Name: トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学ぶトランスポゾン系を用いたマウス羊水細胞からのiPSC作製法。非ウイルスベースの安全な再プログラミング技術により、再生医療や患者特異的治療への応用可能性を探索する。

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この作業は、CARIPARO Foundationの助成金番号13/04およびFondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranzaの助成金番号10/02の支援を受けました。マルティナ・ピッコリ、キアラ・フランツィン、ミケーラ・ポッツォボンは、リチェルカ小児科スペランツァ財団から資金提供を受けています。エンリカ・ベルタンは、CARIPARO財団助成金番号13/04によって資金提供されています。パオロ・デ・コッピは、グレート・オーモンド・ストリート・ホスピタル・チルドレンズ・チャリティーから資金提供を受けています。

すべての手順は、イタリアの法律に従いました。マウスAFサンプルをGFPと呼ばれるC57BL / 6-Tgの（UBC-GFP）30Scha / Jマウスからの13.5日後交尾（DPC）で妊娠したマウスから採取しました。 1.トランスポゾン生産注：トランスポゾン発現ベクターは、標準的なクローニング手順を用いて作製しました。マウスAF細胞のトランスフェクション用のプラスミドDNAを、市販のキットを用いて調製しました。 <ol><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内DH5α細菌の50μlのプラスミドDNAの10 ngのを混ぜます。 20分間氷上でマイクロ遠心チューブをインキュベートします。 </li><li> 40秒間42℃でヒートショック。 </li><li> 2分間氷上でマイクロ遠心チューブを置きます。 </li><li>予め温めた（37℃）LB培地（LB）培養液250μlのを追加します。 37℃で30分間（300 rpm）を振ります。 </li><li> 0.1mg / mlのアンピシリンを含むLBプレート上に各形質転換30μlのスプレッド。プレートを乾燥し、37°C​​ OVで反転インキュベート許可ernight。 </li><li>次の日は、午後に、各形質転換から、無菌の200μlのヒントを使用して、3個のコロニーを選択し、0.1mg / mlのLBアンプに転送します。 </li><li> 37℃で一晩（300 rpm）した細菌を振ります。 </li><li>プラスミド精製のための市販のキットを使用します。 -20℃でストックのプラスミド。 </li></ol> 2.マウス胎児線維芽細胞（MEF）の文化<ol><li> 0.1％ゼラチンで6ウェルプレートのコーティング <ol><li>フードの下コートプレートは、6つの各ウェルに滅菌0.1％のゼラチンを1ml加えます。ゼラチンを1時間インキュベーター（37℃）で重合してみましょう。 </li><li>過剰を捨てて、1時間、プレートを乾燥させます。 </li><li>室温でプレートを密封して保存するためにパラフィルムを使用してください。 </li></ol></li><li> マイトマイシンCとのMEFの不活化 <ol><li> 37℃の浴を用いて4×10 6のMEF細胞のバイアルを解凍します。 </li><li> MEF媒体とペトリ皿（150ミリメートル）上のフードにMEFをシード。 </li><li> 37℃で細胞を培養し、5％CO 2。 </li><li> （注意）細胞がコンフルエントであるマイトマイシンC（5 mg / mlで）を追加します。 </li><li> 3時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）に入れる細胞。 </li><li>マイトマイシンCで洗浄細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回培地を除去します。 </li><li> 5分間37℃のインキュベーターに商業トリプシンと場所細胞の2ミリリットルを追加します。後、トリプシン反応を停止するためにメディアをブロックする18ミリリットルを追加します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってburkerチャンバーを用いて細胞を数えます。 </li><li> 5分間、145×gで遠心分離した細胞。上清を捨てます。 </li><li>シード0.1％ゼラチンコーティングしたプレート上の不活性化MEFの60,000細胞/ cm 2。 </li><li> AFおよび/またはIPS-AF細胞を播種する前に、37℃で24時間、5％CO 2の細胞を養います。 </li></ol></li></ol> 3.マウスのAF細胞の単離<ol><li>時限交配を設定し、膣のPLUをチェック共同住宅の24時間後にGS。 </li><li> 13.5 DPCまで観察し、頸椎脱臼を通して妊娠中のダムを生け贄に捧げます。 </li><li> 70％エタノールを用いて動物の腹壁を清掃してください。 </li><li>はさみを使用して、腹腔内へのアクセスを得るために腹壁の長さを切開正中開腹術を行います。 </li><li>鉗子を使用して子宮を公開します。はさみを使用して子宮を取り出して、滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に移す氷上に置きました。 </li><li> 10X倍率でAFを収集するために実体顕微鏡を使用してください。 </li><li>鉗子で子宮を持ち、はさみで子宮壁を取り除きます。胎児膜およびその結果としての羊水漏れへの損傷を避けるように注意してください。 </li><li>滅菌1×PBSで満たされた100ミリメートルペトリ皿に胎児を収集し、氷上に置きます。 </li><li>きれいな100ミリメートルペトリ皿に細かい点鉗子と場所との1胎児の胎盤をつかみます。 </li><li>細かい点の鉗子を使用してSAC卵黄を削除してください。 </li><li&gt;は細かい点の鉗子を使用して羊膜を破砕し、15ミリリットルコニカルバイアルにインスリン注射器を使用して、各胎児のためにAFの30μLを集めます。 </li><li> AF収集した後、1％ウシ胎児血清（FBS）を補充した滅菌1×PBSで各胎児を洗い、そして15ml中にAFを含有する円錐管を集めます。 </li><li> 5分間、145×gで遠心分離AF。ボンネットの下に上清を除去し、ペレット化したAF細胞を播種します。 </li></ol> 4.マウスのAF細胞培養<ol><li> マウスAF細胞の播種 <ol><li>ある日播種の前に、マイトマイシンC処理MEF 0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートを準備します。 </li><li> AF収集後、AF用培地を用いて（約1×10 7細胞を6胎児から得た）分裂不活性化MEFに羊水穿刺から得られた細胞を播種します。 </li><li> 37℃で細胞を培養し、5％CO 2、一日おきに培地を変えます。 </li><li>培養7日後、トランス以下の手順でfect AF細胞。 </li></ol></li></ol> 5.トランスフェクション、IPS-AF細胞の生成と文化注：マウスAF細胞（PB-CAG-rtTAの）トランスポゾンプラスミドトランスポザーゼ発現プラスミド（mPBase）と一緒に、逆テトラサイクリントランスアクチベーターで、PB-tetO2-IRES-OKMSトランスポゾンプラスミドでトランスフェクトしました。全てのプラスミドは、教授アンドラーシュナジ33によって提供されました。 <ol><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに：mPBase0.5μgのとPB-CAG-rtTAの（2μgのトータルDNA）の0.5μgのでPB-tetO2-IRES-OKMS1μgのを混ぜます。 </li><li>無血清培地で100μL（ - DMEMダルベッコ改変イーグル培地）にDNAを希釈します。 </li><li> DNAを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに：トランスフェクション試薬の8μL（ 例えば 、FUGENE）（8μLのトランスフェクション剤に2μgの（DNA）のトランスフェクション剤のプラスミドDNAの比で）を追加します。 </li><li>室温で15分間トランスフェクション試薬/ DNA混合物をインキュベートします。 </li><li> /ウェル2 mLの最終容量で、マウスのAF細胞と6ウェルプレートにウェル当たりトランスフェクション試薬/ DNA混合物の100μLを滴下添加して、静かに旋回することにより配布します。 