Deafferentatedマウス網膜のフラットマウントの準備中のスターバーストアマクリン細胞のパッチクランプ記録

この手順の全体的な目標は、フラットマウントマウス網膜調製物で内側の網膜ニューロンから全細胞パッチクランプ記録を実行することです。この方法は、ニューロンの多様性、正常および病理学的条件下でのニューロンのシナプス結合など、網膜神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、垂直方向と横方向の両方の接続が維持され、大きな横方向のコンポーネントを持つ網膜回路を研究できることです。

一般的に、網膜は細心の注意と忍耐で取り扱わなければならない薄くて繊細な組織であるため、この方法に不慣れな人は苦労するでしょう。しかし、それをマスターするには練習が一番です。この手順を開始するには、マウスの眼球を清潔なペーパータオルで転がして血液を取り除きます。

次に、それらをカルボゲン化哺乳類のRinger溶液に浸します。次に、23ゲージの針でリンバスに穴を開け、マイクロハサミでリンバスに沿って切って眼球を二等分します。その後、細い鉗子で角膜と水晶体を切除します。

網膜ホールマウントの場合は、細かい鉗子で色素沈着した上皮から網膜全体をそっと剥がし、端から視神経頭に向かって1.5〜2ミリメートルの直交するカットを4回行います。その後、パンチングしたニトロセルロースメンブレンを皿に浸し、GCL側を上にして網膜をそっとドラッグします。次に、視神経ヘッドを中央の穴に配置して、ホールマウント網膜を準備します。

その後、網膜のあるメンブレンを別のきれいな皿に移します。網膜をマルチーズ十字のように細いペイントブラシで優しく平らにし、穴の上に4つの端をすべて置きます。ニトロセルロースメンブレンを乾燥した濾紙で拭き取り、鉗子子とペイントブラシで硝子体と内側の制限膜を取り除きます。

下部に密封されたガラスカバースリップを使用してアセンブリを記録チャンバーに移す前に、すべての網膜エッジがメンブレンに完全に取り付けられていることを確認してください。メンブレンを真空グリースでカバースリップに固定し、網膜を外部溶液で再水和します。.アセンブリの下に気泡が溜まらないように注意してください。

次に、チャンバーを正立顕微鏡のステージにセットします。チャンバーを摂氏34度のカルボジン化外部溶液で毎分約3ミリリットルの速度でふんだんに含みます。最初に10倍の主観レンズの下で網膜を調べます。

次に、60倍水浸レンズを使用して、DICおよびエピ蛍光設定下のGCLニューロンとINLニューロンを観察します。tdTomatoを発現するSACを可視化するには、白色LED光源と554ナノメートルの励起フィルタ、581ナノメートルの発光フィルタを組み合わせて使用します。この手順では、シリンジフィルターを介して内部溶液をカスタムバックフィルフィラメントにろ過します。

次に、引きたてのマイクロピペットにフィラメントを挿入し、溶液が銀電極ワイヤーを5ミリメートル以上覆うまで、先端近くの内部溶液を分注します。その後、マイクロピペットを電極ホルダーに固定し、吸引力で電極内部の圧力を調整することで、チューブに接続された10ミリリットルのプラスチックシリンジのプランジャーを押すか引くことで電極内の圧力を調整できます。次に、ピペットを対物レンズの下に配置して、網膜の約100マイクロメートル上に下げます。

電流フォロワ・モードでは、DCオフセットを使用して、定常DC電圧信号をゼロにします。電流クランプモードでのピペット抵抗を測定するには、ピペットが浴中にある間に固定振幅の方形波電流を注入します。Raccessノブを回して差を中和し、その読み取り値を使用してピペット抵抗を計算します。

その後、電極を網膜の約10マイクロメートル上にゆっくりと持っていきます。電極に正圧を加えます。次に、ピペットの先端付近で反射が網膜に近づくにつれて変化するのを観察します。

素早く、しかし穏やかに、ピペットをGCLに押し込み、すぐに陽圧を下げます。ピペットを標識されたニューロンに向けて移動させ、他のニューロン、血管、Muller細胞の端足に接触しないようにします。必要に応じて、電極の目詰まりを防ぐために、より多くの正圧を加えます。

次に、ディンプルが見えるまで、ピペットチップを標識されたニューロンの近くに置きます。次に、陽圧を放し、原形質膜がピペットチップに跳ね返るのを待ちます。ピペットに20〜120ピコアンペアの負電流を流して、ギガオームシールの形成を助けます。

記録後の細胞形態を維持するためには、膜とピペット開口部との間に自然に形成される優れたシールが重要であるため、陽圧を解放した後に細胞膜が跳ね返るようにすることが重要です。必要に応じて、穏やかに吸引して原形質膜をピペットに引き込みます。シール形成後5分待って細胞膜を破裂させ、こぼれた内部溶液を超融合によってクリアランスできるようにします。

メンブレンが破裂した後、電流クランプモードで、ブリッジバランスをオンにし、Raccessノブを使用して調整します。セルを反転電位に保持することにより、電圧クランプモードで興奮性および抑制性のシナプス後電流を記録します。録音後、ピペットを体細胞からそっと取り外します。

アセンブリをチャンバーから清潔な皿に移します。次に、網膜を穴を開けずに別の平坦なニトロセルロース膜に取り外して再接着し、固定中の網膜の平坦性を確保します。これで、組織を染色する準備が整いました。

これらの画像は、GCLとINLの両方のコリン作動性細胞がtdTomato蛍光によって確実に同定され、DIC下での全細胞パッチクランプ記録の標的となることを示しています。それらの膜電位の振動は電流クランプ記録によって明らかにすることができ、抑制性シナプス電流と興奮性シナプス電流によって駆動される振動は、電圧クランプ条件下で細胞をそれぞれ0ミリボルトとマイナス75ミリボルトに保持することによって明らかになります。ここでは、記録された細胞のポストホーク組織学的特性評価は、IPLの典型的なSAC樹状突起の形態と層別化レベルを示しています。

この手順を試みる際には、網膜膜アセンブリを記録チャンバーに固定し、下の気泡を閉じ込めずにしっかりと繊細に再水和して、記録可能なサンプルを提供することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ターゲットの複数の細胞の振動が同じシナプスメカニズムによって駆動されているかどうかなどの追加の質問に答えるために、デュアルパッチクランプ記録などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、網膜神経生物学の分野の研究者が、視細胞変性網膜における隣接する網膜ニューロン間の振動の同期性を探求する道を開きます。

このビデオを見た後、硝子体液を除去する方法と、内側の網膜ニューロンから標的を絞った全スケールのパッチクランプ記録のための網膜フラットマウントを準備する方法をよく理解しているはずです。