アン

この実験の全体的な目標は、活性化T細胞との相互作用による内皮細胞の完全性と透過性への影響を研究することです。この方法は、T細胞と内皮細胞との間の直接的な相互作用が血液脳関門の完全性と透過性にどのように影響するかなど、神経免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、T細胞と内皮細胞の相互作用を標的とした調節によるバリア機能の自動リアルタイム評価を可能にすることです。

この技術の意味は、自己免疫性中枢神経系疾患の治療にまで及び、T細胞を介した血液脳関門の破壊、そのような疾患の病因への重要なステップについての洞察を提供します。この方法は、EAE中の海洋血液脳関門の特性に焦点を当てています。しかし、赤血球またはヒトの血液脳関門モデルや、他の自己免疫性中枢神経系疾患の研究にも適用できます。

一般に、この方法に不慣れな人は、初代内皮細胞培養とT細胞活性化の組み合わせの最適なタイミングが困難になる可能性があるため、苦労する可能性があります。この手法を開発したのは、多発性硬化症の動物モデルであるEAEの血液脳関門特性に対するT細胞の活性化レベルの違いを調べ始めたときでした。T細胞と内皮細胞の共培養のセットアップは習得が困難であり、ウェル間のTの初期変動がその後の結果の誤った表現を必要とする可能性があるため、この方法を視覚的に実証することが重要です。

この手順を開始するには、MBMEC分離後5日目に、インサートごとに80マイクロリットルのMBMECコーティング溶液で透過性インサートをプレコートします。摂氏37度、二酸化炭素5%で3時間インキュベートします。インサートからMBMECコーティング液を取り除いた後、各ウェルに室温PBSを2ミリリットル加えてMBMECを洗浄し、1分後に吸引した後、この手順をもう一度繰り返します。

次に、0.05%トリプシンEDTAをウェルあたり300マイクロリットルで添加し、5〜10分間インキュベートします。その後、2ミリリットルのMBMEC培地を各ウェルに追加して、トリプシン化を停止します。次に、収集した細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、サンプルを700倍のgで摂氏4度で8分間遠心分離します。

8分後、上清を捨て、ピューロマイシンを含まないMBMEC培地1ミリリットルに細胞を再懸濁します。.細胞を数えるには、0.04%トリパンブルーの90マイクロリットルを混合します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を使用して、ガラスカバーと血球計算盤との間の混合物の10マイクロリットルをピペットで掴みます。

次に、挿入ごとに4番目のセルに10の2倍を譲ります。810マイクロリットルのMBMEC培地を各ウェルの下部コンパートメントに追加し、TEER測定を続行する準備ができるまで、インサート付きのプレートをインキュベーターに置きます。CD4陽性T細胞を刺激するには、丸底の96ウェルプレートに精製した抗マウスCD3抗体を所望の最終濃度で37°Cでプレコートします。

T細胞を単離した後、プレコートプレートをPBSで2回洗浄します。次に、精製した抗CD28抗体を単離したT細胞に所望の最終濃度で加え、よく混合します。その後、T細胞をセービングし、摂氏37度で2〜3日間放置します。

TEER測定を設定するには、TEER機器の24ウェルモジュールを層流フードに配置します。蓋を取り外し、鉗子を使用してMBMECの入ったインサートを装置内に置きます。次に、モジュールウェルの下部コンパートメントに新鮮な培地の810マイクロリットルをピペットで移動し、インサートとモジュールウェルの壁との間に慎重に追加します。

その後、蓋を閉め、器具をインキュベーターに入れます。機器をコンピューターに接続します。次に、機器コントローラーの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。

ポップアップウィンドウで、[新しい測定]を選択します[TERを表示]と[Cclを表示]ボックスを表示します。次に、スタートを押します。最初の測定が完了したら、[結果]タブで[すべてのウェルをチェック]を選択して、すべてのTEERおよびCcl値を確認します。

次に、ファイルを保存します。次に、Cclが安定で1平方センチメートルあたり1マイクロファラッド未満で、TEERが最大レベルに達したときに、MBMECをT細胞と共培養する時点を選択します。TEERとCclの絶対値を慎重に検査し、MBMECが十分にコンフルエントな単層を発達させていない井戸のチェックを外して除外します。

ウェルを右クリックして、新しい平均ウェルにウェルを追加を選択して、残りのウェルをグループ化します」ポップアップウィンドウで名前を付け、グループ化するすべての個々のウェルに対して同じことを行います。次に、すべての平均ウェルをチェックして、共培養前にすべてのウェルが同じ初期条件を持っていることを確認します。[実験] タブで、一時停止を押します。

機器を外し、インキュベーターから取り出します。次に、層流フードの蓋を取り外します。その後、上部ウェルコンパートメントのインサートから培地の一部を取り出します。

150 μLの培地を慎重にピペッティングして、MBMECにT細胞を添加します。次に、機器を再接続し、測定の再開を押します。24時間後、実験タブの停止を押してファイルを保存します。

ここに示されているのは、MBMEC単離の5日後のPECAM-1およびCldn-5の免疫蛍光染色における紡錘形の形態です。以下は、T細胞を添加する前の個々のウェルのグループ化前後のTEERおよびCclの値です。この井戸のMBMECは他の井戸ほど高いTEERを発達させていないため、青い曲線は実験には使用されていません。

この実験では、マーク35〜55の特異的なCD4陽性T細胞を抗原特異的に5日間刺激しました。ナイーブT細胞および炎症誘発性サイトカイン、インターフェロンγおよびTNF-αは、それぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして機能した。ここでは、T細胞は同量の抗CD3抗体と抗CD28抗体によって刺激され、3日間培養されたものは、わずか2日間培養されたT細胞と比較して、バリア破壊の傾向が高かった。

今回の結果は、刺激されたT細胞が上清ではなく刺激されたことがMBMECに大きな損傷を与えたことを示しており、T細胞とMBMECとの直接的な接触がバリア破壊に重要であることを示しています。一方、T細胞培養にグランザイムb阻害剤2を添加すると、MBMECの完全性が大幅に回復し、MBMECの損傷とその後のTEERの減少を引き起こす重要なプレーヤーとして細胞溶解分子が指摘されました。この手順を試行する際には、T細胞と内皮細胞の共培養を設定するための正しい時点を選択することを忘れないでください。

この手順に続いて、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、確率エッセイなどの他のエッセイを使用できます。この相互作用はタイトジャンクション分子の発現透過性やT細胞のトランスマイグレーションの程度にどのように影響しますか?その開発後、この技術は、神経免疫学の分野の研究者がマウスの中枢神経系の自己免疫疾患を調査する道を開きました。

このビデオを見れば、血液脳関門の完全性と透過性に関して、活性化T細胞と内皮細胞との間の直接的な影響を評価する方法について、よく理解できるはずです。