24時間放置。 </li><li>翌日は、ドキシサイクリンの1.5μgの/ mLの（各ウェルのメディアの2ミリリットル）を補充した新鮮なのiPS-AF培地で細胞を供給することにより、山中の要因（Oct4の、Klf4の、CMYC、Sox2の）の発現を誘導します。 </li><li>新鮮なDOX含有培地（ポイント5.13までドキシサイクリンを補充した培地中で細胞を維持する）で、通過することなく、毎日の細胞を養います。 </li><li> mCherryを発現のために24時間以内に、毎日のコロニー形成（コロニーは、典型的には、トランスフェクション後20〜30日の間に表示される）のための細胞を観察します。 </li><li>一日コロニーピッキングの前に、マイトマイシンC処理したMEF 96ウェル組織培養プレートを準備します。 </li><li>ボリュームusinの50μLに、単一のコロニーをピックアップGA 200μLピペット、および個々のウェルで96ウェルプレートに順次転送します。 </li><li>翌日、商業トリプシンを50μl添加することによって、単一細胞にすべてのコロニーを解離し、37℃で5分間インキュベートします。 </li><li>コロニーを脱凝集するために上下にピペット。 </li><li>ドキシサイクリンを補充した新鮮なのiPS-AF媒体の100μLを充填した96ウェルプレートコーティングされた0.1％ゼラチンで不活性化MEFで新しいウェルに解離したコロニーを含むトリプシンの譲渡50μL。 </li><li>細胞60〜70％コンフルエンスに達すると、24ウェルプレートのウェルに分割。 </li><li>コロニーはドキシサイクリンなしの状態でも表示されるかどうかを確認するために2つの井戸、ドキシサイクリンなしのドキシサイクリンとの1および他に2：細胞が60から70パーセントコンフルエンスに達したら、1を分割します。 </li><li> IPS-AF媒体に不活性化MEFに、ドキシサイクリンの独立したiPS-AFクローンを、維持し続けます。 </li><li> 37℃、5％CO 2、CHで細胞を培養毎日培地をanging。 </li></ol> 6.アルカリホスファターゼ染色<ol><li>ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、製造業者のプロトコルに従って、アルカリホスファターゼ染色を実行します。 </li></ol> 7.免疫蛍光<ol><li>ドキシサイクリンの独立したiPS-AF細胞の出現があるたびに、不活性化MEF 24ウェルプレートのウェルに15万細胞/ cm 2を播種し、37℃、5％CO 2で48時間、細胞を増殖させます。 </li><li> （注意）を室温で15分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）のウェルあたり300μLを加えることにより細胞を固定してください。 </li><li>細胞を透過性にするために、0.1％NP-40の300μLを加えます。 </li><li> 0.1％PBS-Tweenで20300μlで細胞を洗浄。 </li><li>室温で1時間ブロッキング緩衝液（1×PBS中の10％ウマ血清）の300μlのを追加します。 </li><li> （1:10のOct4（1:80）、Sox2の（1:80）、Klf4の（1:80）、Nanogの次の一次抗体を使用して、0）およびSSEA1（1:80）。 1％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清でSSEA1を希釈し、0.3Mグリシン0.1％PBS-Tween-20を含みます。 1×PBS中の10％ウマ血清を持つすべての他の抗体を希釈します。 </li><li> 4℃で一晩抗体をインキュベートします。 </li><li> 0.1％PBS-Tween-20での300μlですすいでください。 </li><li> Alexa594結合ヤギ抗マウスIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ヤギIgG（1：200）、Alexa594結合ニワトリ抗ウサギIgGを1×PBS中の10％ウマ血清で希釈した二次抗体を使用し（1：200）、Alexa568結合ヤギ抗マウスIgM（1：200）。室温で2時間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSですすいでください。 </li><li> 1×PBS中：ヘキスト溶液（万1）で染色核。 </li></ol> インビトロ細胞分化8. <ol><li>ハンギングドロップ胚様体（EB）を形成するために、分化培地を使用して、ペトリ皿の蓋の上に単一の滴（2,000細胞/ 20μl）を養います。 </li><li> 37℃で皿をインキュベート4日間、5％CO 2。 </li><li>分化培地中で3日間懸濁培養100mmの細菌等級皿にEBSを移します。 </li><li>別の14日間（DMEMで1:10に希釈した）基底膜マトリックスでコーティングされた24ウェルプレート中にプレートしたEB。 </li><li> T（1：100）、αFP（1：200）とTubb3（1：500）37免疫蛍光分析のために、一次抗体を使用しています。 </li></ol> 9. インビボテラトーマ形成<ol><li> - / - γC - / -マウスRAG2の後肢の筋肉に1×10 6のiPS-AF細胞を含有する1×100μlのPBSを注入します。 </li><li> 6週間細胞注射後に頸椎脱臼を通してマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>以下の分析のためのマウスの後肢から、その大きさによって区別、腫瘍塊を除去します。 </li><li>クライオスタットを用いて、イソペンタン、凍結腫瘍の7-10μmの厚さの横断切片をカットします。 </li><li> ヘマトキシリンANのためのdはエオシン（HE）染色： <ol><li>製造業者のプロトコールに従って、腫瘍組織の組成を評価するためにHEで染色。 </li></ol></li><li> 免疫染色のために： <ol><li>室温で15分間、4％PFAでテラトーマのセクションを修正しました。 </li><li> 0.1％トリトンX-100で透過性。 </li></ol></li><li>以下の抗体を用いてインキュベートする：Tubb3（1：100）、αFP（1：50）およびαSMA（1：100）は、1×PBS中の1％BSAで希釈しました。 1（Tubb3用）37℃で時間または4℃で一晩（他の抗体用）インキュベートします。 </li><li> 20分間、100％メタノールを用いてペルオキシダーゼを遮断します。 </li><li>二次抗体抗マウスHRPコンジュゲート（150 1）を用いて37℃で45分間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSですすいでください。 </li><li> 5分間ペルオキシダーゼ（HRP）基板（ 材料表を参照してください）でインキュベートします。 </li><li> 5分間水道水ですすいでください。 </li><li> 9秒間ヘマトキシリンQSで染色。 </li><li>水道水ですすいでください。 </li></オール&gt; 細胞からの10 RNA抽出<ol><li>製造業者の推奨プロトコルに従って、商業用のRNA抽出キットを使用してください。 </li></ol>奇形腫から11 RNA抽出<ol><li>サンプルを解凍避けるために、乳棒と乳鉢および液体窒素を使用して奇形腫を均質化。 </li><li>組織25mgを秤量します。 </li><li> RNA抽出のための市販試薬1mLのクロロホルムの200μLを追加します。 </li><li> 5分間、室温でインキュベートします。 </li><li> 13,000×gで遠心分離し、15分間、4°C。 </li><li>新しいチューブにクリアして上清を移します。 </li><li> RNAは、製造業者のプロトコルに従って商用のRNA抽出キットを使用して精製しました。 </li></ol> 12.逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応分析<ol><li>逆転写（RT） - ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびオリゴ（dT）アコーために逆転写酵素を用いて第一鎖cDNAを合成製造業者のプロトコルに丁は、50 ngの/ cDNAのμLを得ました。 10 ngの/μLの濃度でRNaseフリー水を用いてcDNAを希釈します。 </li><li> cDNAの1 ngの/μLを利用し、製造業者のプロトコルに従って、DNAポリメラーゼを用いてRT-PCRを行います。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

