して、摂氏4度で一晩中MDHを透析し、分子量カットオフが30キロダルトンの遠心フィルターユニットを使用してタンパク質を約100マイクロモルに濃縮します。凝集体を除去するには、タンパク質を摂氏4度でGの20,000倍で20分間遠心分離します。

280ナノモルの吸光度によりMDH濃度を測定します。次に、50マイクロリットルのMDHアリコートを準備し、アリコートを急速冷凍して保存します。1ミリリットルの石英キュベットを、温度制御されたサンプルホルダーとスターラーを備えた蛍光分光光度計に入れます。

励起波長と入射波長を350ナノメートルに設定します。予め加温した緩衝液Dを所望のpH値で適切な量をキュベットに加えます。総容量は1, 000マイクロリットルです。

キュベットホルダーの温度を摂氏43度に設定します。バッファーに12.5マイクロモルのHdeBを添加し、続いて0.5マイクロモルのMDHを添加します。光散乱の監視を開始します。

反応を360秒間インキュベートして、MDHが十分に展開できるようにします。0.16〜0.34容量の2モルの緩衝されていないリン酸二カリウムを追加してpHを7に上げ、さらに440秒間光散乱を記録し続けます。テキストプロトコルで説明されているようにデータを分析します。

HdeBを発現するプラスミドまたはMDベクターコントロールであるPBAD 18を、化学的にコンピテントな細胞を用いてBB7224 Delta RPOH株に形質転換します。この株は温度に敏感で、摂氏30度で培養する必要があります。42°Cで45秒間の熱ショックを受けた後、めっき前に、細胞を30°C、200RPMでインキュベートします。

ポジティブクローンのシングルコロニーストリークアウトを行い、摂氏30度で一晩インキュベートします。アンピシリンを含む50ミリリットルのLBで一晩培養し、200RPMおよび摂氏30度で細胞を培養します。アンピシリンで25ミリリットルのLBに40折りにして、夜の培養で希釈します。

0.5%アラビノースの存在下で摂氏30度、RPM200rpmで600ナノメートルの光学密度、またはOD600が1.0に等しいまで細菌を増殖させ、HDEBタンパク質の発現を誘導します。pHシフト実験では、LBとアンピシリンおよびアラビノースを使用して、細胞をOD 60000000.5に希釈します。5モルの塩酸の適切な量を追加することにより、それぞれのpH値に調整します。

示された時点の後、適切な量の5モル水酸化ナトリウムを添加して培養物を中和します。中和した培養物と液体培養物の増殖を、OD測定を使用して摂氏30度で12時間モニターします。in vitroでHdeBのシャペロン活性の最適なpHを調べるために、ネイティブMDHを、存在または非存在下で示されたpHの予め加温された緩衝液に希釈しました。

360秒のインキュベーション後、中和によりMDHの43°Cでの凝集が引き起こされました。HdeBの存在下では、pH 4から中和すると光散乱シグナルが著しく減少し、HdeBがMDHの凝集を防止することを示しています。アグリゲーション測定は、温度やバッファー含有量の変化に非常に敏感です。

誤検出の結果を排除するために、クライアント集約に対するシャペロンストレージバッファの影響を調査しました。HdeB ストレージ バッファーは MDH 凝集に影響を与えませんでした。in vivoでのHdeBの影響を調べるために、温度感受性RPOH欠失株を用いてpH依存性生存アッセイを実施しました。

この株はほとんどのシャペロンを欠いているため、高温、低pH、または酸化ストレスの影響を受けやすくなります。中性pH条件下でのHdeBの過剰発現は、株の増殖速度に影響を与えず、空のベクターであるPBAD 18を保有する対照株と同等に増殖しました。対照的に、pH 3またはpH 4の処理で増殖を再開する能力には明らかな違いが見られ、HdeB過剰発現株は、対照株と比較して低pH処理からの回復が再現性よく改善されたことを示しました。

一度習得すれば、精製は3日で、in vitro散乱アッセイは1日で、in vivo生存アッセイは適切に実施されれば2日で行うことができます。これらの実験を行う際には、クライアントタンパク質の種類、その濃度、使用するバッファー条件の両方に関して、実験デザインを慎重に検討してください。この手法の主な利点は、シャペロン活性化のメカニズムとその効果をin vivoの状況でより詳細に理解するのに役立つことです。

また、酸保護シャペロンの最適なpHを研究することは非常に難しい場合があることを忘れないでください。これは、使用するクライアントタンパク質の凝集挙動もpHによって変化する可能性が高いためです。したがって、シャペロンとクライアントタンパク質の両方に適したバッファーシステムを選択するようにしてください。

この手順に続いて、SCSページによるスピンダウンアッセイなどの他の方法も、シャペロンを介したクライアントアグリゲーションの自動定量化抑制で実行できます。