Name: アンインビトロインピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶインピーダンス分光法による血液脳関門モデル。活性化T細胞と内皮細胞の相互作用がバリア機能に与える影響をリアルタイムで評価し、自己免疫性中枢神経系疾患の病態解明と治療法開発に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、TEERの測定に関する有用な議論のためのアニカEngbers及びそれらの優れた技術サポートのためのフランク・クルトと博士はマーカス・シェーファー（nanoAnalytics GmbH社）に感謝しています。この作品は、ドイツ学術協会（DFG）によってサポートされていました、HWとLKへSFB1009プロジェクトA03、CRC TR128は、A08を投影します。 LKにZ1とB01 LKとHWに、臨床研究のための学際センター（ミュンスターの医学部）認可番号KL2 / 14分の2015。

動物のケアのためのドイツのガイドラインに従って、すべての実験のために、マウスを交配したとミュンスター大学の中央動物施設における特定の病原体を含まない条件下で維持しました。全ての実験は、動物実験倫理委員会のガイドラインに従って行われ、ノルトライン=ヴェストファーレン州、ドイツ（LANUV、AZ 84-02.05.20.12.217）の地方当局によって承認されました。 1. MBMEC単離および培養注：以前に以下のように変更して詳細14に記載されているようにMBMECsを分離： <ol><li> CO 2吸入によって20成人（6〜8週齢）C57BL / 6マウスを生け贄に捧げる、心と呼吸停止を確認することによって彼らの死を確認します。 </li><li> 70％エタノールでマウスをすすぎ、はさみを使用してそれを刎ねます。ピンセットやハサミを使って頭皮を削除します。大後頭孔から出発し、頭蓋骨の左側と右側の切開を行います。その尾側とTAKから頭蓋骨を持ち上げ鉗子で脳を電子。 </li><li>層流フードの下では、唯一の皮質を保ち、ペトリ皿に脳を置き、脳幹、小脳、及び視床を除去するために滅菌ピンセットを使用しています。 注：顕微鏡の使用は、これらのステップのいずれかのために必要ではありません。 </li><li>無菌ウェスタンブロッティング一枚の紙の上に皮質を置き、髄膜が見えなくなるまでピンセットで軽く転がしていません。 </li><li> （プロトコル14以下）機械的および酵素消化した後、長い間、滅菌針と5ミリリットルのプランジャーを使用して密度勾配から内皮細胞を収集します。内皮細胞は、赤血球と赤いリング上記の濁った層として表示されます。新しい50ミリリットルの遠心分離管に、この層20〜25ミリリットル転送。 DMEMでチューブをトップアップ。 </li><li>洗濯14 2ラウンドの後、ピューロマイシンを含むMBMEC培地（4 / mlの）の6ミリリットル中に細胞を再懸濁し、24ウェルプレートの6コーティングされたウェル上にそれらをシード。組織でそれらを残します3日間（ここでは上から「インキュベータ」という）37℃、5％CO 2で培養インキュベーター。 注：MBMEC塗布液の詳細については、 材料表を参照してください。 </li><li>ピューロマイシンを含まない新鮮なMBMEC媒体の各ウェルに1ミリリットルを追加することで、メディアを変更します。 2日以上のために戻って37℃、5％CO 2のプレートを置きます。 </li></ol> 2.収穫MBMECs <ol><li> MBMEC分離後の5日目、MBMECコーティング溶液でプレコート透過性インサートは：3時間インサートあたりの溶液80μlを添加し、37℃でそれらを残す、5％CO 2。 </li><li>慎重にコーティング溶液をピペットし、30分間のインサートの空気乾燥をしましょう。培地を洗浄するためにMBMECsを使用して、プレートの各ウェルに室温（RT）PBSの2ミリリットルを追加します。この手順を繰り返します。 0.05％トリプシン-EDTA（ウェルあたり300μl）を加え、5〜10分間インキュベーターでプレートを残します。 </li><li>停止するために各ウェルにMBMEC培地2mlを追加トリプシン処理。 15ミリリットルの遠心分離管に採取した細胞を移し、4℃で8分間、700×gで、それらを遠心分離します。上清を捨て、ピューロマイシンなしMBMEC培地1mlに細胞を懸濁します。 </li><li>細胞を数えます。 0.04％トリパンブルー（細胞の10倍希釈）の90μlの10μlの細胞懸濁液を混ぜます。ピペットガラスカバーと細胞計数室（血球計数器）の間、この混合物10μl。チャンバー（N）のすべての4つの象限でのトリパンブルーを含まない細胞をカウントし、カウントした細胞（N &#39;）の平均数を決定し、次のように：N&#39; = N / 4。 </li><li> C = N 10 4は、血球計算板の寸法によって与えられ、10は、ステップ2.4からの希釈係数である「×10 4×10、次の式を用いて（10 6細胞/ ml）で細胞濃度を計算します。 </li><li>シードインサートあたり260μlの量の2×10 4個の細胞。各ウェルの下部コンパートメントにMBMEC媒体の810μLを追加。セクション4を続行する準備ができるまでインキュベーター中に挿入して、プレートを置きます。 注：上部と下部コンパートメントのためのボリュームが挿入に固有のものであり、全ての24ウェルフォーマットには対応していません。 </li></ol> 3. CD4 + T細胞の単離と刺激<ol><li> CD4 + T細胞の単離<ol><li> CO 2吸入によって（6〜8週齢）1成体マウスを犠牲にし、心臓や呼吸停止を確認することによって、その死を確認します。 </li><li>きれいな解剖ボード上の背中の上でマウスを置き、70％エタノールでそれを洗い流し;腹膜を開き、脾臓およびリンパ節（鼠径部、腋窩、上腕および子宮頸部）を除去し、滅菌ハサミやピンセットを使用します。最後に、氷上で5mlのPBSを含む15ミリリットルの遠心分離管に組織を移します。 </li><li>層流フードの下で、上に70μmのセルストレーナーで50ml遠心チューブに組織を含むPBSをデカントすることにより、組織を移します。均質化しますストレーナを介して1ミリリットルプランジャとそれを押すことによって組織。 </li><li> FACS緩衝液30 mlを加え、4℃で5分間、500×gでそれを遠心。上清を捨て、FACS緩衝液10mlに細胞を再懸濁。チューブにFACS緩衝液の別の20ミリリットルを追加し、40μmのセルストレーナーを介してサスペンションをフィルタリングします。 </li><li> 4℃で5分間、500×gでそれを遠心。上清を捨て、FACS緩衝液500μlの中に細胞を懸濁します。 </li><li> 、マウスCD4磁気マイクロビーズの20μl加えよく混ぜ、4℃で15分間インキュベートします。 FACS緩衝液25 mlを加え、4℃で5分間、500×gでそれを遠心。 </li><li>一方、磁石にLS分離カラムを配置し、FACS緩衝液3mlでそれをすすぎます。上清を捨て、FACS緩衝液3mlに細胞を再懸濁。 </li><li>列にセルを追加します。 FACS緩衝液3mlの3回でカラムを洗浄します。磁石から列を削除し、新しい15ミリリットルセントリの上に置きますfugationチューブ。 、FACS緩衝液5mlを加えることは、5分、4℃、500×gで列プランジャと遠心分離機で標識された細胞を洗い流します。 </li><li>上清を捨て、T細胞培地3mlに細胞を再懸濁。ウェル当たり100μlの培地で2.4および種子1×10 5細胞で説明したように細胞をカウントします。 </li></ol></li><li> CD4 + T細胞刺激<ol><li>ポリクローナルCD4 + T細胞刺激<ol><li>精製抗マウスCD3抗体でプレコート丸底96ウェルプレート（クローン145-2C11）を、PBS中で、所望の最終濃度。たとえば、を1μg/ mlのα-CD3でフルプレートをコートを事前にPBS 5mlで抗体（ストック濃度= 0.5 mg / mlで）を10μlを混合し、ボルテックスとにミックス50μlのを追加マルチチャンネルピペットで各ウェル。 </li><li> 3時間インキュベーターでプレートを残します。 T細胞を単離した後、PBSで2回予備コーティングされたプレートを洗浄します。 （クローン精製した抗CD28抗体を追加します。1μg/ mlの所望の最終濃度（ 例えば、）で単離されたT細胞の37.51）。よく混ぜます。 T細胞に接種し、2〜3日間インキュベーターでそれらを残します。 </li></ol></li><li>樹状細胞（DC）による抗原特異的CD4 + T細胞刺激 注：DCは、抗原提示細胞（APC）として使用される場合、これらの例外を除いて、T細胞の単離のためのプロトコルに従います。 <ol><li>脾臓を均質化する前に、0.5 mg / mlとなるようにPBS中のコラゲナーゼタイプIAの1ミリリットルでそれを注入し、15ミリリットルの遠心チューブに移します。 </li><li> 15分間37℃の水浴中でインキュベートします。 PBSで洗浄した後、FACS緩衝液中にペレットを再懸濁し、代わりにCD4マイクロビーズの、マウスのCD11c磁性マイクロビーズの20μlを添加します。 </li><li> MS分離カラムと適切なボリュームを使用：FACS緩衝液1mlでカラムをすすぎます。 FACS緩衝液1mlで再懸濁細胞およびFACS緩衝液1mlの3回カラムを洗浄。 </li><li>広告樹状細胞（ 例えば 、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）のaa 35-55 20時/ mlの）に選択のD抗原は、よく混ぜシード5×10 4細胞のT細胞培養培地100μl中あたり96ラウンドボトムよく。 </li><li> T細胞の単離のためのプロトコルに記載のように、最後に96丸底ウェルあたりのT細胞培養培地100μl中1×10 5 T細胞を加えます。 </li></ol></li><li> B細胞と抗原特異的CD4 + T細胞刺激 注：B細胞をAPCとして使用される場合、これらの例外を除いて、T細胞の単離のためのプロトコルに従います。 <ol><li> B細胞の抗原特異的（B細胞特異的にMOG 35-55を認識例えば、IgH遺伝子MOG（TH）マウス、）トランスジェニックマウスからの脾臓を使用してください。 </li><li> （TCR MOG（2D2）マウスから、例えば ）抗原特異的T細胞を使用してください。マウスCD19磁気マイクロビーズの代わりにCD4マイクロビーズの20μlを添加します。 </li><li> Bのセルに選択した抗原を追加します。lsが（ 例えば 、20μgの/ mlのMOG 35-55）は 、96丸底ウェルあたりのB細胞培養培地100μl中5×10 4個の細胞をよく混ぜ、種。 </li><li> T細胞の単離のためのプロトコルに記載されるように、96丸底ウェルあたりのT細胞培養培地100μl中1×10 5 T細胞を加えます。