Name: リトマス試験を用いて細菌の比色検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶ、リトマス試験を用いた大腸菌の比色検出法。RNA切断型DNAザイムとウレアーゼを組み合わせ、簡便かつ迅速に細菌を検出する分子診断技術を習得できます。

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この研究プロジェクトのための資金は、カナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）によって、ディスカバリー助成金を通じてYLに提供されました。

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
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<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li>
<li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
<li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+%27MgZ%27+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224(2007).</li>
<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

図1に示すように、リトマス試験に細菌応答性DNAザイムのRNA切断活性の作用の翻訳は、ウレアーゼと磁気分離を使用することによって可能となる。細菌検出のための修正されたリトマス試験のデモンストレーションではあるがE.で行わ大腸菌依存性RNA切断DNAザイム、5,19,20デザインは、一般的に任意のRNA切断DNAザイムのために拡張することができます。異なる検体と新たな目標のためにランダム配列プールからの新しいRNA切断DNAザイムを単離するための様々な方法論のためのRNA切断DNAザイムの偉大な可用性を考えると、我々は修正されたリトマス試験プラットフォームは関心の多様な標的の検出に拡張することができることを期待します。 E.のためのリトマス試験報告反応時間は、それぞれ、1及び2時間に設定されている場合大腸菌検出は5,000と500の細胞を検出することができます。人気のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）法は、...

細菌性病原体は、世界的な罹患率と死亡率の主要な原因の一つです。院内感染、食品媒介性病原体、環境中の細菌汚染物質による発生は、公衆衛生と安全に深刻かつ継続的な脅威をもたらします。これらのアウトブレイクを防ぐためには、さまざまな状況下で病原体をタイムリーに検出できる効果的なツールが必要です。シンプルでありながらも持ち運び可能で費用対効果の高い効果的な検査は、特にアウトブレイクの影響を受けやすいが高価な検査施設を買う余裕がない地域では、非常に切望されています。1-3 細菌を検出する方法は数多く存在しますが、その多くは、長い検査時間、高価な機器、複雑な検査手順を必要とするため、スクリーニングや現場での検査ツールとしては適していません。
比色検査は、肉眼で色の変化を簡単に検出できるため、ポイントオブケアやフィールドアプリケーションにとって特に魅力的です。pHのリトマス試験は、簡単、迅速、そして効果的です。これは非常に古い技術ですが、そのシンプルさと有効性により、今日でも広く使用されています。驚くべきことに、この単純な検査は、最近、この検査を大腸菌検査用に修正するアプローチを開発するまで、他の分析物の検出を達成するために変更されていませんでした。4
大腸菌の拡張リトマス試験紙は、3つの追加要素を使用します:大腸菌活性化RNA切断DNAzyme（EC1)、5ウレアーゼ、および磁気ビーズ。DNAザイムとは、触媒活性を持つ合成一本鎖DNA分子を指します。6 これらは、in vitro選択を使用してランダム配列DNAプールから単離できます。7,8 それらは非常に安定しており、高効率の自動DNA合成を使用して費用対効果の高い方法で製造できます。9 これらの理由から、DNAzymes、特にRNA切断DNAzymesは、バイオセンシングアプリケーションについて広く研究されてきました。6,10,11 RNA切断DNAザイムセンサーは、金属イオン、12-16の低分子、17,18の細菌性病原体5,19-21、および癌細胞を検出するために開発されました。22 標的誘導性RNA切断DNAzymeの広範な利用可能性を考えると、DNAzymeを利用するアッセイは、多様な分析物を検出するために拡張できる可能性があります。
Ureeaseは、尿素をアンモニアに加水分解する能力のために選択され、その結果、pHが上昇します。また、ウレアーゼは非常に効率的で安定しており、他の生体分子との結合に適しています。したがって、RNA切断DNAzymeとウレアーゼのコンジュゲートにより、他のターゲットの検出にリトマス試験を使用できると仮定しました。5
RNA切断DNAzymeの作用は、DNAzyme-ウレアーゼ結合体で固定化された磁気ビーズの使用を通じて、ウレアーゼ媒介性のpH上昇に中継されます。調査中のDNAzymeの活性は大腸菌に厳密に依存しているため、試験溶液中にこの細菌が存在すると、磁気ビーズから溶液にウレアーゼが放出され、その後、pH感受性色素を含むレポーター溶液中で尿素を加水分解するために使用されます。この手順の最終結果は、染料またはpHペーパーによって便利に報告できる色の変化です。