多能性の誘導を得るために選択された方法は、長期移植に関して細胞臨床的安全性に関連します。今日では、再プログラミングに適したいくつかの方法があります。非組込み方法のうち、センダイウイルス（センダイウイルス）ベクターは、感染した細胞40の核内に統合することなく、タンパク質を大量に生産することができ、iPS細胞を得るための戦略であり得るRNAウイルスです。センダイウイルスベクターは、翻訳グレードiPS細胞の生成のための魅力的な候補かもしれないが、それはいくつかの欠点を提示します。ウイルスレプリカは、トランスジェニック配列の性質に敏感です。センダイウイルスベクターは、構成的に複製するので、別の戦略は、この態様41,42を改善するために使用される場合であっても、宿主細胞から排除することは困難です。このようなレベル2の生物学的安全キャビネットのように、特別な処理を必要とします。そこで私唯一の商業ベンダーが利用可能です。再プログラミングのための臨床グレードのセンダイウイルスの現在不足して...

出生前診断は、遺伝性疾患（ すなわち染色体異常、単成または複成/多因子疾患）と先天性奇形（ すなわち先天性横隔膜ヘルニア、嚢胞性肺病変、臍帯ヘルニア、胃壁破裂）を評価するための重要な臨床的ツールです。羊水（AF）細胞（ すなわち 、羊水穿刺およびamnioreduction）または帝王切開1、2妊娠中期の間に定期的にスケジュールされた手順から取得するのは簡単です。出生前または新生児の患者からのAF細胞の利用可能性は、再生医療のためのこのソースを使用する可能性を提供し、いくつかの研究は、AF 3、4、5、6から単離された幹細胞集団を使用して、異なる組織の損傷または疾患を治療する可能性を検討しました、7、8、9、10、11、12。簡単に罹患した患者からのAF細胞を得る可能性は、疾患はしばしば静止している時間ウィンドウ内で、再プログラミングのために、この細胞源を使用するというアイデアに道を開きます。実際、AF細胞由来の人工多能性幹（iPS）細胞は、出産前の適切な患者特有の治療を製造するために、 インビトロでの薬物試験のために、または組織工学的アプローチのための目的の細胞に分化することができます。多くの研究は、既に細胞型13、14、15、16、17 &lt;広範囲に再プログラムと区別されるAF細胞の能力を実証しています/ SUP&gt;、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。 4転写因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）の強制発現を介して、再プログラミングされた体細胞の高橋と山中28によって発見されて以来、進展が再プログラミングの分野で行われています。異なる方法を考慮すると、我々は、ウイルスおよび非ウイルス性のアプローチを区別することができます。最初は、部分的に再プログラムされた細胞株の結果とのリスクの両方で、高効率レトロウイルス導入遺伝子の通常不完全なサイレンシングを有するウイルスベクター（レトロウイルスおよびレンチウイルス）の使用を想定し挿入突然変異29、30、31。 すなわちプラスミド、ベクター、mRNA、タンパク質、トランスポゾン：非ウイルス法は、異なる戦略を使用しています。トランスジェニック配列を含まiPS細胞の誘導は、漏出性導入遺伝子発現および挿入突然変異の潜在的に有害な影響を回避することを目指しています。上記の全ての非ウイルス戦略の中で、のpiggyBac（PB）トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは挿入または切除イベント32を触媒する導入遺伝子およびトランスポザーゼ酵素の一過性発現に隣接する唯一の逆方向末端反復を必要とします。 iPS細胞の生成のための他の方法を介してトランスポゾンを使用する利点は、レトロウイルスベクターの同じ効率を示す非ウイルスベクターアプローチとベクトルフリーiPS細胞を得る可能性があります。これはreprogrのための統合されたトランスポゾンエンコーディングのトレースレス切除することにより可能ですiPS細胞33内のトランスポザーゼの新たな一過性の発現以下の要因をamming。 PBは、異なる細胞型34、35、36、37に効率的であることを考えると、ウイルスベクターに対する臨床的アプローチに適している、および生体異物を使用し、現在のウイルス産生プロトコルに反して異種非含有のiPS細胞の産生を可能にします条件は、このシステムは、マウスAFからiPS細胞を得るために使用されます。 ここでは、マウスのAF細胞（IPS-AF細胞）38からの多能性のiPSクローンの生産を表示するには、すでに発表された研究を、以下の詳細なプロトコルを提案します。

