神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ
2016年10月20日
我々は、高スループット、多重化を説明、およびプロテオミクス脳脊髄液（CSF）の臨床翻訳のための潜在的に開発されたアッセイをターゲットに。テストでは、このようなアポリポタンパク質Eバリアント（E2、E3およびE4）などの神経変性のための潜在的なマーカーおよびリスク要因を、定量、およびそれらの対立遺伝子の発現を測定することができます。
この方法の全体的な目標は、脳脊髄液(CSF)中の複数のバイオマーカーを迅速かつ手頃な価格で定量し、診断および治療モニタリングへの使用を評価することです。これは、これまで測定できなかったバイオマーカーを測定できる新しいアッセイです。そして、これは診断目的や、さまざまな神経変性疾患を区別し、予後情報を提供するためにも使用できると考えています。
この技術の主な利点は、迅速でサンプル調製が簡単で、特異性が高く、臨床ラボへの翻訳に費用対効果が高いように設計されていることです。この手法の意味は、治療や診断にまで及び、このハイスループットテストは、神経変性の新しい治療法の将来の臨床試験で使用できる可能性があります。この方法論は、腎臓障害の尿、心筋症の血漿、多能性の細胞など、他の疾患や組織にも適用できます。
この手順を開始するには、製造元の指示に従って、目的の合成ペプチドを1ミリグラム/ミリリットルのストック濃度に再懸濁します。ストック濃度からペプチドの10分の1希釈分を調製し、各ペプチドの1,000ピコモルを低結合性微量遠心チューブにプールします。プールしたペプチドサンプルをSpeedVac濃縮器で乾燥させます。
終了したら、サンプルを摂氏マイナス20度で保存します。次に、100マイクロリットルのCSFを低結合性微量遠心チューブに分注します。CSFサンプルを凍結乾燥します。
プールしたペプチドサンプルのアリコートを消化バッファーに再懸濁して、1マイクロリットルあたり10および1ピコモルの濃度を得ます。次に、プールしたペプチドサンプルを凍結乾燥した 100 マイクロリットルアリコートの CSF に、0、1、2、5、10、15 ピコモル濃度でスパイクします。次に、トリプシンの消化効率を制御するための内部標準物質として作用する20ナノグラムの無傷の無関係なタンパク質を添加します。
消化バッファーをCSFアリコートに添加して最終容量を20マイクロリットルにし、サンプルをボルテックスします。これに続いて、1.5マイクロリットルのジチオスレイトールを加え、室温で1時間振とうすることにより、標準プロトコルに従ってサンプルを分解します。これに続いて、3マイクロリットルのヨードアセトアミドをサンプルに加え、暗所で室温で45分間振とうします。
次に、165マイクロリットルの二重蒸留水を追加します。0.1マイクログラム/マイクロリットルのシーケンシンググレードの修飾トリプシン溶液を10マイクロリットル加え、50ミリモルの重炭酸アンモニウム緩衝液に再懸濁してサンプルに添加します。サンプルを摂氏37度の水浴で一晩インキュベートします。
次に、サンプルを凍結して分解を停止します。CSF消化物を氷上で解凍した後、16, 000回gで10分間遠心分離します。終了したら、各ダイジェストの60マイクロリットルを300マイクロリットルのガラスインサートバイルに移します。
C18 UPLC カラムを搭載した LC-MS システムを使用して、10 分間、1 から 40% のアセトニトリル線状グラジエントを使用して、標準曲線ポイントから最高濃度を注入します。分析が完了したら、得られたクロマトグラムをソフトウェアで開き、ペプチドあたりの保持時間と上位 2 つの最も強いトランジションをメモします。この情報に基づいて、以前に作成した多重反応モニタリング、またはMRMメソッドをタイミングチャネルで更新してペプチドを測定します。
感度を維持するには、各ペプチドの少なくとも 1 つのトランジションについて、各チャネルのピークあたりのポイント数が 8 を超え、滞留時間が 0.01 秒を超えている必要があります。MS メソッドファイルでメソッドイベントの溶媒遅延を選択することにより、MRM メソッドに溶媒遅延を含めます。短いHPLC分析法では、正しいピークを正しく一致させることが重要です。
これは、標準曲線に使用されるマトリックス中のスパイクペプチドを使用し、分析法開発中に複数のトランジションを観察することで行うことができます。最後に、データ注釈を手動で確認して、正確性を確保します。各ペプチドと、適切な安定同位体標識内部標準に対する比率を分析します。
ハイスループット CSF アッセイで得られた重要なペプチドマーカーのクロマトグラムを以下に示します。このデータは、関連する安定同位体標識内部標準に対する標準化された比率を示しており、これを使用して絶対CSF濃度を決定し、臨床サンプルの変化について統計的に分析できます。このCSFアッセイに含まれる74種類のペプチドを定量したところ、認知症患者のCSFでは25種類が有意に変化していることが明らかになり、認知症マーカーであるプロオレキシンとYKLキチナーゼ-3様タンパク質の結果がここに表示されます。
ApoE4はアルツハイマー病の既知の危険因子であり、ApoEアイソフォームの検出は、アイソフォームE2およびE4のアミノ酸変化に対応するペプチドの検出に基づいています。各アイソフォームの組み合わせで予想されるピークパターンを以下に示します。メソッドが設定されると、適切に実施されれば、アッセイは1日で行うことができます。この方法の開発後、高い分析感度と特異性を持つ新しいバイオマーカーのセットを測定することが可能になり、これにより研究者は神経変性疾患を新しい方法で評価することが可能になります。
このビデオを見れば、MRMアッセイの感度と特異性の設計と最適化の方法について十分に理解できるはずです。DTE、シロアリ、ギ酸、およびヒト組織での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順では手袋を着用するなどの予防措置を適用する必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、脳脊髄液（CSF）の臨床応用が潜在的に可能な高スループット、マルチプレックス、標的プロテオミクスアッセイを紹介します。このアッセイは、アポリポプロテインE変異体を含む神経変性に関連するバイオマーカーを定量化します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- プロテオミクス
- 臨床診断
背景
- 脳脊髄液（CSF）はバイオマーカー発見の貴重な源です。
- 神経変性疾患には効果的な診断ツールが必要です。
- 現在の方法では関連するすべてのバイオマーカーを測定できない可能性があります。
- 高スループットアッセイは診断能力を向上させることができます。
研究の目的
- CSFの複数のバイオマーカーを定量化する迅速で費用対効果の高いアッセイを開発すること。
- これらのバイオマーカーの診断と治療モニタリングの可能性を評価すること。
- 様々な神経変性疾患を区別すること。
使用された方法
- 高スループットマルチプレックスプロテオミクスアッセイ開発。
- アポリポプロテインE変異体（E2、E3、E4）の定量化。
- シンプルさと速度を考慮したサンプル調製。
- 神経変性における臨床環境でアッセイの適用。
主要な結果
- アッセイはCSFの複数のバイオマーカーを成功裏に定量化します。
- 以前は測定できなかったバイオマーカーの測定が可能になります。
- 神経変性療法の臨床試験での使用の可能性を示しました。