<table><tbody><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム(NaOH)ペレット</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>AMRESCO</td><td>0588尿</td><td></td></tr><tr><td>素</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)溶液</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>バイオショップカナダ株式会社</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>バイオショップカナダ</td><td>BRO777</td><td></td></tr>キシ<tr><td>レンシアノールFF</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10%ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Bioshopカナダ株式会社</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>塩酸(HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (II) 六水和物</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン トリホスパフテ (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム三水和物 (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>市販アルコール</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチレンエチレンジアミン (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% 過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>スクシンイミジル 4-(N-maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0.04% フェノール レッド</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 ポリヌクレオチド キナーゼ反応バッファー</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA リガーゼ反応バッファー</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ (5 U/&#956;l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Broth</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucleotide kinase (10 U/&#956;l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>ガラス板</td><td>CBS科学</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>0.75mm厚スペーサー</td><td>CBS科学</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルコーム</td><td>CBS科学</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>UVランプ</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計(NanoVue)</td><td>GEヘルスケア</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>金属板</td><td>CBS科学</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>VWR インターナショナル</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>ゲル電気泳動装置</td><td>CBS 科学</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>VWR インターナショナル</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO 遠心フィルター</td><td>EMD ミリポア</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>磁気ビーズ (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>磁気分離ラック</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター (0.22 &#956;m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 培養チューブ</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 超音波洗浄機</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>カメラ (Canon Powershot G11)</td> <td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

リトマス試験を用いて細菌の比色検出

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

ポイントオブケアやフィールドアプリケーションのための特定の病原体を検出するために使用できる、単純でありながら効果的な方法に対する需要が高まっています。このような方法は、ユーザーフレンドリーで、専門家と非専門家の両方が簡単に解釈できる信頼性の高い結果を生成する必要があります。pHのリトマス試験は、簡単な色の変化によって試験サンプルのpHを報告するため、簡単、迅速、効果的です。私たちは、細菌検出のためのリトマス試験を活用するためのアプローチを開発しました。この手法は、細菌特異的なRNA切断DNAzymeを利用して、目的の細菌を認識することと、ウレアーゼの活性を制御するメカニズムを提供することという2つの機能を達成します。DNAzyme-ウレアーゼコンジュゲートで固定化された磁気ビーズを使用することで、試験サンプル中の細菌の存在がビーズから溶液へのウレアーゼの放出に伝達されます。放出されたウレアーゼは、尿素をアンモニアに加水分解するために試験溶液に移され、その結果、従来のリトマス試験紙を使用して視覚化できるpHの上昇がもたらされます。

細菌のリトマス試験の原理は、図1で説明されたテストは、3つの重要な材料使用しています。特定の細菌、ウレアーゼおよび磁気ビーズによって活性化されるRNA切断DNAザイムを。 DNAザイムは、目的の細菌の高度に特異的な検出を達成するために、分子認識要素として使用されます。ウレアーゼおよび磁気ビーズをDNAザイムのRNA切断活性のシグナル伝達を達成するために使用されます。これは、ウレアーゼDNAザイムコンジュゲートを含む磁気ビーズを作成することを含みます。標的細菌の存在下で、DNAザイム切断のRNA結合。このアクションは、磁気ビーズからのウレアーゼの解離を生じさせます。放出ウレアーゼが簡単磁気ビーズから分離し、尿素およびpH感受性色素を含有するレポーター溶液の色変化を生成するために使用することができます。ウレアーゼは、cをトリガのpHの増加を伴う、アンモニアに尿素を加水分解する色素のolor変化。 図2は、...