<table><tbody><tr><td>100 mmバクテリアグレードのシャーレ&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>351029</td><td>in vitro分化用</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地用</td></tr><tr><td>Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>二次抗体(免疫蛍光法)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>二次抗体(免疫蛍光法)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>二次抗体(免疫蛍光法)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11005</td><td>二次抗体(免疫蛍光法)</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼキット&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>アルカリホスファターゼ&nbsp;</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>細菌選択用</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミンの染色&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>A7906</td><td>BSA、ブロッキングソリューション用。PBS 1x</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td>で希釈 <td>RNA抽出</td></tr><tr><td>用 DH5&α;細胞</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18265-017</td><td>クローニング手順</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>用細菌 <tr><td>ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>41965039</td><td>MEF、マウスAF、iPS-AF細胞および分化培地用</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>外因性因子発現</td></tr><tr><td>用微量遠心チューブ (1.5 ml)&nbsp;</td><td>ザルシュテット&nbsp;</td><td>72.706</td><td>PBプロダクション用&nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10439024</td><td>マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地</td></tr><tr><td>FBS用&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270106</td><td>MEFミディアム</td></tr><tr><td>用 ファインポイント鉗子</td><td>F.S.T</td><td>Dumont #5&nbsp;</td><td>AFアイソレーション</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>0.1%を使用し、PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>ブロッキング溶液で希釈しました。PBS 1x</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Nuclei detection</td></tr><tr><td>HE&nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>奇形腫の組織学的解析</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H3570</td><td>核検出</td></tr><tr><td>ウマ血清&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16050-122</td><td>ブロッキング溶液</td></tr><tr><td>HRP-標識ヤギ 抗マウス IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>二次抗体 (免疫ペルオキシダーゼ)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp;</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>SK4805</td><td>ペルオキシダーゼ基質</td></tr><tr><td>針付きインスリン注射器(25 G)</td><td>テルモ</td><td>SS+01H25161</td><td>羊水穿刺手順</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>ウサギポリクローナルIgG</td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030</td><td>マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地</td></tr><tr><td>LBブロス(レノックス)</td>シ<td>グマ</td><td>L3022</td><td>細菌増殖用</td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>マウスAF細胞およびiPS-AF細胞用培地</td></tr><tr><td>マトリゲル&nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>in vitro分化用。DMEMで1:10に希釈</td></tr> メタ<tr><td>ノール</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>ペルオキシダーゼブロッキング</td></tr><tr><td>MULTIWELL 24ウェルプレート</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>in vitro分化用</td></tr><tr><td>MULTIWELL 6ウェルプレート</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>MEF、マウスAFおよびiPS-AF細胞培養</td></tr><tr><td>用 Nanog&nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>Rabbit polyclonal IgG</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地用</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>ブロッキング溶液用。PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td>で希釈して<td>細胞透過化します。PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>マウスモノクローナルIgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリゴ(dT)で希釈&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18418012</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(溶液)</td>シ<td>グマ</td><td>441244</td><td>PFA、固定剤、PBS</td></tr><tr><td>10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBSで希釈、Ca2+/Mg2+。滅菌水で希釈してPBS 1x</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15070063</td><td>MEF、マウスAF、iPS-AF細胞、分化培地用</td></tr><tr><td>ペトリディッシュ(150mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>MEF培養、組織培養用</td></tr><tr><td>PiggyBacトランスポゼース発現プラスミド&nbsp;</td><td>Andras Nagy教授 研究室</td><td>提供-</td><td>mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS トランスポゾンプラスミド</td><td>Andras Nagy教授提供 研究室</td><td>-</td><td>PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep スピン Maxiprep キット</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>プラスミド精製用</td></tr><tr><td>QIAprep スピン Miniprep キット</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>プラスミド精製用</td></tr><tr><td>逆テトラサイクリントランスアクチベータートランスポゾンプラスミド&nbsp;</td><td>Andras Nagy laboratory教授提供</td><td>-</td><td>rtTA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>用Sox2&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>ヤギポリクローナルIgG</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>マウスモノクローナルIgM</td></tr><tr><td>SuperScript II 逆転写酵素&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18064-014</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>T&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>ウサギポリクローナルIgG</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>トリプシン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300-054</td><td>細胞培養継代</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>細胞透過化用、PBS 1x</td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>で希釈 サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15596-026</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>用<tr><td>Tubb3&nbsp;&nbsp;</td><td>プロメガ&nbsp;</td><td>G712A</td><td>マウスモノクローナルIgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>細胞透過化用、PBS 1x</td></tr><tr><td>&αで希釈;fp&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>R&D Systems</td><td>MAB1368</td><td>マウスモノクローナルIgG1</td></tr><tr><td>&alpha;SMA&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>マウスモノクローナルIgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬(FuGENE HD)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td>AF細胞トランスフェクション用</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SM2645</td><td>羊水穿刺を行う&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &mu;l</td><td>ヒント Sarstedt&nbsp;</td><td>70.760012</td><td>バクテリアのコロニーを選ぶには</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 ステンレス 25U</td><td>羊水穿刺を行うには&nbsp;</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマ</td><td>2860</td>妊娠中<td>のダムの腹壁をきれいにするために</td></tr>組織<tr><td>培養ペトリ皿(150 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>MEF拡張用</td></tr><tr><td>マイトマイシンC</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>MEF不活化用</td></tr><tr><td>MULTIWELL 96ウェルプレート</td><td>BD Falcon</td><td>353071</td><td>iPS-AF培養用</td></tr></tbody></table>

