トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

この手順の全体的な目標は、トランスポゾンシステムを使用してマウスの羊水細胞を分離し、再プログラムすることです。この手法の主な利点は、簡単に実行できることです。治療現場では、ヒトの疾患胎児の細胞を薬物試験や組織工学のために目的の細胞に分化させることで、出産前に患者固有の治療を別の方法として準備することができます。

この方法は、プログラミングの主要な質問に答えるのに役立ちます。トランスポゾンシステムは、さまざまな細胞タイプで効率的です。ウイルスベクターに関する臨床アプローチにより適しており、オキシノフリーIPS細胞の産生を可能にします。

分離を開始するには、70%エタノールを使用してダムの腹壁を清掃します。はさみを使用して、正中線開腹術を行い、腹壁の長さを切開して腹腔へのアクセスを確保します。鉗子を使用して子宮を露出させ、はさみを使用して子宮を切除します。

子宮を滅菌1xPBSで満たされた100ミリメートル皿に移し、氷の上に保ちます。皿を10倍の倍率で実体顕微鏡の下に置き、鉗子で子宮を保持しながら、はさみで子宮壁を取り除き、胎児の膜を傷つけないように注意します。胎児を滅菌1XPBSで満たされた100ミリメートル皿に集め、氷の上に置きます。

細い先の鉗子で片方の胎児の胎盤をつかみ、きれいな100ミリ皿に移します。ここで、卵黄の袋を慎重に取り出します。鉗子を使用し、インスリン注射器を使用して羊膜を破壊し、30マイクロリットルの羊水を収集します。

液体を15ミリリットルのコニカルバイアルに移します。このプロセスを各胎児に対して繰り返し、毎回同じバイアルに液体を集めます。次に、1%のウシ胎児血清を添加した滅菌1XPBSで各胎児を洗浄し、これを羊水とともに15ミリリットルの円錐管に集めます。

チューブをGの145倍で5分間遠心分離し、次に層流フードの下で上清を取り除きます。ペレット化した細胞を2ミリリットルの羊水培養液に再懸濁します。ミオマイシンC処理マウス胚性線維芽細胞またはMEFを含むゼロポイント1パーセントゼラチンコーティングされた6ウェルプレートを取り、次にプレートに2ミリリットルの細胞を播種します。

細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で培養し、1日おきに培地を交換します。細胞がトランスフェクションの準備ができるまで、7日間培養を続けます。トランスフェクションを開始するには、1ポイント5ミリリミッター微量遠心チューブで、1マイクログラムのトランスポゾンプラスミドとゼロポイント5マイクログラムのトランスポゼース発現プラスミドおよびゼロポイント5マイクログラムの逆テトラサイクリントランスアクチベータープラスミドを混合します。

d-manを使用して100マイクロリットルに希釈します。DNAを含む微量遠心チューブに8マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。この混合物を室温で15分間インキュベートします。

マウスAF細胞を含む6ウェルプレートを手に取り、1ウェルあたり100マイクロリットルのトランスフェクション剤DNA混合物を滴下し、1ウェルあたり2ミリリットルの最終容量で穏やかに渦巻いて分配します。細胞を摂氏37度で24時間、5%の二酸化炭素に放置します。翌日、培地を取り出し、各ウェルの細胞に2ミリリットルの新鮮なiPS細胞AF培地に1ミリリットルのドキシサイクリンを1ミリリットルあたり5マイクログラム補給して、山中因子の発現を誘導します。

この時点から先は通過せずに、新鮮なドックス含有培地を細胞に毎日供給します。最初のドキシシルシン処理から24時間以内に蛍光顕微鏡で細胞を観察し、mCherryの発現を探し、この時点からコロニー形成を毎日行います。コロニー形成が観察されたら、50マイクロリットルの細胞培養培地に単一のコロニーを選びます。

次に、それらをミトマイシンcで処理したMEFを含む96ウェル組織培養プレートの別々のウェルに順次移します。翌日、各ウェルに50マイクロリットルのトリプシンを加え、摂氏37度で5分間インキュベートして、コロニーを単一細胞に解離します。インキュベーション後、液体を上下にピペットで動かして、コロニーをさらに分解します。

50マイクロリットルのトリプシン細胞混合物を不活化MEFを含む新しいウェルに移し、次に細胞をインキュベーターに戻します。細胞が60〜70%のコンフルエントに達したら、それらを24ウェルプレートの新しいウェルに分割し、室温でインキュベーションを続けます。これらの細胞が60〜70%のコンフルエンスに達したら、細胞を1〜2つに反転させて、ドキシサイクリンを含むウェルと含まないウェルの2つに分けて、ドキシサイクリンがない場合でもコロニーが増殖することを確認します。

IPS AF コロニーとドキシサイクリン非依存培地を不活化 MEF で摂氏 37 度、二酸化炭素 5% に維持し続けます。細胞の染色、イメージング、およびRNA抽出の準備が整うまで、培地を毎日交換します。ここでは、安定なドキシサイクリン非依存性人工胸膜能性マウス羊水GFP陽性細胞は、成功したリプログラミングを確認するために必要な胸能マーカーを発現しています。

R1 ES細胞をコントロールとして用いたRTPCR解析では、ドキシサイクリンの存在下または非存在下で人工胸能マーカーが発現することが示されました。ハウスキーピング遺伝子であるβ 2ミクログロブリンの発現も、3つの細胞型すべてで観察されました。人工胸膜全能細胞を注入したマウスから単離した奇形腫を免疫染色した。

腫瘤中のα胎児タンパク質、α平滑筋アクチン、およびβ 3チューブリンの検出により、細胞が外胚葉、中胚葉、内胚葉の3つの胚葉すべてに分化していることが確認されました。さらに、in vitro胚様体およびin vivo奇形腫細胞のRTPCR解析により、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の生殖細胞層特異的マーカー遺伝子の発現が確認されました。このビデオを見れば、マウスの羊水細胞を単離し、再プログラムする方法を十分に理解できるはずです。

これは、日常的な診断や帝王切開から得られたサンプルからヒト羊水細胞にも適用できる、シンプルで安全な手順です。