調製と

この手順の全体的な目的は、N-アシルエタノールアミン酸アミダーゼ（NAAA）に特異的な活性ベースプローブであるARN 14686の合成を示し、細胞抽出物および組織切片において触媒活性を持つ酵素を検出するためのその使用方法について説明することです。この手法は、炎症性疾患や神経変性疾患などの異なる生理学的および病理学的条件下におけるNAAAの活性化に関する知見を提供し、NAAAのin vivaにおける機能に関する疑問を解決するのに役立ちます。主な利点は、プローブとNAAAの反応後に簡単な操作を行うだけで済むため、酵素のin vivaにおける活性化状態に関する信頼性の高い情報を得られることです。

もう一つの利点は、特異的抗体とは異なり、本プローブが酵素の活性型のみを検出することであり、これは蛍光顕微鏡による状態観察に有用です。適切な合成から最終的なアプリケーションに至るまで、完全なストーリーを構築するために異なる専門知識を統合しているため、本手法を視覚的に実証することは極めて重要です。50 milliliterの丸底フラスコに、350 milligramsのundecynenolと3.5 millilitersの脱水ジクロロメタンを溶解させます。

次に、この溶液に25 milligramsのDMAPと530 milligramsのDPCを加えます。混合物を室温で16時間撹拌します。16時間後、溶液に20 millilitersのジクロロメタンを加えます。

混合液を分液漏斗に移します。15 millilitersの水を加えます。混合液を振り混ぜ、2層に分離させます。

次にストップコックを開き、底部の有機相を回収してストップコックを閉じ、有機相を分液漏斗に戻します。混合物に飽和重曹水（飽和炭酸水素ナトリウム溶液）15 millilitersを加えます。分液漏斗を振り、2つの相を分離させます。

有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、綿を用いて滴下漏斗付き丸底フラスコにろ過します。次に、エバポレーターを用いて減圧下で有機層を乾固させます。フラスコを量り、2-ピリジルウンデシニルカルボネートとウンデシノール-2-オキシピリジンカルボキシレートが1.7：1の比率で混合したオイルを600 mg得ます。

10 mLの丸底フラスコに、60 mgのoxo asetydenol ammonium asetateを2 mLの脱水ジクロロメタンに溶解させます。この溶液を氷浴で0 °Cまで冷却し、そこに81 µLのdiazapropalethylamineを滴下します。次に、undecynol two oxypyridine carboxylateを含む粗混合物350 mgを2 mLの脱水ジクロロメタンに溶解させます。

溶解した混合物を溶液に加え、室温で15時間撹拌します。その後、エバポレーターを用いて減圧下で溶媒を完全に留去します。自動カラムクロマトグラフィー装置を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、化合物を精製します。

まず、サンプルをシリカゲルに吸着させます。カラムをシクロヘキセンで平衡化した後、サンプルをカートリッジにロードします。シクロヘキサン中の酢酸エチルの比率を0から100まで変化させてサンプルを溶出し、各ピークを試験管に回収します。

エバポレーターを用いて減圧下で化合物に相当する分画の溶媒を完全に留去し、40 mgの白色固体を得ます。本文のプロトコルに従ってサンプルのプレクリアリングを行った後、5 mMのazide polyethylene glyco biotinストック溶液を11.3 µL加え、ボルテックスで混合します。次に、調製直後の50 mM TCEPストック溶液を11.3 µLサンプルに加え、ボルテックスで混合します。

1.7 mMの調製直後のTBTA作動液34 $\mu$Lと50 mMの硫酸銅ストック溶液11.3 $\mu$Lをあらかじめ混合し、この混合液45.3 $\mu$Lをサンプルに加えてボルテックスする。容器にはラベルを貼付すること。反応液を25℃で少なくとも2時間インキュベートする。