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

人工多能性幹細胞(iPS)細胞は、マウスとヒトの体細胞から、定義された転写因子を異なる方法で強制的に発現させることにより生成されます。ここでは、マウスの羊水細胞から、非ウイルスベースのトランスポゾンシステムを用いてiPS細胞を作製しました。得られたiPS細胞株はすべて、in vitroおよびin vivoで3つの生殖細胞層すべての誘導体に向けて分化する能力など、多能性細胞の特徴を示しました。この戦略は、罹患した胎児の細胞を使用して先天性欠損症の新しい治療法を開発する可能性を開きます。

再プログラミングの能力を評価するために、マウスAF細胞をGFPマウスの胎児から採取しました。細胞は、PB-（ドキシサイクリン誘導方法でmCherryを蛍光タンパク質に連結山中因子（Oct4の、Sox2の、CMYCおよびKlf4の）を発現円形トランスポゾンプラスミドPB-tetO2-IRES-OKMSでトランスフェクション、およびテトラサイクリントランスを逆にしました。 CAG-のrtTA）トランスポザーゼ発現プラスミド（mPBase）と一緒にプラスミド。マウスAF細胞をMEFフィーダー層上のインビトロ拡張の1週間後のOct4、Klf4の、CMYCおよびSox2のトランスフェクトしました。以前39に記載されているように 、外因性因子の発現のために、ドキシサイクリンは、1.5 / mlの濃度で、トランスフェクションの翌日に添加しました。 mCherryをの発現は、トランスフェクションを示すドキシサイクリン加え、24時...

この研究では、非ウイルスベースのトランスポゾンシステムを使用して、マウスの羊水細胞から人工多能性幹細胞を生成します。

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

この手順の全体的な目標は、トランスポゾンシステムを使用してマウスの羊水細胞を分離し、再プログラムすることです。この手法の主な利点は、簡単に実行できることです。治療現場では、ヒトの疾患胎児の細胞を薬物試験や組織工学のために目的の細胞に分化させることで、出産前に患者固有の治療を別の方法として準備することができます。この方法は、プログラミングの主要な質問に答えるのに役立ちます。トランスポゾンシステムは、さまざまな細胞タイプで効率的です。ウイルスベクターに関する臨床アプローチにより適しており、オキシノフリーIPS細胞の産生を可能にします。分離を開始するには、70%エタノールを使用してダムの腹壁を清掃します。はさみを使用して、正中線開腹術を行い、腹壁の長さを切開して腹腔へのアクセスを確保します。鉗子を使用して子宮を露出させ、はさみを使用して子宮を切除します。子宮を滅菌1xPBSで満たされた100ミリメートル皿に移し、氷の上に保ちます。皿を10倍の倍率で実体顕微鏡の下に置き、鉗子で子宮を保持しながら、はさみで子宮壁を取り除き、胎児の膜を傷つけないように注意します。胎児を滅菌1XPBSで満たされた100ミリメートル皿に集め、氷の上に置きます。細い先の鉗子で片方の胎児の胎盤をつかみ、きれいな100ミリ皿に移します。ここで、卵黄の袋を慎重に取り出します。鉗子を使用し、インスリン注射器を使用して羊膜を破壊し、30マイクロリットルの羊水を収集します。液体を15ミリリットルのコニカルバイアルに移します。このプロセスを各胎児に対して繰り返し、毎回同じバイアルに液体を集めます。次に、1%のウシ胎児血清を添加した滅菌1XPBSで各胎児を洗浄し、これを羊水とともに15ミリリットルの円錐管に集めます。チューブをGの145倍で5分間遠心分離し、次に層流フードの下で上清を取り除きます。ペレット化した細胞を2ミリリットルの羊水培養液に再懸濁します。ミオマイシンC処理マウス胚性線維芽細胞またはMEFを含むゼロポイント1パーセントゼラチンコーティングされた6ウェルプレートを取り、次にプレートに2ミリリットルの細胞を播種します。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で培養し、1日おきに培地を交換します。細胞がトランスフェクションの準備ができるまで、7日間培養を続けます。トランスフェクションを開始するには、1ポイント5ミリリミッター微量遠心チューブで、1マイクログラムのトランスポゾンプラスミドとゼロポイント5マイクログラムのトランスポゼース発現プラスミドおよびゼロポイント5マイクログラムの逆テトラサイクリントランスアクチベータープラスミドを混合します。d-manを使用して100マイクロリットルに希釈します。DNAを含む微量遠心チューブに8マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。この混合物を室温で15分間インキュベートします。マウスAF細胞を含む6ウェルプレートを手に取り、1ウェルあたり100マイクロリットルのトランスフェクション剤DNA混合物を滴下し、1ウェルあたり2ミリリットルの最終容量で穏やかに渦巻いて分配します。細胞を摂氏37度で24時間、5%の二酸化炭素に放置します。翌日、培地を取り出し、各ウェルの細胞に2ミリリットルの新鮮なiPS細胞AF培地に1ミリリットルのドキシサイクリンを1ミリリットルあたり5マイクログラム補給して、山中因子の発現を誘導します。この時点から先は通過せずに、新鮮なドックス含有培地を細胞に毎日供給します。