RNA切断DNAzyme、ウレアーゼ、および磁気ビーズを利用した修正リトマス試験を使用して、大腸菌の比色検出のためのプロトコルを記述します。

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

本実験の全体的な目的は、細菌検出のための簡便な改良リトマス試験を実証することです。この手法では、E.coliによって活性化されるRNA切断DNA酵素をウレアーゼベースの信号伝達プラットフォームと結合させ、E.coliに反応して色変化を生成させる方法について説明します。この技術の主な2つの利点は、試験の簡便さと、他の分析物応答性RNA切断DNA酵素への適用可能性です。本手順の実演は、マクマスター大学のYingfu Li博士の研究室に所属する大学院生のSeperh ManchehryとDingran Changが行います。テキストのプロトコルに従って試薬とバッファーを調製した後、1 mgのSMCCを676 µLのDMSOに溶解して、サクシニミジル-4-シクロヘキサン-1-カルボキサート（SMCC）のストック溶液を調製します。ボルテックスミキサーで撹拌し、使用時まで氷上に置いてください。1 mgのウレアーゼを1 mLの1x PBSに溶解し、使用時まで氷上に保持します。ウレアーゼDNA（UrDNA）を合成するために、2.5 mLマイクロ遠心チューブに100 µM LD1を10 µL加えます。次に、2回蒸留水を140 µLと10x PBSを40 µL加え、ボルテックスで撹拌します。次に、SMCCストック液 80.5 µL と DMSO 159.5 µL を加えます。その後、再度ボルテックスし、ベンチトップ遠心機を用いて短時間遠心します。反応液をインキュベーターまたはヒートブロックを用いて 37 °C で 60 分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブに200 µLの1x PBS、60 µLの3 M 酢酸ナトリウム、および1.5 mLの冷100% ethanolを加えてください。ボルテックスで混合し、反応液を-20 °Cで30分間インキュベートします。その後、溶液を20,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。次に、上清を除去し、ペレットを真空状態で乾燥させます。乾燥させたペレットに400 µLのウレアーゼストック溶液を加え、室温で5時間インキュベートします。粗結合物の200 µLを、事前に洗浄した分画分子量100,000の遠心ろ過カラムに移します。カラムを14,000 ×gで5分間遠心分離します。残りの200 µLの粗コンジュゲートをカラムに移し、14,000 ×gで5分間遠心分離します。その後、カラムを取り出し、新しい2 mLマイクロফিউージ回収チューブに逆さまに設置します。逆さまにしたカラムとチューブを 1,000 ×g で2分間遠心分離します。回収チューブを取り出した後、1x PBS を 30 µL 遠心カラムに加え、メンブレンを洗浄してコンジュゲートをさらに回収します。再びカラムを逆さまにし、回収チューブに戻します。カラムを1,000 ×gで2分間遠心分離します。カラムを取り出し、廃棄してください。UrDNAは使用まで4 °Cで保存します。E.coli活性化RNA切断DNAザイム（EC1）およびUrDNAを磁気ビーズに固定するため、磁気ビーズストックを十分に混ぜ合わせ、ビーズ懸濁液100 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。次に、チューブをマグネットラックホルダーに設置し、ビーズを分離させます。上清をピペッティングで除去し、150 µLの結合バッファー（BB）をチューブに加えます。チューブをホルダーから取り出し、チューブを慎重にタッピングして、ビーズを均一な溶液に再懸濁させます。ビーズをBBに懸濁させた状態でBB洗浄をさらに2回繰り返した後、10 µM EC1を10 µL加えます。チューブをタッピングして慎重に混合します。溶液を緩やかに振盪しながら30分間インキュベートします。ビーズの凝集を防ぐため、2〜3分ごとにチューブを軽く叩いてください。