1時間インキュベートした後、タンパク質の沈殿を確認し、反応液を混合します。サンプルを4°Cで6,500 ×g、4分間遠心分離します。上清を除去した後、冷メタノール750 µLを加え、プローブ型ソニケーターを用いて5秒間超音波処理し、ペレットを再懸濁します。

次に、サンプルを4°Cで6,500 ×gで4分間遠心分離します。そして、注射器と針を用いて上清を除去します。冷メタノールでさらに2回洗浄した後、タンパク質ペレットに2.5% SDS含有PBSを325 µL加えます。

サンプルを5秒間、3回ソニケーションします。次に、サンプルを65 °Cで5分間加熱します。ソニケーション後、サンプルを室温で6,500 ×g、5分間遠心分離します。

その後、上清を清潔な15 milliliterチューブに移し、PBSを1.4 milliliters加えてSDS濃度を0.5 %に希釈します。ストレプトアビジン濃縮を行う場合は、まずPBSを用いてサンプルの容量を4.2 millilitersにします。次に、先端を切断したチップを用いて、事前に洗浄したストレプトアビジンアガロースの50%スラリーを40 microliters加えます。

混合液を室温で2時間、回転させながらインキュベートします。1,400 ×gで2分間遠心分離した後、ビーズペレットを乾燥させないように上清を除去します。残った上清を用いてビーズを1 mLのスピンカラムに移し、1% SDS含有PBS 1 mLを用いてカラムを重力ろ過で洗浄します。

テキストプロトコルに従い、6 M ureaでビーズの洗浄を続け、その後PBSで洗浄します。次に、500 µLのPBSを用いて、洗浄したビーズを1.5 mLチューブに移します。サンプルを1,400 ×gで2分間遠心分離した後、シリンジと針を用いて上清を静かに吸引します。

レジンに結合したタンパク質を溶出させるため、レジンペレットに25 µLの溶出バッファーを加え、室温で15分間、続いて95 °Cで15分間インキュベートします。テキストプロトコルに従って調製した組織切片に、約400 µLのクリックケミストリーミックスを加えます。その際、選択したクリックケミストリーミックスの量が、切片を十分に覆う量であることを確認してください。

その後、組織切片を室温かつ遮光条件下で1時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをPBSで5分間洗浄し、続いて冷メタノールで5分間洗浄します。次に、1% Tween 20および0.5 mM EDTAを含むPBS溶液を用いて、組織切片を2分間ずつ3回洗浄します。

最後に、スライスをPBSでさらに5分間洗浄します。風乾後、DAPI含有抗退色封入剤を1滴加えます。カバーガラスでサンプルを閉じ、ネイルポリッシュで密封します。

プローブ合成のため、触媒量の4-ジメチルアミノピリジンの存在下で、ジピリジルカーボネートを用いてウンデシノールを活性化し、混合炭酸エステルを生成させます。これをアミノラクタムと反応させます。プローブの頭部であるβ-ラクタムがNAAAの活性部位と反応し、末端アルキンはクリックケミストリーを介してレポータータグで機能化することが可能です。ARN 14686を用い、プロテインブロッキングによってラットの炎症を起こした足の細胞抽出物中のNAAA活性を検出しました。ナイーブラットでは、NAAAシグナルは検出されませんでした。

逆に、完全フロイントアジュバントで処理したラットでは、活性型NAAAに対応する顕著なバンドが観察されます。ARN 14686のもう一つの応用例は、蛍光顕微鏡による組織イメージングです。ここでは、赤色の細胞が活性型NAAA陽性の肺胞マクロファージを示しています。

NAAAは、高倍率で観察できるように、拡散した小胞構造に局在しています。このビデオを視聴することで、タンパク質ブロットおよび蛍光顕微鏡の両方を用いて組織中の活性型NAAAを検出するためのARN 14686の合成および使用方法について十分に理解できるはずです。さらに、このプロトコルは特定のターゲット向けですが、ここで説明するプローブの応用方法は、NAAA以外のターゲットに特異的な異なる活性ベースプローブに合わせて容易に調整することが可能です。