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4.設定とTEER測定を行います<ol><li>層流フードの下でTEER機器の24ウェルモジュールを配置します。ふたを外し、ピンセットを用いて、機器にMBMECsでインサートを配置します。 </li><li>モジュールウェルの下部コンパートメントに新鮮な培地810μLをピペット：インサートとよくモジュールの壁との間に慎重にそれを追加します。 </li><li>蓋を閉じ、インキュベーター内に配置してください。そのコンピュータに楽器を接続します。機器コントローラをオンにしてソフトウェアを開きます。 </li><li>ポップアップウィンドウで「新たな計測」を選択します。チェCK &#39;ショーTEER&#39;と &#39;ショーCCL」ボックス。その後、「開始」を押してください。最初の測定を完了した後、すべてのTEERとCCLの値を参照するには、「結果」タブで「すべてのウェルをチェック」を選択します。 </li><li> 「ファイル名 &#39;&gt;名前を付けて保存&gt;ファイル：ファイルを保存します。 注：TEERとCCLを連続的に自動化された方法で測定されたように、3〜5日の期間にわたってその値を監視します。 TEERの増加の欠如によって可視化されるように、細胞生存率は、次善のでない限り、培地を変更することは、必要ありません。 </li><li> CCLは安定であり、より低い1μF/ cm 2であり、TEERが最大レベルに達した時点をT細胞とする共培養MBMECsを選択します。 </li><li>慎重に絶対TEERとCCLの値を検査し、MBMECsは、このような井戸をオフにしてコンフルエントに十分な単層を発症していないいる井戸を除外します。 </li><li>グループ井戸の残り：よく上で右クリックし、「新しい平均のウェルにも追加」を選択します。ナムポップアップウィンドウでそれを電子。すべての個々のウェルをグループ化するために同じことを行います。 </li><li>それらのすべてが共培養する前に、同じ初期条件を持っていることを確認するために、すべての平均井戸を確認してください。いくつかの著しく異なる絶対TEER値を有するか、TEERが傾斜、または標準誤差が大きすぎる場合は、グループ化をやり直します。 注：井戸の最適なグループ分けは、実験群内および間の両方、TEER値の最小の変化を提供します。 </li><li> 「実験」タブを押して「一時停止」で、楽器を切断し、インキュベーターの外にそれを取ります。層流フードの下蓋を外します。 </li><li>所望のように、特定のサイトカイン、抗体または他の物質の有無にかかわらず、予備活性化および/またはナイーブT細胞を準備します。たとえば、次のように精製されたNA / LEラットを混在抗マウスIFN-γ抗体（クローンXGM1.2）準備されたTとTEER器具のウェルに20μg/ mlの細胞。 注：このようなグランザイムB阻害剤のような物質が使用される場合、それらはT細胞刺激の開始時にT細胞培養にdded： 例えば 、グランザイムB阻害剤II（Calbiochem社）をDMSO中に10μMの最終濃度で、単離されたT細胞と混合されます。詳細については、材料および装置を参照してください。 </li><li>インサートから培地（上部ウェルコンパートメント）の一部を削除します。（それはMBMEC単層を乱す可能性があるので、すべての媒体は避けるべきで除去） など 、慎重に150μlをピペット。 </li><li>慎重に2×10 5細胞/インサートを含む培地150μlのピペッティングすることによってMBMECsにT細胞を追加します。 注：前活性化T細胞を採取する場合、唯一のブラスト、トリパンブルーを含まない細胞をカウントします。 </li><li>蓋を閉じて、バックインキュベーターに配置してください。楽器を押す「リジューム測定 &#39;を再接続します。 24時間後「実験」タブで、を押して「停止」して、ファイル（ファイル]&gt; [保存]）を保存します。 </li></ol> 5.データのエクスポートと統計解析<ol><li>[ファイル]&gt; [エクスポート]を選択して、結果をエクスポートします。 </li><li>ポップアップウィンドウの「設定」タブで、「フィールド区切り文字」オプションの「桁区切り記号」オプションと「タブ」の「の.dot」を選択します。 </li><li> 「エクスポート結果」タブでは、ファイルに名前を付けるエクスポートするすべてのウェルをチェックし、「データを選択」オプションで「TEER」と「CCL」チェックボックスをオンにします。 </li><li>押して「エクスポートデータは、「エクスポートされたファイルを開き、スプレッドシートにデータをコピーします。 </li><li> （各によってソートされた各ラン（測定）のために与えられたTEERとCCLの値で、複製）エクスポートされたデータを正規化：100％の共培養前の最後の時点のTEERとCCL値を設定し、それに応じて他のすべての値を変更「100％」のランの相対動作し、。 </li><li>個々のウェルを使用し、各処置群について平均値の標準誤差を表示し、グラフを生成するために選択したソフトウェアに正規化されたデータをコピーします。 </li><li> P選択肢の統計ソフトウェアを使用して、多重比較のためのボンフェローニ補正で双方向ANOVA統計検定をerform。 </li></ol>

