リトマス試験を用いて細菌の比色検出

この実験の全体的な目標は、細菌検出のための単純な修正リトマス試験紙を実証することです。この方法では、大腸菌が活性化したRNA切断DNA酵素をウレアーゼベースのシグナルトランスダクションプラットフォームと組み合わせて、大腸菌に応答して色の変化を生成する方法を説明しています。この手法の2つの主な利点は、検査の容易さと、他の分析物応答性RNA切断DNA酵素への適用性です。

この手順を実演するのは、マクマスター大学のYingfu Li博士の研究室の大学院生であるSeperh Manchehry氏とDingran Chang氏です。テキストプロトコルに従って試薬とバッファーを調製した後、1ミリグラムのSMCCを676マイクロリットルのDMSOに溶解することにより、スクシンイミジル4-シクロヘキサン-1-カルボン酸(SMCC)のストック溶液を調製します。渦を巻いて、使用するまで氷の上に置きます。

1ミリグラムのウレアーゼを1x PBSのミリリットルに溶かし、使用するまで氷の上に置きます。ウレアーゼDNA(UrDNA)を合成するには、100マイクロモルのLD1を10マイクロリットルのLD1を2.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに加えます。次に、140マイクロリットルの二重蒸留水と40マイクロリットルの10x PBSとボルテックスを追加します。

次に、SMCCストック80.5マイクロリットルとDMSO159.5マイクロリットルを追加します。次に、再びボルテックスし、卓上遠心分離機を使用して短時間回転させます。反応を摂氏37度でインキュベーターまたはヒートブロックで60分間インキュベー

インキュベーション後、200マイクロリットルの1x PBS、60マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウム、および1.5ミリリットルの冷100%エタノールをチューブに加えます。ボルテックスで混合し、マイナス20°Cで反応液を30分間インキュベートします。溶液を20, 000倍g、摂氏4度で20分間遠心分離します。

次に、上清を取り除き、ペレットを真空下で乾燥させます。乾燥ペレットに、400マイクロリットルのウレアーゼストックを加え、室温で5時間インキュベートします。200マイクロリットルの粗結合体を、事前に洗浄した100、000分子量カットオフ遠心フィルターカラムに移します。

カラムを14, 000倍gで5分間遠心分離します。残りの200マイクロリットルの粗結合体をカラムに移し、14, 000倍gで5分間遠心分離します。次に、カラムを取り外し、新しい2ミリリットルのマイクロフュージ収集チューブに逆さまに置きます。

逆さにしたカラムとチューブを 1, 000 倍 g で 2 分間遠心分離します。コレクションチューブを取り外した後、遠心カラムに30マイクロリットルの1x PBSを加えてメンブレンを洗浄し、コンジュゲートをさらに回収します。カラムを再度反転させ、収集チューブに戻します。

カラムを1, 000倍gで2分間遠心分離します。カラムを取り外して廃棄します。UrDNAは使用するまで摂氏4度で保管してください。

大腸菌で活性化されたRNA切断DNAzyme、またはEC1、およびUrDNAを磁気ビーズ上に組み立てるには、磁気ビーズストックをよく混合し、100マイクロリットルのビーズ懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。次に、チューブを磁気ラックホルダーに置き、ビーズを分離します。ピペッティングで上清を取り除き、150マイクロリットルの結合緩衝液(BB)をチューブに加えます。

ホルダーからチューブを取り外し、チューブを慎重に軽くたたいて、ビーズを均質な溶液に再懸濁します。BBで懸濁液中のビーズでBB洗浄をさらに2回繰り返した後、10マイクロリットルの10マイクロモルEC1を追加します。チューブを軽くたたいて慎重に混ぜます。

溶液を30分間軽く振とうしながらインキュベートします。ビーズの凝集を避けるために、2〜3分ごとにチューブを軽くたたきます。次に、マイクロチューブを磁気ラックに戻し、ビーズを分離し、ピペッティングで上清を取り除きます。

次に、150マイクロリットルのBBを使用してビーズを3回洗います。洗浄が完了したら、この溶液 BB.To 合計150マイクロリットルのビーズにビーズを懸濁し、15マイクロリットルのUrDNAを加えてサンプルを摂氏45度で2分間加熱した後、溶液を室温まで冷却して2時間インキュベートします。マイクロフュージチューブを磁気ラックに戻し、ビーズを分離し、ピペッティングで上清を取り除きます。

100マイクロリットルの反応バッファー(RB)を追加し、チューブを磁気ラックから取り外し、ビーズを慎重に再懸濁します。テキストプロトコルに従って大腸菌細胞を調製した後、100マイクロリットルのRBを加えてボルテックスすることにより、1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブを予備洗浄します。次に、バッファーを破棄します。15マイクロリットルの組み立てたEC1を洗浄したチューブに加え、チューブを磁気ラックに置き、上清を吸引します。

チューブをラックから取り外し、100マイクロリットルのRBを追加し、磁気ビーズを慎重に再懸濁します。RBを使用してビーズをさらに2回洗浄し、RBを取り除いた後、チューブに10マイクロリットルの大腸菌サンプルを追加し、チューブを軽くたたいて内容物を穏やかに混合します。その後、反応液を室温で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、90マイクロリットルの二重蒸留水を加え、チューブを磁気ラックに置きます。約3分間の磁気分離の後、上清85マイクロリットルを0.5ミリリットルのマイクロチューブに慎重に移します。溶液を磁気ビーズを一切取らずに慎重にピペットでピペット

これらのビーズにはウレアーゼが充填されており、偽陽性のシグナルを生成します。0.04%フェノールレッド15マイクロリットルと100マイクロリットルの基質溶液を追加します。次に、特定の時間間隔で写真を撮り、色の変化を記録します。

リトマス試験の開始色は、溶液のpHが5.5未満であることを反映して、黄色である必要があります。必要に応じて、リトマス試験の開始pHは、pH 5の1ミリモル酢酸ナトリウム緩衝液などの弱い緩衝液で調整できます。この図は、大腸菌で活性化されたRNA切断DNAzyme EC1をDNAzymeに、フェノールレッドをpH指示薬として用いた細菌リトマス試験の結果を示しています。

大腸菌の不在下で色の変化がないことからもわかるように、EC1は非常に特異的であり、他の細菌に対して最小限の活性を示します。色の変化の深さは、DNAzyme 活性化ステップで使用される大腸菌細胞の数と、尿素加水分解ステップに許容される時間の両方に依存します。大腸菌細胞が多いほど色の変化が強くなり、尿素加水分解の時間が長いほど、検出できる細胞の数が少なく

このグラフは、ハンドヘルドpHメーターを使用してモニターされたpH変化を示しています。7つの大腸菌細胞に10個が存在すると、10分以内にpHが3単位徐々に上昇しました。対照的に、大腸菌の不在は、同じ条件で検出可能なpH変化を引き起こさなかった。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。この手順を試みる際には、ウレアーゼは非常に活性があり、洗浄不良や汚染は偽陽性につながることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、この方法を実行して、環境水質の試験など、より関連性の高い条件で大腸菌を試験することができます。

このビデオを見た後、大腸菌検査のための簡単なリトマス試験紙を利用する方法についてよく理解しているはずです。この検査は、非常に危険な病原性大腸菌を検出するために使用できることを忘れないでください。病原菌の検査を行う前に、バイオセーフティーのトレーニングを受ける必要があります。