Name: 高解像度落射顕微鏡を用いた3次元画像の迅速な取得 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶ 高解像度落射顕微鏡を用いたマウス胚の3次元画像取得法。標準的な実験機器で詳細な形態計測分析が可能となり、発生生物学研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

技術サポートを提供してくださったYichen Huang博士、Chunming Guo博士、Zhenfang Zhou博士に感謝いたします。この研究は、NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) と American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL) の資金提供を受けました。

すべての動物の使用は、ボストン小児病院で施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 1.試料の調製<ol><li> 時限交配 <ol><li>同じケージで一緒のC57Bl6野生型のオスとメスを入れます。 </li><li>次の日の朝早く、嵌合プラグの形成のために確認してください。嵌合プラグ（ 別名 、膣または交尾プラグ）は、そのブロック膣を硬化ゲル状の堆積です。 </li><li>胎生0.5（E0.5）などのプラグ日付を設定します。 </li></ol></li><li> マウス胚の単離 <ol><li> CO 2窒息により妊娠した雌を安楽死させます。 </li><li>吸収パッドに仰向けマウスを入れて、70％エタノールで腹部をスプレー。 </li><li>皮膚を持ち上げ、手術用はさみを使用して尾側腹部での初期5ミリメートルの切開を行います。カットし、完全に内臓を露出させるために腹部の皮膚を取り除きます</li><li> VAの近くにカットGINAは、子宮全体を削除します。 </li><li>子宮角に沿って移植部位の間で切断。各セグメントまたは受胎は、内部に一つだけの胚を持っている必要があります。 </li><li> 1xの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で子宮セグメントを保管してください。 </li></ol></li><li> 胚の解剖 <ol><li>ステレオスコープの下の氷冷PBSで別々の皿に各受胎を置きます。 </li><li>順次細かい解剖鉗子を使用して、子宮組織、胎盤、その後、胎児膜を削除します。 </li><li>大ホールピペットを用いて、1×氷冷PBSで50mlチューブに解剖胚を転送します。組織の損傷を最小限にするためにピンセットで直接胚を拾うことは避けてください。 </li></ol></li><li> 固定 <ol><li>固定剤の少なくとも10のサンプルボリュームを持つ以上24時間4℃で10％中性緩衝ホルマリン溶液中で切開した胚を修正しました。 </li></ol></li><li> 前処理 <ol><li> 4：クリアソリューションを準備二重蒸留水中M尿素、10％グリセロール、4％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）。 </li><li>クリアリング・ソリューションとの固定液を交換してください。 </li><li> 2週間 - 優しく1室温でロッカー上の標本を回転させます。第二および第三日目に一度クリアソリューションを交換します。標本はゆっくりとはっきりと半透明になります。 </li><li> 10％ホルマリンでクリアソリューションを交換し、2日間ロッカーに残します。 </li></ol></li><li> 脱水 <ol><li> 5分ごとに、1×PBSで3回を前処理したサンプルを洗ってください。 </li><li>穏やかなロッカー上で室温にて昇順エタノール系列でサンプルを脱水します。 E15.5の胚については、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％及び100％エタノール、2時間、各段階を含む、上昇エタノール系列を使用します。古い胚については、インキュベーション時間を長くする必要があります。 </li></ol></li><li> 染色 <ol><li>エオシンY二ナトリウム塩と0.02の0.1375グラムを追加します。染色溶液を準備100％エタノール50ml中にアクリジンオレンジヘミ（塩化亜鉛）塩75グラム。 2時間撹拌。濾紙でフィルタリングします。室温で保存し、アルミホイルで覆うことにより、光を避けます。 </li><li> 1時間染色溶液に試料を転送します。 </li><li>新鮮な染色液と染色一夜に交換してください。 </li></ol></li><li> 浸潤 <ol><li>浸透液を調製：JB-4埋め込みキットの溶液Aの100ミリリットル、触媒C、エオシンY二ナトリウム塩の0.275グラムとアクリジンオレンジヘミ（塩化亜鉛）塩の0.055グラムの1.25グラムを兼ね備えています。 2時間アイスバケット中（200 rpm）を混合するために攪拌し、次いで濾紙で濾過します。 </li><li> 4℃で浸透ソリューションを保存し、アルミホイルで覆うことにより、光を避けます。 </li><li>浸透液に胚を移す：染色溶液（1：1）、および4℃でロッカー上で少なくとも3時間インキュベートします。 </li><li>浸透液に胚を移し、3時間インキュベート低温室でロッカーの研究。 </li><li>一回毎日浸透ソリューションを交換し、さらに3日間緩やかなロッカーに寒い部屋に残します。 </li></ol></li></ol> 2.埋め込み<ol><li>氷の上に溶液Bと浸透策を保管してください。 </li><li>すぐに埋め込む前に埋め込みソリューション（溶液Bと浸透策の1時25分）を行います。 </li><li>オリエント埋め込む金型内の検体は、その後静かに埋め込む型の中に冷たい埋め込みソリューションを注ぎます。再配向させる必要に応じてピンで。 </li><li>埋め込みソリューションが固化されているかどうかを調べるためにピンを使用します。試料ブロックを押し、必要に応じてそれをトリミング。 </li><li>クロスの向きを取得するために別々の金型を使用して試料ブロックの向きを変えます。 </li><li>埋め込む金型の上にブロックホルダーを置きます。金型とブロックホルダは埋め込みソリューションによって水没するまで静かに金型内に埋め込みソリューションを注ぎます。 </li><li>第2の容器に試料を保持し、それを残しますヒュームフード内で4時間 - 3氷上で。 </li><li> 4°Cで固化した標本を保管してください。 </li><li>埋込み型を剥がします。ブロック内の試料の位置を検査するために、斜め照明で実体顕微鏡下にブロックを置きます。試料の周りのブロック面には、マークグリッド線。 </li><li>参照としてマークされたグリッド線を使用して材料を埋め込むのアクセス量を除去するためにブロックをトリム。 </li></ol> 3.画像取得<ol><li>ミクロトームに試料ブロックを固定し、新鮮な切断面を得ます。セット部の厚さ（ 例えば 、e9.5-10.5、1.5ミクロン; e11.5-12.5、2.0ミクロン; e13.5-15.5、2.5ミクロン; E16.5-古い、3ミクロン）。ミクロトームのホームポジションに検体/ブロックを保管してください。 </li><li>水平方向に試料のブロック面に対向ステレオズーム顕微鏡をマウントします。 </li><li>コンピュータと顕微鏡の電源を入れ、画像取得ソフトウェアを起動します。 </li><li>視覚化し、ブロック面に光学系の焦点を合わせますイメージングソフトウェアの「ライブビュー」モードで。 </li><li>ブロック-顔がファインダーの中心になるように、必要に応じて顕微鏡およびミクロトームを合わせます。 </li><li>ブロック全体-顔がファインダー内に収まるようにズームを調整します。 </li><li>緑色蛍光タンパク質（GFP）フィルター（励起470±20 nmで、ダイクロイック495nmで、発光525±25 nm）を選択し、必要に応じて再び焦点を合わせます。 </li><li>測定し、設定された露光時間を手動で（ 例えば、80から400ミニ秒）。 </li><li>各新鮮なカットの後、ブロックの顔の画像を取得し、可能な場合は、自動的に画像を保存します。 </li><li>解像度、切片厚とズームを含むレコードの重要なパラメータ。 </li><li>標本全体を終えた後、エクスポートし、必要に応じてすべての画像ファイルは、JPEG形式に変換します。 </li><li>イメージング処理ソフトウェアを使用して、すべての原稿画像を反転し、明るさとコントラストを調整します。 </li><li>別のフォルダ内のすべての処理された画像を保存します。 </li></ol> 4. 3D可視化<ol><li>指示に従って、3D可視化ソフトウェアに対するすべての処理された画像をアップロードします。 </li><li>入力解像度とセクションの厚さは、ボリュームデータ（ すなわち、ボクセルサイズ）へのすべての画像を変換し、3Dファイルを保存します。 </li><li>自動モードを使用して、すべての画像の位置を合わせます。必要に応じて手動で個々の画像を調整します。 </li><li>新しいファイル名に合わせた画像を保存します。 </li><li> 3次元可視化ソフトウェアを使用して、試料の形態学的特徴を分析します。 </li></ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+Res+C%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).</li>
<li>Norris, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coming+of+age%3A+advanced+imaging+technologies+for+characterising+the+developing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse.</a> Trends Genet. 29, 700-711 (2013).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+structural+abnormalities+in+mouse+embryos+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+model+mech%22%5BJournal%5D)">Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).</li>
<li>Sizarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+and+molecular+analysis+of+the+arterial+pole+of+the+developing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart.</a> J Anat. 220, 336-349 (2012).</li>
<li>Anderson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+intrapericardial+arterial+trunks+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice.</a> Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).</li>
<li>Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+mammalian+cloacal+morphogenesis+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dev Biol. 409, 106-113 (2016).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+episcopic+fluorescence+image+capturing+%28EFIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC).</a> Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、迅速な3D可視化および複雑な構造の形態計測分析のために互換性のあるシリアルHREM画像を取得するために、ルーチン実験装置を使用して修正されたプロトコルを提示します。高解像度の画像ではなく、個々のセクションのブロック面から直接取得されるため、微細な形態学的特徴を保持し、迅速に3次元可視化プログラムでデジタル再構築されます。 3Dイメージングは​​、複雑な形態学的特徴を視覚化し、理解する上で重要な利点を提供しています。ほとんどの3Dイメージング技術は、特殊な装置1-4に依存します。これとは対照的に、EFICおよびHREMイメージングは、デジタルカメラやミクロトーム14を装備した実体顕微鏡を含む標準的な実験装置を利用しています。顕微鏡とミクロトームの間の機能的結合は、画像取得の自動化は、全体の画像取得プロセスの自動化を可能に可能にします。しかし、ことを示しています機能性カップリングは8必須ではありません。それは安静時停止位置での標準ミクロトームのブロック面に直接面するようにする代わりに、我々は単に水平に実体顕微...