I. クズマノフ、A. M. ヘルマン、S.G. ミュート、H. ヴィンドル、L. クロッツは開示するものは何もありません。H.-J. Gallaは、自動セルモニターのメーカーであるnanoAnalytics GmbHの科学顧問です。

記載されたプロトコルのいくつかのステップが成功した実験のために不可欠です。初期MBMEC単離および培養の間、仕事を真菌胞子または細菌を細胞培養物の汚染を防止するために、可能な限り無菌条件下で行われることが重要です。 ECの純粋な培養物を得るためには、41,42（特に、周皮細胞）、他の細胞型ECの生存を可能にする最初の3日間、ピューロマイシンを含有する培地を使用することは推奨されないが。特別な注目に値するもう一つの重要なステップは、前活性化T細胞を追加するための正しい時点の同定です。 TEER測定MBMECsの最初の48時間の間、透過性インサート上で増殖し、互いの間のギャップを閉じます。それは安定した低レベル（周辺で0.6μF/ cm 2で）に達するまでしたがって、CCLは減少します。これは、コンフルエントEC単層の最初の兆候であるが、まだタイトな障壁の兆候ではありません。後にのみCCLは、TEERが増加し始めるない安定したレベルに達しています。 TJ複合体が完全に形成され、EC障壁が完全に密封されている場合、TEERが最大レベルに達します。この台地は、通常、3〜5日のEC...

