高解像度落射顕微鏡を用いた3次元画像の迅速な取得

このプロトコルの全体的な目標は、標準的な実験装置を使用して、生体試料の高解像度3Dデジタル画像を迅速に取得することです。この手法は、複雑な形態学的特徴の可視化とダイナミクスを通じて、発生生物学の分野における重要な疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、標準的なラボ機器を使用し、最小限の事前経験を必要とすることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるJungang Huangです。テキストプロトコールに記載されているように胚を解剖および固定した後、固定液をクリア溶液に交換し、室温で1〜2週間ロッカー上で標本を静かに回転させます。インキュベーションの終わりに、標本を10%ホルマリンに移し、さらに2日間ロッカーに置いておきます。

3日目に、サンプルをPBSで5分間3回洗浄します。次に、室温で上昇エタノールシリーズのサンプルを、各濃度について2時間、穏やかなロッカーで脱水します。100%エタノール脱水後、試料を光から保護した染色溶液に1時間移します。

次に、溶液を新鮮な染色溶液と交換して、試料を一晩で標識します。翌朝、調製したばかりの浸潤溶液と染色溶液の1対1の容量混合物にサンプルを1対1の容量の混合物に、摂氏4度のロッカーで少なくとも3時間浸します。インキュベーションの終わりに、胚を浸潤溶液に移し、さらに3時間のロッキングインキュベーションを行います。

次に、上清を新鮮な浸潤液と交換し、摂氏4度でさらに3日間揺さぶります。4日目に、胚を埋め込み型に向け、型を氷の上に置きます。溶液Bを浸透液と混合し、金型を摂氏4度の冷包埋溶液に静かに沈めます。

約3時間後、チップを使用して溶液が固まったことを確認し、試料を金型から押し出します。余分な埋込み材をトリムし、新しい金型で試験片ブロックを交差方向に向き直します。次に、セットアップ全体をヒュームフードの氷の上に置きます。

金型が水没するまで、新しい金型に埋め込み溶液を静かに追加します。次に、型の上にブロックホルダーを置きます。3〜4時間後、埋め込み型をはがし、ブロックを斜め照明付きの実体顕微鏡の下に置き、ブロック内の試料の位置を決定します。

ブロック面で、試験片の周囲にグリッド線をマークし、その線をガイドとして使用して、余分な埋め込み材料をトリミングします。試料を画像化するには、まずブロックをミクロトームに固定し、試料の新鮮な表面カットを取得します。次に、実体ズーム顕微鏡を試料のブロック面に水平に向けて取り付け、顕微鏡と付属のコンピューターの電源を入れます。

次に、画像取得ソフトウェアを起動し、イメージングソフトウェアのライブビューモードを使用して、光学系をブロック面に焦点を合わせます。必要に応じて顕微鏡とミクロトームの位置を合わせ、ブロック面がファインダーの中央にくるようにします。この手順の最も重要なステップの1つは、ミクロトームの固定ホームポジションで画像を取得することです。

ズームを調整して、ブロック面全体が viewファインダー内にあります。次に、緑色の蛍光タンパク質フィルターを選択します。標本組織が現れるまでブロックのプレカットに進み、必要に応じて画像の焦点を合わせ直します。

露光時間を手動で測定および設定した後、各フレッシュカット後にブロック面の画像を取得して保存し、重要な画像取得パラメータを記録します。イメージングセッションの最後に、すべての画像ファイルをエクスポートしてJPEG形式に変換し、適切な画像処理ソフトウェアを使用してすべての元の画像を反転し、必要に応じて画像の明るさとコントラストを調整します。指示に従って、処理されたすべての画像を3D視覚化ソフトウェアにアップロードします。

自動モードを使用してすべての画像を整列し、3Dと2Dの結果を表示します。この代表的な画像は、15.5日目のマウス胚を調製し、示したばかりのように画像化した胚のホールマウント表面図です。ヒゲパッドや発育中の毛包など、皮膚の詳細な形態学的特徴を観察することができます。

重要なことに、この方法で画像化された胚の15.5日目標本の仮想断面図の解像度は、標準的な組織学的切片と類似しています。クリアリング溶液による前処理後の手順全体をマスターすると、適切に実行されれば、1週間で完了できます。この手順を試みる際には、浸潤および包埋ステップ中に染色液を光から4度で保護することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、スケール染色などの他の方法を実行して、細胞タイプの特定の分布パターンに関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、実験装置を使用して生物試料の高解像度3D画像を取得し、形態計測分析を行う方法について十分に理解できるはずです。固定液、染色液、浸潤液での作業は非常に危険であり、この手順を実行する際には、ドラフトでの操作や手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。