3Dイメージング技術の出現により、胎児の発育中の詳細な形態学的特徴の体系的な解析の可能性が開かれました。現在、マイクロ磁気共鳴イメージング(マイクロMRI)、マイクロコンピュータ断層撮影、高周波超音波、光干渉断層撮影、光学プロジェクト断層撮影、エピスコピック顕微鏡1-4など、さまざまな3Dイメージングモダリティが利用可能になっています。各モダリティには、解像度、コントラスト、速度、コスト、子宮内能力、および可用性において独自の特徴があります。
エピスコピック蛍光画像キャプチャー(EFIC)および高解像度エピスコピック顕微鏡(HREM)は、エピスコピック顕微鏡イメージング法です 4.ここでは、高解像度のシリアル画像が組織切片ではなく、ブロック面から連続的にキャプチャされます。結果として得られる画像は、組織の歪みを最小限に抑えて、またはまったく詳細な形態学的特徴を忠実に反映しています。取得した体積データは、正確な形態計測解析に適した高解像度の3D画像に容易に変換することができます。比較的低コストで高解像度であるため、HREMとEPICは、ヒトの先天性欠損症2,4-8のマウスモデルの全身評価の優れた代替手段となっています。
EFIC法とHREM法の両方で、試料を適切な媒体に埋め込む必要があります。EFICは、埋め込まれた組織から放出される自家蛍光を検出します。このため、自家蛍光を多く放出する標本に限られ、初期胚9のように自家蛍光が比較的弱い標本には限られていない。自家蛍光の依存性を克服するために、標本は高分解能電子顕微鏡イメージングのためにエオシンなどの蛍光色素で染色されます。また、色素や染色方法の選択肢により、HREMは組織構造や形態の文脈で分子シグナルを検出するための適合性を高めることができます4,10。
この記事では、後期マウス胚の全身評価に適した改良型HREMプロトコルを紹介します。染色を容易にするために、組織の浸透性を高めるための前処理ステップを含め、それにより高齢のマウス胚のHREMイメージングが可能になります。