3 -血液脳関門は、中枢神経系（CNS）1から全身循環を分離します。それは、細胞の自由な移動と水溶性の分子の拡散を抑制し、病原体および潜在的に有害な物質から脳を保護する物理的障壁を提供します。そのバリア機能に加えて、BBBは、神経組織の適切な機能を確実に脳実質に酸素や栄養素の配信を可能にします。 BBBの機能特性は、高度に専門性の高い電気部品は、その主要構成要素であると、その細胞および無細胞成分によって規制されています。 BBBの電気部品は、タイトジャンクション（TJ）錯体、開窓の欠如、非常に低いピノサイトーシスの活動、および恒久的に能動輸送機構が存在することを特徴とします。 BBBの他の成分EC基底膜、内皮を埋め込む周皮細胞、アストロサイトのエンドフィート=関連するパーenchymal基底膜はまた、BBB 2,4の開発、保守および機能に寄与- 6と、一緒にニューロンおよびミクログリアで、CNS 7を適切に機能可能に神経血管ユニット（NVU）、形成- 9。 このような神経変性、炎症や感染症などの神経疾患、種々のでは、BBBの機能が2,5,10損なわれています。 TJ複合体および分子輸送機構の調節不全は、BBBの透過性、白血球の血管外遊出、炎症および神経損傷の増加につながります。そのような病態生理学的条件下で、BBBの特性を研究するために、様々なインビトロ BBBモデルは9,11,12が確立されています。彼らは一緒に障壁の完全性、透過性だけでなく、輸送機構の変化に貴重な洞察を提供してきました。これらのモデルは、ヒト、マウス、ラット、ブタまたはBの内皮細胞を用いますヒツジの原点13から18; 25 -初代内皮細胞または細胞株は、モノカルチャーとして、あるいは一緒に生体内 19 でより密接にBBBを模倣するために、周皮細胞および/またはアストロサイトのいずれかで培養されます。近年では、経内皮電気抵抗（TEER）の測定は、内皮バリア特性26,27を評価するための広く受け入れられているツールとなっています。 TEERは、細胞単層を横切るイオンフラックスに対するインピーダンスを反映し、その減少が損なわ内皮障壁の完全性、したがって透過性の増大の敏感な尺度を提供します。 30 -様々なTEER測定システムは、上皮Voltohmmeter（EVOM）、電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）、リアルタイム細胞解析15,28を含む、開発されてきました。 TEERは、隣接するECの間のイオンフラックス（傍細胞経路）に対する抵抗性を反映し、に直接比例しています関門の完全性。インピーダンス分光法27,31においては、複素合計インピーダンス（Z）は、CCLを測定することによって、障壁の完全性についての追加情報を提供する、測定されます。 CCLは、細胞膜（経細胞経路）を介して容量性電流に関する：細胞層は、膜の両側での電荷分離、等価電気回路におけるコンデンサと同様に機能し、障壁の完全性に反比例します。透過性インサート上で成長させた場合には、ECが、付着増殖し、微多孔膜に広がります。これは、（それ自体がコンデンサのように作用する）のインサートのバックグラウンド容量性電流に抵抗し、その最低レベルに達するまでの容量の低下を招きます。これは、TJの確立隣接する電気部品との間のスペースからそのシールを複合体が続いています。これは、傍細胞経路を介してイオン流束を制限し、そしてそれがそのプラトーに達するまでTEERが増加します。炎症状態下で、しかし、endotheliアル障壁が侵害された：TJが破壊を取得複合体およびインサートの容量成分が再び上昇するとCCLが増加するにつれて、TEERは減少します。 私たちのTEERの測定は、自動化されたセル監視32システムを使用しています。それは、インピーダンス分光法の原理に従っており、その前のアプリケーションを拡張します。ここでは、免疫細胞と脳内皮の相互作用を含むバリア性の研究を可能にインビトロ BBBモデルを記述します。特に、T細胞を活性化します。 37 -このような病態生理学的状態は、多発性硬化症およびその動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎33のようなCNSの自己免疫疾患において観察されます。ここで、重要なステップは、BBBを横切る脳炎誘発性、ミエリン特異的T細胞の遊出があります。これは、それらが他の免疫細胞を動員し、私血管周囲空間と脳実質への参入、中にそれらの再活性化が続いていますdiate炎症およびその後の脱髄1,35,38。しかしながら、このようなT細胞と内皮細胞との相互作用の分子機構は、BBBの主な成分は、よく理解されていません。私たちのプロトコルは、このギャップを埋め、活性化T細胞との直接接触との複雑な相互作用の際に内皮細胞（ すなわち、障壁の完全性と透過性）に影響新たな洞察を与えることを目指しています。 ここで説明するプロトコルは、微多孔膜と通気性のインサート上の単層として成長した初代マウス脳微小血管内皮細胞を利用します。内皮細胞を、ポリクローナルまたは抗原特異的な様式で予備活性化することができるCD4 + T細胞と共培養されます。予め活性化とMBMECsの共培養ではなく、ナイーブT細胞TEERの低下やMBMEC機能障害およびバリア破壊の定量的な尺度を提供するCCLの増加を誘導します。技術非侵襲的である：それは、EC単層の主要な乱れを防ぐビルトインの代わりに箸電極を、使用しています。細胞マーカーを使用することなく、バリア機能を監視するために使用することができます。これは、自動化された方法で連続測定を行うと同時に、時間をかけて2バリアパラメータ（TEERとCCL）の独立した評価を可能にします。この方法はまた、別のT細胞活性化のレベルとのECのようなT細胞の効果を区別するのに十分な感度です。 これは、機能的アッセイの広い範囲で使用することができる：炎症プロセスに関与する種々のサイトカインおよび/またはケモカインはMBMECs及びT細胞の共培養物に添加することができます。 ECまたはT細胞側のいずれかの細胞接着分子に対するブロッキング抗体を使用することができます。およびT細胞活性化マーカーの、またはそれらの細胞傷害特性の阻害剤は、T細胞プライミングまたは電気部品との共培養の間に添加することができます。アッセイはまた、T細胞の遊出するのに便利ですこれはT細胞の添加前にMBMEC単層の完全性の品質管理としての役割を果たすことができるようにアッセイ。このすべてが、この方法EC単層の完全性に活性化T細胞の効果に焦点を当てて、in vitroで BBBを研究するための汎用性と信頼性の高いツールになります。これは、自己反応、脳炎誘発性T細胞がBBBを横断し、炎症および神経損傷を引き起こすMS、その動物モデルEAEなどの自己免疫疾患の病因にBBB破壊のメカニズムを理解するために特に重要です。

