真空安定化撮像窓と肺における長期高分解能生体顕微鏡

この手法の全体的な目的は、真空安定化イメージングウィンドウを用いて、無傷の肺の長期にわたる高解像度シングルセルイメージングを行うことです。この手法は、転移の初期段階においてストロマ（基質）と腫瘍細胞の間にどのような相互作用が確保されるかなど、がん研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、生きた無傷の肺を、理論上最大12時間にわたってシングルセル解像度で可視化できることです。

まず、2-0縫合糸を3インチに切り、ブッシングから1/4インチ上の位置で気管カテーテルに二重結びで固定します。次に、麻酔をかけたマウスの目に眼軟膏を塗布し、除毛クリームを使用して、胸部正中線から背中1/4まで、および腋窩から肋骨の下まで、動物の左側の体毛を除去します。余分なローションを拭き取り、露出した皮膚を70%ethanolで滅菌します。

次に、動物に挿管を行います。2-0縫合糸を、前歯の下から鼻先に結びつけます。カテーテルが抜けないように注意しながら動物を手術領域へ移動させ、人工呼吸器をオンにします。

人工呼吸器を気管カテーテルに接続します。次に、カテーテルを鼻先に、また左前肢をカテーテルにテープで固定します。つま先へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認した後、鋭利な鋏を用いて左胸壁上の皮膚を1cm²切除します。

乳腺脂肪パッドを挙上し、露出した血管を焼灼します。次に、脂肪パッドを切除し、肋骨まで筋肉層を除去しますが、前肢の基部にある腋窩静脈を切断しないよう注意してください。ピンセットを使用して第6肋骨を挙上します。

次に、鋭い鋏を5度という浅い角度に保持し、皮膚の切開口の縁付近で肋骨を切断します。胸壁の開口部を広げるために、連続する4本の肋骨を取り除き、肺葉全体を露出させます。その後、マウスを顕微鏡のイメージングステージ上に注意深く移動させます。

真空ポンプをオフにした状態で、真空ウィンドウの内室をPBSで満たします。マウスを反転させ、露出した肺を真空イメージングカバースリップウィンドウの上に配置します。ゆっくりと真空ポンプをオンにします。

半分に折ったティッシュペーパーで作った拘束用ハーネスをマウスの胸の上に2回重ねて配置し、ハーネスをステージプレートにテープで固定します。次に、パルスオキシメーターを動物の足に取り付けます。その後、環境チャンバーをステージ上に設置し、ヒーターをオンにしてマウスを生理的な温度に維持します。

動物を固定位置に配置した後、25倍・開口数0.95の対物レンズをカバーガラスに近づけます。エピ蛍光モードでfitzyチャンネルを確認し、肺組織にピントを合わせます。次に、滅菌シリンジに100 µLの腫瘍細胞懸濁液を充填し、尾静脈カテーテルからPBSが入ったシリンジを取り外して、腫瘍細胞が入ったシリンジを接続します。

腫瘍細胞を尾静脈にゆっくりと注入します。次に、PBSが入ったシリンジを尾静脈カテーテルに再接続し、顕微鏡の接眼レンズを通して肺組織全体に腫瘍細胞が分布していることを確認します。続いて、PBSシリンジを100 µLのローダミンデキストランを充填したシリンジに交換し、尾静脈カテーテルを介してマウスにデキストランをゆっくりと注入します。

デキストラン投与後、50 µLの滅菌PBSでフラッシュします。次に、以前に特定した腫瘍細胞の各位置で画像を撮影し、血管系の血流と完全性を可視化します。注入から24時間後には、血管内で単一の腫瘍細胞がマクロファージや単球と相互作用している様子を可視化できます。

イメージングの安定性が高いため、視野の連続的なZスタックを取得し、3次元再構成を生成することが可能です。ここでは、注入12日後の単一の転移病変における肺表面下15 µmの深さで、890 µmの視野をカバーする5×5のモザイクイメージングフィールドを、205分間にわたって撮影した様子を示します。広い視野であるにもかかわらず、モザイクを構成する基盤フレームの解像度が高いため、染色体の分離によって確認できる単一細胞の有糸分裂などの細胞内イベントを捉えることができます。

高分子量で蛍光標識されたデキストランを血管内に注入すると、血管腔が標識されます。ただし、標識されていない血中の赤血球や白血球がデキストランを遮蔽することがあります。肺の細小毛細血管において、この遮蔽によりデキストランの信号が点滅し、血管境界の定義が失われます。本プロトコルによって得られる高い空間的安定性により、ぼやけることなく血液チャネルの時間平均化が可能となり、これにより一時的な遮蔽を復元できます。

その後、他のシグナルチャネルを血管系に重ね合わせることで、血管の境界を明確に視覚化できます。この手技に習熟すれば、適切に実施することで約1時間で完了させることが可能です。この手順を行う際は、大きな血管を切断する前に必ず焼灼すること、および肺組織に一切触れないように注意することが重要です。

本手順に従うことで、腫瘍細胞の播種および増殖の初期段階を視覚化することができます。このビデオを視聴することで、真空安定化イメージングウィンドウを用いた、無傷の肺における生体内イメージングの実施方法について十分な理解が得られたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。