<table><tbody><tr><td>マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>Pharmco-Aaper</td><td></td><td>111000200 200 プルーフ、アブソリュート、ACS/USP/コーシャグレード</td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td>シグマ</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマ</td><td>U5128</td><td>クリアリングソリューション</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー科学</td><td>G33-4</td><td>クリアリングソリューション</td></tr><tr><td>ナトリウムドデシル硫酸塩</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>清澄化溶液</td></tr><tr><td>エオシン Y 二ナトリウム 塩</td><td>フィッシャー 科学</td><td>BP241925</td><td>浸透液</td></tr><tr><td>アクリジン オレンジ ヘミ(塩化亜鉛)塩</td><td>シグマ</td><td>A6014</td><td>浸透液</td></tr><tr><td>Whatman 論文</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 埋め込みキット - ソリューション A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>浸透液</td></tr><tr><td>JB-4 埋込キット - ソリューションB</td><td>(株)ポリサイエンス</td><td>0226B-30</td><td>埋込みソリューション</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp;埋め込みキット - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td> 浸透<td>液</td></tr><tr><td>金型埋め込み</td><td>(株) Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8 mm</td></tr><tr><td>Peel-A-Way シャープ埋め込み金型</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>22 mm x 22 mm角、12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4に切り捨てられる JB-4&nbsp;プラスチックブロックホルダー</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr>使い捨て<tr><td>の目盛り付きトランスファーパイプ</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>ペトルディッシュ</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>胚解</td></tr><tr><td>剖鉗子イノックスチップ</td><td>&nbsp;ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>胚解剖</td></tr><tr><td>Graefe Tissue Forcep</td><td>&nbsp;ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>胚解剖</td></tr><tr><td>デリケート手術用ハサミ</td><td>&nbsp;ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>胚解剖</td></tr><tr><td>14 ml ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml ポリプロピレン円錐チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>マジック タッチ アイスウェア インターナショナル コーポレーション</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml(3.4オンス)帯電防止ポリスチレン計量ボートVWR</td><td></td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml(11.2オンス)帯電防止ポリスチレンはボートVWR</td><td></td><td>89106-770</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>MPバイオメディカル</td><td>102892</td><td>PBS溶液</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td>シ<td>グマ</td><td>P0662</td><td>PBS溶液</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>シグマ</td><td>P5405</td><td>PBS溶液</td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム二塩基性七水和物</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>S9390PBS</td><td>溶液</td>を量ります</tr><tr><td>デジカメ</td><td>浜松ホトニクス</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>イルミネーター</td><td>カールツァイス</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ステレオズーム顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>アクシオ Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー光源</td><td>ライカ</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てミクロトームブレード</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>シングルエッジディスペンサー</td><td>ペルソナ</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3Dソフトウェア</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>コンピューター</td><td>Dell T7600、2x900GB SASハードドライブおよび64 GB DDR3 RDIMMメモリ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロッキングプラットフォームシェーカー</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>標準ホットプレートスターラー</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

高解像度落射顕微鏡を用いた3次元画像の迅速な取得

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

高解像度の顕微鏡顕微鏡(HREM)技術により、高解像度のデジタル体積および3次元(3D)形態測定データの迅速な取得が可能になります。ここでは、マウス胚全体をイメージングするための詳細なプロトコールについて説明します。このプロトコルは、サンプル調製、埋め込み、画像取得、そして最後に3D視覚化の4つの主要なセクションで構成されています。この技術では、標本を蛍光色素で染色する必要がありますが、これは大きな標本や密度の高い標本では問題となる可能性があります。この制限を克服するために、既存のプロトコルを改善して、尿素とドデシル硫酸ナトリウムを含む溶液で標本を前処理することにより、色素の組織浸透を強化しました。このプロトコルは、標準的な実験室環境に容易に適応できるように、日常的な実験装置と試薬のみを使用します。得られた高解像度3D画像は、マウス胚の内臓の詳細な形態学的特徴を忠実に再現し、それによって形態測定分析を可能にすることを示しました。私たちは、標準的な実験装置を使用して、小型および大型の試料の高解像度3D画像を取得するための詳細で改良されたプロトコルを一緒に提示します。

我々は、E9.5とE13.5 8間のマウス胚の高品質のHREM画像を報告しています。後期段階の胚の画像品質は、しかしながら、かなりために蛍光色素エオシンの限られた組織浸透の危険にさらされています。染色効率を向上させるために、我々は、蛍光イメージング11に互換性のあるいくつかの前処理方法をテストしています。具体的には、E15.5マウス胚のSca /電子A2 12または全身CUBIC 13のいずれかで処理しました。我々はまた、簡略化された式、クリア溶液（4 M尿素、10％グリセロール、4％ドデシル硫酸ナトリウム）を試験しました。すべての前処理方法は、染色効率を増加させました。胚はクリアソリューションによる治療の1週間後に半透明になりました。明らかな組織損傷は、治療後に検出されませんでした。前処理された胚はembeddeされる前に脱水、染色および浸潤などの工程を経て処理されましたプラスチック包埋媒体中のd。 HREM画像はセクション3で上述したように埋め込まれた標本から得られた（画像取得）お...