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>に含まれるもの: 24 ウェル セル モジュール、コントローラー、cellZscope ソフトウェア v2.2.2 を搭載した PC&nbsp;</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; ローター F21S-8x50y; MBMEC 単離</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td>用 <td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>T 細胞移動</td></tr>の分析用 <tr><td>FlowJo7.6.5 ソフトウェア</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td> T <td>細胞移動の分析用</td></tr><tr><td>Oak Ridge 遠心分離チューブ、PC</td><td>サーモフィッシャーScientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; MBMEC アイソレーション</td></tr><tr><td>トランズウェル メンブレン インサート用 - 細孔径 0.4 & マイクロ;m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>TEER測定用メインリードアウト</td></tr><tr><td>トランズウェルメンブレンインサート - 細孔サイズ3 & マイクロ;m</td><td>Corning</td><td>3472</td> は、<td>T細胞移行アッセイ前の品質管理としてTEER測定用</td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>平底; MBMEC培養</td></tr><tr><td>用 96ウェル細胞培養プレート</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>丸底; 免疫細胞培養用</td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>T細胞およびB細胞単離用; サポート樹</td></tr><tr><td>状細胞の分離のための</td>MACS LS<td>のコラムOctoMACSの分離器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td>; 細胞</tr><tr><td>の計数</td><td>のための</td>部屋<td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td></tr>を支えます <tr><td>細胞のこし器、70 & micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>免疫細胞単離用</td></tr><tr><td>セルストレーナー、40 & マイクロ;m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>免疫細胞単離</td></tr><tr><td>用 MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>免疫細胞単離用</td></tr><tr><td>MACS LS 分離カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>T細胞およびB細胞単離用</td></tr><tr><td>MACS MS分離カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>樹状細胞単離用</td></tr><tr><td>マウスCD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>CD4+ T細胞分離</td></tr><tr><td>マウスCD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>B細胞分離</td></tr><tr><td>マウスCD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>樹状細胞単離用</td></tr><tr><td>コラーゲンIV型</td><td>MBMECコーティング液用</td><td>シグマ</td><td>C5533</td></tr> フィ<tr><td>ブロネクチン</td><td>MBMECコーティング溶液</td>用ウシ<td>プラズマ</td><td>ΣF1141-5MG</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ2(CSL2)</td><td>MBMEC単離用</td><td>ワージントン</td><td>LS004176</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ディスパーゼ(C / D)</td><td>ロシュ</td><td>11097113001</td><td>MBMEC単離</td></tr>用<tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>MBMEC単離用</td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td>MBMEC単離用<td>シグマ</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>MBMEC 分離</td></tr>用 <tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>MBMEC 分離用</td></tr><tr><td>DMEM (+GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>MBMEC 分離および MBMEC 培養培地</td></tr>用 <tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>MBMEC 分離用 MBMEC 分離および MBMEC 培養培地</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>MBMEC および免疫細胞単離用</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>MBMEC 培地用</td></tr><tr><td>ヒト 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>MBMEC 培</td></tr><tr>地用<td>ピュロマイシン</td><td>Σ</td><td>P8833</td><td>MBMEC 培地用 ; 最初の 3 日間のみ</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>MBMECの収穫用</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IA 型</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>樹状細胞単離用</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td></td> <td>15250061</td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>免疫細胞単離用</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>T 細胞培養培地</td></tr><tr><td>X-VIVO 用15</td><td>ロンザ</td><td>BE04-418Q</td><td>光から保護します; B 細胞培養培地</td></tr><tr><td>用 &beta;-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>B 細胞培養培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン (100x Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>B 細胞培養培地</td></tr><tr><td>マウス MOG35&mdash;55 peptide</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>抗原特異的T細胞活性化</td></tr><tr><td>精製抗マウスCD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>クローン145-2C11;ポリクローナルT細胞活性化精製</td></tr><tr><td>NA/LE抗マウスCD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>クローン37.51;ポリクローナルT細胞活性化用</td></tr>組<tr><td>換えマウスIFN-&γ;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>T細胞トランスマイグレーションアッセイ</td></tr><tr><td>組換えマウスTNF-&α;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>clone XMG1.2; 推奨最終濃度: 20 & micro;g/ml</td></tr><tr><td>グランザイム B 阻害剤 II</td><td>カルバイオケム</td><td>368055</td><td>推奨最終濃度: 10 & micro;M</td></tr><tr><td>PE抗マウスCD4抗体</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>クローンRM4-4;T細胞移行の解析用</td></tr></tbody></table>

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：t細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

血液脳関門(BBB)の破壊は、多発性硬化症(MS)やその動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)などの自己免疫疾患の発症における重要なステップです。このプロセスは、活性化されたT細胞がBBBの主成分である脳内皮細胞(EC)を横切ることを特徴としています。しかし、このようなT細胞との相互作用が脳のEC機能に及ぼす影響については、ほとんどわかっていません。ここでは、T細胞との相互作用におけるマウス脳の初代微小血管EC(MBMEC)の機能とバリアの完全性を経時的に評価できるアッセイについて説明します。このアッセイは、経内皮電気抵抗(TEER)と細胞層容量(Ccl)の変化を測定することにより、EC単層の完全性と透過性を研究するための強力なツールであるインピーダンス細胞分光法を利用します。ECと直接接触すると、刺激されたがナイーブではないT細胞は、TEERの減少とCclの増加によって視覚化されるように、EC単層機能障害を誘発することができます。このアッセイは、EC単分子膜の完全性の変化を連続的かつ自動化された方法で記録します。刺激の強さやT細胞の活性化レベルの違いを区別するのに十分な感度を持ち、抗体、薬理学的試薬、サイトカインなどの幅広い物質を用いて、T細胞とECの相互作用を標的とした調節の結果を調べることができます。この技術は、in vitro T細胞移行アッセイにおけるECインテグリティの品質管理としても使用できます。これらのアプリケーションにより、生理学的および病態生理学的条件下でのBBB特性を研究するための汎用性の高いツールとなっています。

