神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

この方法の全体的な目標は、脳脊髄液(CSF)中の複数のバイオマーカーを迅速かつ手頃な価格で定量し、診断および治療モニタリングへの使用を評価することです。これは、これまで測定できなかったバイオマーカーを測定できる新しいアッセイです。そして、これは診断目的や、さまざまな神経変性疾患を区別し、予後情報を提供するためにも使用できると考えています。

この技術の主な利点は、迅速でサンプル調製が簡単で、特異性が高く、臨床ラボへの翻訳に費用対効果が高いように設計されていることです。この手法の意味は、治療や診断にまで及び、このハイスループットテストは、神経変性の新しい治療法の将来の臨床試験で使用できる可能性があります。この方法論は、腎臓障害の尿、心筋症の血漿、多能性の細胞など、他の疾患や組織にも適用できます。

この手順を開始するには、製造元の指示に従って、目的の合成ペプチドを1ミリグラム/ミリリットルのストック濃度に再懸濁します。ストック濃度からペプチドの10分の1希釈分を調製し、各ペプチドの1,000ピコモルを低結合性微量遠心チューブにプールします。プールしたペプチドサンプルをSpeedVac濃縮器で乾燥させます。

終了したら、サンプルを摂氏マイナス20度で保存します。次に、100マイクロリットルのCSFを低結合性微量遠心チューブに分注します。CSFサンプルを凍結乾燥します。

プールしたペプチドサンプルのアリコートを消化バッファーに再懸濁して、1マイクロリットルあたり10および1ピコモルの濃度を得ます。次に、プールしたペプチドサンプルを凍結乾燥した 100 マイクロリットルアリコートの CSF に、0、1、2、5、10、15 ピコモル濃度でスパイクします。次に、トリプシンの消化効率を制御するための内部標準物質として作用する20ナノグラムの無傷の無関係なタンパク質を添加します。

消化バッファーをCSFアリコートに添加して最終容量を20マイクロリットルにし、サンプルをボルテックスします。これに続いて、1.5マイクロリットルのジチオスレイトールを加え、室温で1時間振とうすることにより、標準プロトコルに従ってサンプルを分解します。これに続いて、3マイクロリットルのヨードアセトアミドをサンプルに加え、暗所で室温で45分間振とうします。

次に、165マイクロリットルの二重蒸留水を追加します。0.1マイクログラム/マイクロリットルのシーケンシンググレードの修飾トリプシン溶液を10マイクロリットル加え、50ミリモルの重炭酸アンモニウム緩衝液に再懸濁してサンプルに添加します。サンプルを摂氏37度の水浴で一晩インキュベートします。

次に、サンプルを凍結して分解を停止します。CSF消化物を氷上で解凍した後、16, 000回gで10分間遠心分離します。終了したら、各ダイジェストの60マイクロリットルを300マイクロリットルのガラスインサートバイルに移します。

C18 UPLC カラムを搭載した LC-MS システムを使用して、10 分間、1 から 40% のアセトニトリル線状グラジエントを使用して、標準曲線ポイントから最高濃度を注入します。分析が完了したら、得られたクロマトグラムをソフトウェアで開き、ペプチドあたりの保持時間と上位 2 つの最も強いトランジションをメモします。この情報に基づいて、以前に作成した多重反応モニタリング、またはMRMメソッドをタイミングチャネルで更新してペプチドを測定します。

感度を維持するには、各ペプチドの少なくとも 1 つのトランジションについて、各チャネルのピークあたりのポイント数が 8 を超え、滞留時間が 0.01 秒を超えている必要があります。MS メソッドファイルでメソッドイベントの溶媒遅延を選択することにより、MRM メソッドに溶媒遅延を含めます。短いHPLC分析法では、正しいピークを正しく一致させることが重要です。

これは、標準曲線に使用されるマトリックス中のスパイクペプチドを使用し、分析法開発中に複数のトランジションを観察することで行うことができます。最後に、データ注釈を手動で確認して、正確性を確保します。各ペプチドと、適切な安定同位体標識内部標準に対する比率を分析します。

ハイスループット CSF アッセイで得られた重要なペプチドマーカーのクロマトグラムを以下に示します。このデータは、関連する安定同位体標識内部標準に対する標準化された比率を示しており、これを使用して絶対CSF濃度を決定し、臨床サンプルの変化について統計的に分析できます。このCSFアッセイに含まれる74種類のペプチドを定量したところ、認知症患者のCSFでは25種類が有意に変化していることが明らかになり、認知症マーカーであるプロオレキシンとYKLキチナーゼ-3様タンパク質の結果がここに表示されます。

ApoE4はアルツハイマー病の既知の危険因子であり、ApoEアイソフォームの検出は、アイソフォームE2およびE4のアミノ酸変化に対応するペプチドの検出に基づいています。各アイソフォームの組み合わせで予想されるピークパターンを以下に示します。メソッドが設定されると、適切に実施されれば、アッセイは1日で行うことができます。この方法の開発後、高い分析感度と特異性を持つ新しいバイオマーカーのセットを測定することが可能になり、これにより研究者は神経変性疾患を新しい方法で評価することが可能になります。

このビデオを見れば、MRMアッセイの感度と特異性の設計と最適化の方法について十分に理解できるはずです。DTE、シロアリ、ギ酸、およびヒト組織での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順では手袋を着用するなどの予防措置を適用する必要があることを忘れないでください。