- 他の疾患や組織タイプに方法論を適応できます。
結論
- このアッセイはバイオマーカー測定の重要な進歩を表しています。
- 診断と治療モニタリングの両方に影響を与えます。
- この技術は臨床応用とより広範な応用に向けて準備ができています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput, multiplexed targeted proteomic assays for CSF biomarkers address a critical bottleneck in neurodegenerative disease research by enabling rapid, quantitative, and specific measurement of multiple protein markers. This capability enhances predictive confidence in biomarker-driven target validation and supports translational continuity from discovery to clinical trial readiness. The approach is strategically positioned to de-risk portfolio decisions and accelerate the development of novel therapies for neurodegeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of neurodegenerative disease biomarkers in clinically relevant matrices.
- Supports functional validation of candidate biomarkers and risk factors such as ApoE isoforms.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing disease subtypes through multiplexed analysis.
- Improves predictive confidence for biomarker selection and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible workflows for multiplexed protein quantitation in CSF.
- Provides high analytical sensitivity and specificity for reliable biomarker measurement.
- Enables rapid assay turnaround, supporting scalable screening and downstream platform integration.
- Reduces reliance on single-analyte ELISA, expanding assay versatility and throughput.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomarker quantitation with disease-relevant clinical endpoints for translational studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical and early clinical validation of biomarkers.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, quantitative biomarker data.
- Facilitates cross-disease and cross-tissue application for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This targeted proteomic workflow bridges early discovery, lead identification, and translational research by providing quantitative, multiplexed biomarker data directly from CSF samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for neurodegenerative disease mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility for high-throughput biomarker evaluation.
- Analytics: Provides absolute quantitation and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Enables biomarker alignment with clinical phenotypes and disease progression.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for biomarker quantitation across multiple disease areas and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker-driven research.
- Operational Value: Standardizes and streamlines multiplexed protein quantitation workflows for scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biomarker validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in targeted proteomics and mass spectrometry method development.
- Demands access to triple quadrupole LC-MS/MS instrumentation and analytical infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for assay reproducibility and data comparability.
- Must be adapted for specific protein targets and sample matrices to ensure optimal performance.
- Practical limitations include the need for careful peptide selection and internal standard calibration as described in the protocol.