最初のドキシシルシン処理から24時間以内に蛍光顕微鏡で細胞を観察し、mCherryの発現を探し、この時点からコロニー形成を毎日行います。コロニー形成が観察されたら、50マイクロリットルの細胞培養培地に単一のコロニーを選びます。次に、それらをミトマイシンcで処理したMEFを含む96ウェル組織培養プレートの別々のウェルに順次移します。翌日、各ウェルに50マイクロリットルのトリプシンを加え、摂氏37度で5分間インキュベートして、コロニーを単一細胞に解離します。インキュベーション後、液体を上下にピペットで動かして、コロニーをさらに分解します。50マイクロリットルのトリプシン細胞混合物を不活化MEFを含む新しいウェルに移し、次に細胞をインキュベーターに戻します。細胞が60〜70%のコンフルエントに達したら、それらを24ウェルプレートの新しいウェルに分割し、室温でインキュベーションを続けます。これらの細胞が60〜70%のコンフルエンスに達したら、細胞を1〜2つに反転させて、ドキシサイクリンを含むウェルと含まないウェルの2つに分けて、ドキシサイクリンがない場合でもコロニーが増殖することを確認します。IPS AF コロニーとドキシサイクリン非依存培地を不活化 MEF で摂氏 37 度、二酸化炭素 5% に維持し続けます。細胞の染色、イメージング、およびRNA抽出の準備が整うまで、培地を毎日交換します。ここでは、安定なドキシサイクリン非依存性人工胸膜能性マウス羊水GFP陽性細胞は、成功したリプログラミングを確認するために必要な胸能マーカーを発現しています。R1 ES細胞をコントロールとして用いたRTPCR解析では、ドキシサイクリンの存在下または非存在下で人工胸能マーカーが発現することが示されました。ハウスキーピング遺伝子であるβ 2ミクログロブリンの発現も、3つの細胞型すべてで観察されました。人工胸膜全能細胞を注入したマウスから単離した奇形腫を免疫染色した。腫瘤中のα胎児タンパク質、α平滑筋アクチン、およびβ 3チューブリンの検出により、細胞が外胚葉、中胚葉、内胚葉の3つの胚葉すべてに分化していることが確認されました。さらに、in vitro胚様体およびin vivo奇形腫細胞のRTPCR解析により、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の生殖細胞層特異的マーカー遺伝子の発現が確認されました。このビデオを見れば、マウスの羊水細胞を単離し、再プログラムする方法を十分に理解できるはずです。これは、日常的な診断や帝王切開から得られたサンプルからヒト羊水細胞にも適用できる、シンプルで安全な手順です。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、誘導レンチウイルスを用いて誘導多能性幹細胞を生成するための手順を示して発現するOct4は、レトロウイルスベクター、c -...

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

Stemgent Doxの誘導性マウスTFのレンチセットは、人工多能性幹（iPS）細胞に、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を再プログラムすることができます。ここでは、マウスプログラミング転​​写因子Oct4のDOX誘導性発現のためのプロトコルを示す、レトロウイルスベクター、KLF4およびc -...

4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞（IPSC）ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する...

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4...

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

マウス胚性線維芽細胞は、転写因子Oct-4、Sox-2、Klf-4、c-Mycの強制発現により、低効率で人工多能性幹細胞に再プログラムすることができます。リプログラミング反応のまれな中間体は、細胞表面メーカーであるThy-1.2、Ssea-1、およびEpcamに対する抗体による標識により単離されたFACSです。...

リプログラマブルマウスモデルからのiPS細胞の中間体の精製を媒介細胞表面マーカー

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。...

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

このプロトコルでは、完全に化学的に定義された条件における非統合 episomal...

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。...

エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

学ぶトランスポゾン系を用いたマウス羊水細胞からのiPSC作製法。非ウイルスベースの安全な再プログラミング技術により、再生医療や患者特異的治療への応用可能性を探索する。

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

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