次に、マイクロ遠心チューブを磁気ラックに戻してビーズを分離し、ピペッティングによって上清を除去します。次に、150 µLのBBを用いてビーズを3回洗浄します。洗浄完了後、ビーズを計150 µLのBBに懸濁させます。この溶液に15 µLのUrDNAを加え、サンプルを45 °Cで2分間加熱し、その後、溶液を室温まで冷却して2時間インキュベートします。マイクロ遠心チューブを再びマグネットラックに戻してビーズを分離し、ピペッティングによって上清を除去します。反応バッファー（RB）を 100 µL 加え、その後、チューブをマグネットラックから取り出してビーズを慎重に再懸濁させます。テキストのプロトコルに従って E.coli 細胞を調製した後、1.5 mL マイクロ遠心チューブに 100 µL の RB を加えてボルテックスし、予備洗浄を行います。次に、バッファーを廃棄します。洗浄済みのチューブに組み立て済みの EC1 を 15 µL 加え、チューブをマグネットラックに置いて上清を吸引します。ラックからチューブを取り出し、RBを100 µL加え、磁性ビーズを慎重に再懸濁させます。RBを用いてビーズをさらに2回洗浄し、RBを除去した後、E.coliサンプル10 µLをチューブに加え、チューブをタッピングして内容物を穏やかに混合します。その後、室温で1時間反応させます。インキュベーション後、90 µLの二回蒸留水を加え、チューブをマグネットラックに置きます。約3分間の磁気分離の後、上清85 µLを慎重に0.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。磁気ビーズを吸い込まないよう、溶液を慎重にピペッティングすることが非常に重要です。これらのビーズにはウレアーゼが充填されており、偽陽性信号を生成します。0.04% Phenol redを15 µLと基質溶液を100 µL添加します。その後、特定の時間間隔で写真を撮影し、色の変化を記録します。リトマス試験の開始時の色は、溶液のpHが5.5未満であることを示す黄色でなければなりません。必要に応じて、リトマス試験の開始時のpHは、pH 5の1 millimolar 酢酸ナトリウム緩衝液などの弱緩衝液を用いて調整することが可能です。この図は、DNAzymeとしてE.coli活性化RNA切断DNAzyme EC1を、pH指示薬としてフェノールレッドを用いた細菌リトマス試験の結果を示しています。E.coli不在時に色変化が見られないことから、EC1は極めて特異性が高く、他の細菌に対しては最小限の活性しか示さないことがわかります。色変化の程度は、DNAzyme活性化ステップで使用したE.coli細胞数と、尿素加水分解ステップに割り当てた時間の両方に依存します。E.coli細胞数が多いほど色変化は強く現れ、尿素加水分解の時間を長くすることで、より少数の細胞を検出することが可能になります。このグラフは、ハンドヘルドpHメーターを用いてモニタリングしたpHの変化を示しています。10⁷個のE.coliが存在することで、10分以内にpHが3ユニット緩やかに上昇しました。対照的に、E.coliが存在しない場合は、同一条件下で検出可能なpH変化は見られませんでした。この手技を習得すれば、適切に実施することで2時間で完了できます。本手順を行う際は、ウレアーゼの活性が非常に高く、洗浄不十分やコンタミネーションが偽陽性に繋がることに留意することが重要です。本手順に習得した後、環境水の水質検査など、より実用的で関連性の高い条件下でのE.coliの検出にこの方法を適用できます。このビデオを視聴することで、E.coli検査に簡単なリトマス試験を活用する方法について十分な理解を深めることができます。この試験は、極めて危険な病原性E.coliの検出に使用できることを忘れないでください。病原性細菌の試験を行う前に、バイオセーフティトレーニングを受ける必要があります。

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リトマス試験を用いて細菌の比色検出

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