図1は、T細胞および内皮細胞間の相互作用を研究するために使用されるのin vitro BBBモデルの一般的な概要を提供します。実験は、次の3つの主要手順で構成されています。最初のステップは、脳皮質からの一次MBMECsの単離、および5日間彼らの文化です。それらは、細胞培養プレート中でコンフルエンスに達したとき、MBMECsをトリプシン処理し、次いで、TEER装置内に配置される透過性インサート上に再播種されます。 TEERとMBMECsのCCLは、連続的に測定し、3〜5日の期間にわたって監視されています。一方、T細胞は、単離された、刺激された（ステップ2）、および2〜5日、種類および刺激の強さのために培養されます。 CCLは、安定した低いレベルであり、TEERが最大レベルにあるときに、ステップ3において、T細胞に添加し、MBMECsと共培養しました。 TEERは、その高原のままである共培養のために、この時点を選択すると、成功のために不可欠です全体の測定。 T細胞は、電気部品への添加の時点で活性化の所望のレベルに到達するこ...

ここでは、インピーダンス細胞分光法を利用した血液脳関門のin vitroマウスモデルについて説明し、活性化T細胞との相互作用による内皮細胞の完全性と透過性への影響に焦点を当てています。

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

この実験の全体的な目標は、活性化T細胞との相互作用による内皮細胞の完全性と透過性への影響を研究することです。この方法は、T細胞と内皮細胞との間の直接的な相互作用が血液脳関門の完全性と透過性にどのように影響するかなど、神経免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、T細胞と内皮細胞の相互作用を標的とした調節によるバリア機能の自動リアルタイム評価を可能にすることです。この技術の意味は、自己免疫性中枢神経系疾患の治療にまで及び、T細胞を介した血液脳関門の破壊、そのような疾患の病因への重要なステップについての洞察を提供します。この方法は、EAE中の海洋血液脳関門の特性に焦点を当てています。しかし、赤血球またはヒトの血液脳関門モデルや、他の自己免疫性中枢神経系疾患の研究にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、初代内皮細胞培養とT細胞活性化の組み合わせの最適なタイミングが困難になる可能性があるため、苦労する可能性があります。この手法を開発したのは、多発性硬化症の動物モデルであるEAEの血液脳関門特性に対するT細胞の活性化レベルの違いを調べ始めたときでした。T細胞と内皮細胞の共培養のセットアップは習得が困難であり、ウェル間のTの初期変動がその後の結果の誤った表現を必要とする可能性があるため、この方法を視覚的に実証することが重要です。この手順を開始するには、MBMEC分離後5日目に、インサートごとに80マイクロリットルのMBMECコーティング溶液で透過性インサートをプレコートします。摂氏37度、二酸化炭素5%で3時間インキュベートします。インサートからMBMECコーティング液を取り除いた後、各ウェルに室温PBSを2ミリリットル加えてMBMECを洗浄し、1分後に吸引した後、この手順をもう一度繰り返します。次に、0.05%トリプシンEDTAをウェルあたり300マイクロリットルで添加し、5〜10分間インキュベートします。その後、2ミリリットルのMBMEC培地を各ウェルに追加して、トリプシン化を停止します。次に、収集した細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、サンプルを700倍のgで摂氏4度で8分間遠心分離します。8分後、上清を捨て、ピューロマイシンを含まないMBMEC培地1ミリリットルに細胞を再懸濁します。.細胞を数えるには、0.04%トリパンブルーの90マイクロリットルを混合します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を使用して、ガラスカバーと血球計算盤との間の混合物の10マイクロリットルをピペットで掴みます。次に、挿入ごとに4番目のセルに10の2倍を譲ります。810マイクロリットルのMBMEC培地を各ウェルの下部コンパートメントに追加し、TEER測定を続行する準備ができるまで、インサート付きのプレートをインキュベーターに置きます。CD4陽性T細胞を刺激するには、丸底の96ウェルプレートに精製した抗マウスCD3抗体を所望の最終濃度で37°Cでプレコートします。T細胞を単離した後、プレコートプレートをPBSで2回洗浄します。次に、精製した抗CD28抗体を単離したT細胞に所望の最終濃度で加え、よく混合します。その後、T細胞をセービングし、摂氏37度で2〜3日間放置します。TEER測定を設定するには、TEER機器の24ウェルモジュールを層流フードに配置します。蓋を取り外し、鉗子を使用してMBMECの入ったインサートを装置内に置きます。次に、モジュールウェルの下部コンパートメントに新鮮な培地の810マイクロリットルをピペットで移動し、インサートとモジュールウェルの壁との間に慎重に追加します。その後、蓋を閉め、器具をインキュベーターに入れます。機器をコンピューターに接続します。次に、機器コントローラーの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。ポップアップウィンドウで、[新しい測定]を選択します[TERを表示]と[Cclを表示]ボックスを表示します。次に、スタートを押します。最初の測定が完了したら、[結果]タブで[すべてのウェルをチェック]を選択して、すべてのTEERおよびCcl値を確認します。次に、ファイルを保存します。次に、Cclが安定で1平方センチメートルあたり1マイクロファラッド未満で、TEERが最大レベルに達したときに、MBMECをT細胞と共培養する時点を選択します。TEERとCclの絶対値を慎重に検査し、MBMECが十分にコンフルエントな単層を発達させていない井戸のチェックを外して除外します。ウェルを右クリックして、新しい平均ウェルにウェルを追加を選択して、残りのウェルをグループ化します」ポップアップウィンドウで名前を付け、グループ化するすべての個々のウェルに対して同じことを行います。次に、すべての平均ウェルをチェックして、共培養前にすべてのウェルが同じ初期条件を持っていることを確認します。[実験] タブで、一時停止を押します。機器を外し、インキュベーターから取り出します。次に、層流フードの蓋を取り外します。その後、上部ウェルコンパートメントのインサートから培地の一部を取り出します。150 μLの培地を慎重にピペッティングして、MBMECにT細胞を添加します。次に、機器を再接続し、測定の再開を押します。24時間後、実験タブの停止を押してファイルを保存します。ここに示されているのは、MBMEC単離の5日後のPECAM-1およびCldn-5の免疫蛍光染色における紡錘形の形態です。以下は、T細胞を添加する前の個々のウェルのグループ化前後のTEERおよびCclの値です。この井戸のMBMECは他の井戸ほど高いTEERを発達させていないため、青い曲線は実験には使用されていません。この実験では、マーク35〜55の特異的なCD4陽性T細胞を抗原特異的に5日間刺激しました。ナイーブT細胞および炎症誘発性サイトカイン、インターフェロンγおよびTNF-αは、それぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして機能した。ここでは、T細胞は同量の抗CD3抗体と抗CD28抗体によって刺激され、3日間培養されたものは、わずか2日間培養されたT細胞と比較して、バリア破壊の傾向が高かった。今回の結果は、刺激されたT細胞が上清ではなく刺激されたことがMBMECに大きな損傷を与えたことを示しており、T細胞とMBMECとの直接的な接触がバリア破壊に重要であることを示しています。一方、T細胞培養にグランザイムb阻害剤2を添加すると、MBMECの完全性が大幅に回復し、MBMECの損傷とその後のTEERの減少を引き起こす重要なプレーヤーとして細胞溶解分子が指摘されました。この手順を試行する際には、T細胞と内皮細胞の共培養を設定するための正しい時点を選択することを忘れないでください。この手順に続いて、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、確率エッセイなどの他のエッセイを使用できます。この相互作用はタイトジャンクション分子の発現透過性やT細胞のトランスマイグレーションの程度にどのように影響しますか?その開発後、この技術は、神経免疫学の分野の研究者がマウスの中枢神経系の自己免疫疾患を調査する道を開きました。このビデオを見れば、血液脳関門の完全性と透過性に関して、活性化T細胞と内皮細胞との間の直接的な影響を評価する方法について、よく理解できるはずです。