私たちは、マウス胚の3次元(3D)画像を取得するための高解像度の顕微鏡法を用いた詳細なプロトコルを記述します。この改良されたプロトコルは、蛍光色素の浸透性を高めるために改良された組織調製法を利用しているため、小さな標本と大きな標本の両方の形態測定分析が可能になります。

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

このプロトコルの全体的な目的は、標準的な実験室設備を用いて、生物試料の高解像度3Dデジタル画像を迅速に取得することです。本手法は、複雑な形態学的特徴の可視化およびダイナミクスを通じて、発生生物学分野における重要な疑問に答えることができます。本技術の主な利点は、標準的な実験室設備を使用すること、および事前の経験がほとんど不要であることです。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるJungang Huangです。本文のプロトコルに記載されている通りに胚の解剖と固定を行った後、固定液を透明化溶液に交換し、室温のロッカー上で検体を緩やかに回転させながら1〜2週間置きます。インキュベーションの終了後、検体を10% formalinに移し、さらに2日間ロッカー上に置いてください。3日目に、サンプルをPBSで5分間ずつ3回洗浄します。次に、室温で緩やかなロッカール上で、各濃度につき2時間ずつ、エタノール系列の昇順でサンプルを脱水します。100%エタノールでの脱水後、検体を染色液に移し、遮光下で1時間置きます。次に、溶液を新しい染色液に交換し、検体を一晩ラベル化します。翌朝、サンプルの体積と同量の新鮮に調製した浸透液と染色液の混合液に浸し、4 °Cのロッカーステージ上で少なくとも3時間振盪させます。インキュベーション終了後、胚を浸透液に移し、さらに3時間ロッカーステージでインキュベーションします。次に、上清を新しい浸透液に交換し、4°Cでさらに3日間ロッキングを行います。4日目に、埋め込みモールドの中で胚の向きを整え、モールドを氷上に置きます。溶液Bを浸透液と混合し、その後、モールドを4°Cの冷たい埋め込み溶液にゆっくりと浸します。約3時間後、チップを用いて溶液が凝固したことを確認し、試料をモールドから押し出します。余分な包埋剤を切り取り、試料ブロックを新しいモールドに入れ、直交する方向で再配向させます。次に、セットアップ全体をドラフト内の氷上に置きます。埋没溶液を新しいモールドに、試料が完全に浸るまで静かに加えます。次に、モールドの上にブロックホルダーを置きます。3〜4時間後、埋没モールドを取り除き、斜光照明を備えた実体顕微鏡下でブロックを観察して、ブロック内における試料の位置を確認します。ブロック面に標本周囲の格子線を記入し、これらの線をガイドとして、余分な包埋材をトリミングします。標本を撮影するには、まずブロックをミクロトームに固定し、標本の新鮮な表面をカットします。次に、ステレオズーム顕微鏡を標本のブロック面に向けて水平に設置し、顕微鏡と接続されたコンピュータの電源を入れます。次に、画像取得ソフトウェアを起動し、ライブビューモードを使用して、光学系をブロック表面にピント合わせします。ブロック表面がビューファインダーの中心にくるように、必要に応じて顕微鏡とミクロトームの位置を調整してください。この手順において最も重要なステップの一つは、ミクロトームの固定ホームポジションで画像を撮影することです。ズームを調整し、ブロック面全体がビューファインダー内に収まっていることを確認します。次に、緑色蛍光タンパク質フィルターを選択します。標本組織が現れるまでブロックをプリカットし、必要に応じて画像を再フォーカスします。露光時間を手動で測定および設定した後、各フレッシュカット後にブロック面の画像を撮影して保存し、重要な画像取得パラメータを記録します。イメージングセッションの終了時に、すべての画像ファイルをJPEG形式にエクスポートして変換し、適切な画像処理ソフトウェアを使用してすべての元の画像を反転させ、必要に応じて画像の明るさとコントラストを調整します。指示に従い、処理済みのすべての画像を3D可視化ソフトウェアにアップロードしてください。自動モードを使用してすべての画像をアライメントし、3Dおよび2Dの結果を表示します。これは、先ほど実演した方法で調製および撮影された、胚発生15.5日目のマウス胚のホールマウント表面観察の代表的な画像です。ウィスカーパッド（ひげパッド）や発達中の毛包を含む、皮膚の詳細な形態学的特徴を観察することができます。重要な点として、本手法で撮影した胎生15.5日目の標本の仮想切片像の解像度は、標準的な組織切片と同程度です。一連の手順に習熟すれば、適切に実施することで、透明化剤による前処理後の全工程を1週間で完了させることができます。本手順を行う際は、浸透および包埋のステップにおいて、染色液を4°Cで遮光保存することを忘れないでください。本手順に続き、スケール染色などの他の手法を実施することで、細胞型の特異的な分布パターンに関するさらなる疑問を明らかにすることが可能です。このビデオを視聴することで、生物試料の形態解析に向けた高解像度3D画像を取得するための研究室機器の使用方法について、十分に理解できたはずです。固定液、染色液、および浸透溶液の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施にあたっては、常にドラフトチャンバー内での操作や手袋の着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

