磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

本手法の総合的な目的は、磁性プロテインAまたはGビーズを用いて、精製サンプルまたは細胞培地から直接、抗体を蛍光色素で標識することです。この手法を用いることで、細胞培地中にごく少量しか含まれていない抗体であっても、その標識化学反応を最適化することができ、結果として抗体の下流アプリケーションにおける性能向上につながります。

本手法の主な利点は、抗体の精製が不要であること、アミン化学またはチオール化学を利用できること、そして自動または手動のいずれでも実施可能であることです。まず、穏やかに振盪してビーズを均一に再懸濁させます。次に、1.5 mL マイクロ遠心チューブにビーズを 50 µL 加えます。

次に、チューブをマグネットスタンドに設置します。10秒後、保存バッファーを250 µLの抗体結合バッファーに慎重に置換し、ビーズを十分に混ぜ合わせます。さらに10秒後、結合バッファーを1 mLの目的抗体に慎重に置換します。

室温で60分間、サンプルを混合します。インキュベーション終了後、チューブをマグネットに戻し、ビーズがチューブの側面に集まったら上清を除去します。その後、抗体結合洗浄バッファー250 µLを用いて、1回10秒間の洗浄を2回行い、ビーズと抗体の混合物を洗浄します。

アミン化学を用いて抗体を標識するには、2回目の洗浄後、洗浄バッファーを100 µLのアミン結合バッファーに交換し、抗体100 µgあたり2.5 µLの調製直後のアミン反応性染料を加えます。標識中にビーズを懸濁状態に保つため、室温で60分間サンプルをボルテックスします。その後、チューブを再びマグネットに10秒間戻し、上清を除去します。

先ほど示した手順に従い、抗体結合洗浄バッファーでビーズを2回洗浄します。次に、洗浄バッファーを50 µLの溶出バッファーに交換し、ビーズを5分間混合します。チューブをマグネットに戻して10秒間静置し、溶出された抗体を、5 µLの中和バッファーが入った新しいマイクロ遠心チューブに移します。

先ほど示した通り、もう一度抗体を溶出させ、溶出サンプルを回収します。次に、抗体-色素複合体の吸光度を280 nanometersおよび色素のlambda maxで測定します。チオール化学を用いて抗体を標識するには、2回目の洗浄後、洗浄バッファーを250 microlitersのチオール結合バッファーに交換し、緩やかなピペッティングでビーズを混合します。

10秒後、抗体結合洗浄バッファーでビーズを2回洗浄します。次に、洗浄バッファーを100 µLのチオール結合バッファーに交換し、最終濃度が2.5 mMとなるようにDTTを添加します。その後、ビーズをさらに60分間混合します。

その後、ビーズを再びマグネットに戻して10秒間保持し、バッファーを除去します。次に、250 µLのチオール結合バッファーをビーズに加え、穏やかに混合します。10秒後、抗体結合洗浄バッファーでビーズを2回洗浄し、2回目の洗浄後は100 µLの新鮮なチオール結合バッファーに置換します。

次に、抗体 100 µg あたり 2.5 µL の調製直後のチオール反応性染料を加え、ビーズを室温で 60 分間混合します。インキュベーション終了後、チューブを再度マグネットに戻し、10 秒間静置します。その後、緩やかに混合しながら、上清を 250 µL の新鮮なチオール結合バッファーに置換します。

10秒後、ビーズを2回洗浄します。次に、洗浄バッファーを50 µLの溶出バッファーに交換し、先ほど示した方法で、結合した抗体を2回溶出します。その後、抗体-色素複合体の吸光度を280 nmおよび色素のλmaxで測定します。

抗体とProtein Gの強い親和性、磁石とビーズの強固な親和性、およびビーズ精製前の手法の最適化により、標識反応中の抗体の損失はわずかとなります。これは、単純な精製と比較して、蛍光二重標識後の3種類の異なるマウス抗体アイソタイプが高い効率で回収されたことで証明されています。この回収率はクマシー染色ゲルでも確認でき、磁性G Proteinビーズの非特異的結合特性が低いため、高度に精製された蛍光二重標識重鎖および軽鎖の存在が認められます。磁性Protein Aビーズを用いたビーズ上標識においても、複数の蛍光色素との適合性があり、高い回収率と良好な色素対抗体比（D/A比）が得られます。

この手法に習熟し、適切に実施すれば、2～3時間で完了させることができます。これにより、複数のサンプルを手動で処理することや、スループット向上のための自動化プラットフォームの利用が可能になります。本手順を行う際は、磁気ビーズを常に懸濁状態に保つことが重要です。

サンプルに適した容量の磁気ビーズを選択してください。また、目的の抗体に合わせて蛍光色素の量を最適化します。この手順に続き、ELISAや FACS、あるいは細胞ベースのアッセイなどの適切な生物学的アッセイを用いて、標識抗体の機能性を検証する必要があります。

このビデオを視聴することで、磁性プロテインAまたはGビーズを用いて、精製済みおよび未精製の抗体を蛍光タグや、ビオチンや細胞毒性薬剤などの他の低分子で標識する方法について深く理解することができます。