an-vitro-model-blood-brain-barrier-using-impedance-spectroscopy-focus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

In Vitro血液脳関門モデルにおける経内皮電気抵抗の評価

このビデオでは、血液脳関門(BBB)を通過する病原体を研究するためのin...

血液脳関門の病原体交差と脳細胞感染を研究するためのin vitroモデル

血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。...

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。...

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

ここでは、中枢神経系へのリンパ球の移行をin vitroで調査することを可能にするヒトの血液脳関門モデルについて説明します。...

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

プロトコルの目的は、プライマリ ブタ脳血管内皮細胞 (pBECs) に基づく体外血液脳関門 (BBB)...

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

このプロトコルは、ヒト血液脳関門(BBB) インビトロ...

ヒト血液脳関門をモデル化した三重培養細胞系

このレポートでは、血液脳関門モデルを構築するための μSiM...

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

血液脳関門(BBB)は、安定した健康な脳環境を維持する上で重要な役割を果たしています。BBB機能障害は、多くの神経疾患と関連しています。私たちは、脳血管の病理学、BBBの完全性、およびBBBが遺伝学や疾患によってどのように変化するかを調べるために、BBBの3D幹細胞由来モデルを開発しました。...

神経疾患のモデル化と治療標的化のための血液脳関門の in vitro 再構築

このプロトコルは脳の血液関門の信頼できる、有効な 生体外...

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

ここでは、インピーダンスベースのバイオセンサーであるECISとcellZscopeを使用して、脳内皮バリア強度を測定する手法を示します。脳内皮の in vitro...

がん細胞とサイトカインに応答した2つのインピーダンスベースバイオセンサーによる脳内皮バリア完全性の変化の測定

学ぶインピーダンス分光法による血液脳関門モデル。活性化T細胞と内皮細胞の相互作用がバリア機能に与える影響をリアルタイムで評価し、自己免疫性中枢神経系疾患の病態解明と治療法開発に貢献する。

アン

さらに動画を探す