rapid-acquisition-3d-images-using-high-resolution-episcopic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。...

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

オートファジーは、細胞がタンパク質や細胞小器官が低下し、リサイクルを可能にするユビキタスプロセスです。我々はautolysosomesに小さいが、オートファゴソームとリソソームの形成と流通を含むオートファジーの誘導に関連付けられている本質的な、物理的な変化、およびそれらの融合を可視化し、定量化するための高度な蛍光顕微鏡を適用します。...

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

生細胞内の動的タンパク質に関する時空間的な情報は、生物学を理解するために非常に重要です。高速3D構造化照明顕微鏡(f3D-SIM)と呼ばれる超解像顕微鏡の一種は、細菌の細胞動態Zリングに関するユニークな情報、つまりそのビーズ状の外観とリング内のFtsZの急速なダイナミクスの両方を明らかにします。...

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。...

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

私たちは、接着性、哺乳動物細胞におけるアクチン細胞骨格のイメージングに、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）、3次元の単一分子の局在超解像顕微鏡法の適用のためのプロトコルを提示します。このアプローチは、そうでなければ、従来の回折限界光学顕微鏡で未解決のままであるナノスケールの構造的特徴の光ベースの可視化を可能にします。...

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

我々は、高解像度腺鏡検査法を用いたデジタルボリュームデータの生成を可能にするために、様々な種の生検材料、生物医学モデル生物の胚および他の有機組織の試料を処理するための簡単で堅牢なプロトコルを提供する。...

高分解能断層顕微鏡（HREM） - 有機材料の処理および可視化のための簡単で堅牢なプロトコル

最近我々 は様々 なタンパク質の一次線毛による生細胞内透過輸送ルートの三次元 (3 D) 空間の場所を割り当てられます。ここで実験のセットアップ、生体試料のプロセスおよびアプローチを新しくイメージング 3 D...

ライブの一次繊毛で高速超解像顕微鏡の応用

このプロトコルは、生きた3次元イメージングのための細菌サンプルを調製し、マウントする方法と、それらの画像から大腸菌の三次元形状を再構築する方法を説明します。...

正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

ここでは、in toto光投影断層撮影法、多光子顕微鏡を用いたライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色によって得られた、軸方向の伸長およびセグメンテーションの文脈におけるマウス胚の3次元および4次元画像データの視覚化および解析を可能にする計算ツールおよび方法について説明する。...

脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。...

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

学ぶ 高解像度落射顕微鏡を用いたマウス胚の3次元画像取得法。標準的な実験機器で詳細な形態計測分析が可能となり、発生生物学研究に有用です。

高解像度落射顕微鏡を用いた3次元画像の迅速な取得

さらに動画を探す