リトマス試験を用いて細菌の比色検出

本実験の全体的な目的は、細菌検出のための簡便な改良リトマス試験を実証することです。この手法では、E.coliによって活性化されるRNA切断DNA酵素をウレアーゼベースの信号伝達プラットフォームと結合させ、E.coliに反応して色変化を生成させる方法について説明します。この技術の主な2つの利点は、試験の簡便さと、他の分析物応答性RNA切断DNA酵素への適用可能性です。

本手順の実演は、マクマスター大学のYingfu Li博士の研究室に所属する大学院生のSeperh ManchehryとDingran Changが行います。テキストのプロトコルに従って試薬とバッファーを調製した後、1 mgのSMCCを676 µLのDMSOに溶解して、サクシニミジル-4-シクロヘキサン-1-カルボキサート（SMCC）のストック溶液を調製します。ボルテックスミキサーで撹拌し、使用時まで氷上に置いてください。

1 mgのウレアーゼを1 mLの1x PBSに溶解し、使用時まで氷上に保持します。ウレアーゼDNA（UrDNA）を合成するために、2.5 mLマイクロ遠心チューブに100 µM LD1を10 µL加えます。次に、2回蒸留水を140 µLと10x PBSを40 µL加え、ボルテックスで撹拌します。

次に、SMCCストック液 80.5 µL と DMSO 159.5 µL を加えます。その後、再度ボルテックスし、ベンチトップ遠心機を用いて短時間遠心します。反応液をインキュベーターまたはヒートブロックを用いて 37 °C で 60 分間インキュベートします。

インキュベーション後、チューブに200 µLの1x PBS、60 µLの3 M 酢酸ナトリウム、および1.5 mLの冷100% ethanolを加えてください。ボルテックスで混合し、反応液を-20 °Cで30分間インキュベートします。その後、溶液を20,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。

次に、上清を除去し、ペレットを真空状態で乾燥させます。乾燥させたペレットに400 µLのウレアーゼストック溶液を加え、室温で5時間インキュベートします。粗結合物の200 µLを、事前に洗浄した分画分子量100,000の遠心ろ過カラムに移します。

カラムを14,000 ×gで5分間遠心分離します。残りの200 µLの粗コンジュゲートをカラムに移し、14,000 ×gで5分間遠心分離します。その後、カラムを取り出し、新しい2 mLマイクロফিউージ回収チューブに逆さまに設置します。

逆さまにしたカラムとチューブを 1,000 ×g で2分間遠心分離します。回収チューブを取り出した後、1x PBS を 30 µL 遠心カラムに加え、メンブレンを洗浄してコンジュゲートをさらに回収します。再びカラムを逆さまにし、回収チューブに戻します。

カラムを1,000 ×gで2分間遠心分離します。カラムを取り出し、廃棄してください。UrDNAは使用まで4 °Cで保存します。

E.coli活性化RNA切断DNAザイム（EC1）およびUrDNAを磁気ビーズに固定するため、磁気ビーズストックを十分に混ぜ合わせ、ビーズ懸濁液100 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。次に、チューブをマグネットラックホルダーに設置し、ビーズを分離させます。上清をピペッティングで除去し、150 µLの結合バッファー（BB）をチューブに加えます。

チューブをホルダーから取り出し、チューブを慎重にタッピングして、ビーズを均一な溶液に再懸濁させます。ビーズをBBに懸濁させた状態でBB洗浄をさらに2回繰り返した後、10 µM EC1を10 µL加えます。チューブをタッピングして慎重に混合します。

溶液を緩やかに振盪しながら30分間インキュベートします。ビーズの凝集を防ぐため、2〜3分ごとにチューブを軽く叩いてください。次に、マイクロ遠心チューブを磁気ラックに戻してビーズを分離し、ピペッティングによって上清を除去します。

次に、150 µLのBBを用いてビーズを3回洗浄します。洗浄完了後、ビーズを計150 µLのBBに懸濁させます。この溶液に15 µLのUrDNAを加え、サンプルを45 °Cで2分間加熱し、その後、溶液を室温まで冷却して2時間インキュベートします。マイクロ遠心チューブを再びマグネットラックに戻してビーズを分離し、ピペッティングによって上清を除去します。

反応バッファー（RB）を 100 µL 加え、その後、チューブをマグネットラックから取り出してビーズを慎重に再懸濁させます。テキストのプロトコルに従って E.coli 細胞を調製した後、1.5 mL マイクロ遠心チューブに 100 µL の RB を加えてボルテックスし、予備洗浄を行います。次に、バッファーを廃棄します。洗浄済みのチューブに組み立て済みの EC1 を 15 µL 加え、チューブをマグネットラックに置いて上清を吸引します。

ラックからチューブを取り出し、RBを100 µL加え、磁性ビーズを慎重に再懸濁させます。RBを用いてビーズをさらに2回洗浄し、RBを除去した後、E.coliサンプル10 µLをチューブに加え、チューブをタッピングして内容物を穏やかに混合します。その後、室温で1時間反応させます。

インキュベーション後、90 µLの二回蒸留水を加え、チューブをマグネットラックに置きます。約3分間の磁気分離の後、上清85 µLを慎重に0.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。磁気ビーズを吸い込まないよう、溶液を慎重にピペッティングすることが非常に重要です。

これらのビーズにはウレアーゼが充填されており、偽陽性信号を生成します。0.04% Phenol redを15 µLと基質溶液を100 µL添加します。その後、特定の時間間隔で写真を撮影し、色の変化を記録します。

リトマス試験の開始時の色は、溶液のpHが5.5未満であることを示す黄色でなければなりません。必要に応じて、リトマス試験の開始時のpHは、pH 5の1 millimolar 酢酸ナトリウム緩衝液などの弱緩衝液を用いて調整することが可能です。この図は、DNAzymeとしてE.coli活性化RNA切断DNAzyme EC1を、pH指示薬としてフェノールレッドを用いた細菌リトマス試験の結果を示しています。

E.coli不在時に色変化が見られないことから、EC1は極めて特異性が高く、他の細菌に対しては最小限の活性しか示さないことがわかります。色変化の程度は、DNAzyme活性化ステップで使用したE.coli細胞数と、尿素加水分解ステップに割り当てた時間の両方に依存します。E.coli細胞数が多いほど色変化は強く現れ、尿素加水分解の時間を長くすることで、より少数の細胞を検出することが可能になります。

このグラフは、ハンドヘルドpHメーターを用いてモニタリングしたpHの変化を示しています。10⁷個のE.coliが存在することで、10分以内にpHが3ユニット緩やかに上昇しました。対照的に、E.coliが存在しない場合は、同一条件下で検出可能なpH変化は見られませんでした。

この手技を習得すれば、適切に実施することで2時間で完了できます。本手順を行う際は、ウレアーゼの活性が非常に高く、洗浄不十分やコンタミネーションが偽陽性に繋がることに留意することが重要です。本手順に習得した後、環境水の水質検査など、より実用的で関連性の高い条件下でのE.coliの検出にこの方法を適用できます。

このビデオを視聴することで、E.coli検査に簡単なリトマス試験を活用する方法について十分な理解を深めることができます。この試験は、極めて危険な病原性E.coliの検出に使用できることを忘れないでください。病原性細菌の試験を行う前に、バイオセーフティトレーニングを受ける必要があります。