調製とインビボアクティビティベースのプローブの使用のために N -acylethanolamine酸アミダーゼ

ここでは、アクティビティベースのプローブの調製および使用を記載する（ARN14686、ウンデカ-10- ynyl- N - [（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバメート）の検出および定量を可能にします前炎症性酵素Nの活性形態は、in vitroおよびex vivoの両方、酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine。

この手順の全体的な目標は、N-アシルエタノールアミン酸アミダーゼ(NAAA)に特異的な活性ベースのプローブであるARN 14 six eight sixの合成を示し、細胞抽出物および組織切片中の触媒活性酵素を検出するためのその使用を説明することです。この方法は、NAAAの生体内機能に関する質問に答えるのに役立ち、炎症性疾患や神経変性疾患などのさまざまな生理学的および病理学的状態におけるNAAAの活性化に関する洞察を提供します。その主な利点は、プローブによるNAAA反応の後に簡単な操作が行われるため、酵素の生体活性化状態に関する信頼性の高い情報が得られることです。

もう一つの利点は、特異的抗体とは対照的に、当社のプローブは活性型の酵素のみを検出するため、蛍光顕微鏡の状態に有用であることです。この手法は、適切な合成から最終的なアプリケーションまでの完全なストーリーまで築き上げられたさまざまな専門知識を組み合わせるため、視覚的なデモンストレーションが重要です。50ミリリットルの丸底フラスコに350ミリグラムのウンデシネノールと3ポイント5ミリリットルの乾燥ジクロロメタンを溶解します。

次に、この溶液に25ミリグラムのDMAPと530ミリグラムのDPCを追加します。混合物を室温で16時間攪拌します。16時間後、溶液に20ミリリットルのジクロロメタンを加えます。

混合物を分離漏斗に移します。15ミリリットルの水を追加します。混合物を振って、2つのフェーズを分離させます。

次に、活栓を開き、底に有機相を収集し、活栓を閉じて、有機相を漏斗に戻します。混合物に15ミリリットルの飽和重炭酸ナトリウム溶液を加えます。分離漏斗を振って、2つのフェーズを分離させます。

有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、綿を通してそれを層状の丸底フラスコにろ過します。次に、ロータリーエバポレーターを使用して、減圧下で有機層を蒸発させて乾燥させます。フラスコの重量を量り、2つのピリジルウンデシニル炭酸塩とウンデシノール2つのオキシピリジンカルボン酸塩の混合物である600ミリグラムのオイルを1ポイント7対1の比率で取得します。

10ミリリットルの丸底フラスコに、60ミリグラムのオキソアセチデノールアセチデノールアセチン酸アンモニウムを2ミリリットルの乾燥ジクロロメタンに溶解します。氷浴で溶液を摂氏0度に冷却し、81マイクロリットルのジアザプロパレチルアミンを滴下します。次に、カルボン酸ウンデシノール2オキシピリジンを含有する粗混合物350ミリグラムを2ミリリットルの乾燥ジクロロメタンに溶解する。

溶解した混合物を溶液に加え、室温で15時間撹拌します。次に、ロータリーエバポレーターを使用して、減圧下で溶媒を蒸発させて乾燥させます。自動カラムクロマトグラフィー装置を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより化合物を精製します。

まず、サンプルをシリカゲルに吸収します。カラムをシクロヘキセンで平衡化した後、サンプルをカートリッジにロードします。シクロヘキサン中の酢酸エチルでサンプルを0から100まで溶出し、ピークを試験管に集めます。

ロータリーエバポレーターを使用して、化合物に対応する画分の溶媒を減圧下で乾燥させて蒸発させ、40ミリグラムの白色固体を得る。テキストプロトコルに記載されているようにサンプルを事前に清澄化した後、アジドポリエチレン、グリコビオチン、およびボルテックスの5ミリモルストックの11ポイント3マイクロリットルを追加します。次に、新たに調製したTCEPの50ミリモルストックの11ポイント3マイクロリットルをサンプルとボルテックスに加えます。

1ポイント7ミリモルTBTAの新たに調製された作業溶液34マイクロリットルを11ポイント3マイクロリットルの50ミリモル硫酸銅ストックと予備混合した後、この溶液の45ポイント3ミリリットルをサンプルとボルテックスに加えます。ラベル付きコンテナを使用します。反応を摂氏25度で少なくとも2時間インキュベー

1時間のインキュベーション後、タンパク質の沈殿を観察し、反応を混合します。サンプルを摂氏4度でGの6,500倍で4分間遠心分離します。上清を取り除いた後、750マイクロリットルの冷たいメタノールを加え、プローブソニケーターを使用して5秒間超音波処理することによりペレットを再懸濁します。

次に、サンプルを摂氏4度でGの6,500倍で4分間遠心分離します。そして、注射器と針で上澄みを取り除きます。コールドメタノールでさらに2回洗浄した後、PBS中の325マイクロリットルの2ポイント5パーセントSDSをタンパク質ペレットに加えます。

サンプルを5秒間3回超音波処理します。次に、サンプルを摂氏65度で5分間加熱します。超音波処理後、室温でGの6,500倍でサンプルを5分間遠心分離します。

次に、上清をきれいな15ミリリットルのチューブに移し、上清に1ポイント4ミリリットルのPBSを追加して、SDS濃度をゼロポイント5パーセントに希釈します。ストレプトアビジン濃縮のためには、まずサンプルの量をPBSで4ポイント2ミリリットルにします。次に、カットエンドチップを使用して、事前に洗浄したストレプトアビジンアガロースの50%スラリーを40マイクロリットル加えます。

混合物を室温で2時間インキュベートし、回転させます。1,400回Gで2分間遠心分離した後、ビーズペレットを乾燥させずに上清液を除去する。残留上清を使用してビーズを1ミリリットルのスピンカラムに移し、PBS中の1ミリリットルの1パーセントSDSでカラムを重力で洗浄します。

6モル尿素でビーズを洗浄し続け、続いてテキストプロトコルで説明されているようにPBSで洗浄します。次に、500マイクロリットルのPBSを使用して、洗浄したビーズを1ポイント5ミリリットルのチューブに移します。サンプルを1,400倍Gで2分間遠心分離した後、上清をシリンジと針で穏やかに吸引します。

レジン結合タンパク質を溶出するには、レジンペレットに25マイクロリットルの溶出バッファーを添加し、室温で15分間インキュベートした後、95°Cで15分間インキュベートします。約400マイクロリットルのクリックケミストリーミックスを、テキストプロトコルに従って調製した組織スライスに加えます。選択したクリックケミストリーミックスの量がスライスを覆うのに十分であることに注意してください。

次に、光から保護された室温で組織スライスを1時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをPBSで5分間洗浄し、次に冷メタノールで5分間洗浄します。次に、ティッシュスライスを1%Tween 20とゼロポイント5ミリモルEDTAのPBS溶液で2分間3回洗浄します。

最後に、スライスをもう一度PBSで5分間洗います。風乾後、DAPIで色あせ防止剤を一滴加えます。サンプルをカバースリップで閉じ、ポリッシュで密封します。

プローブ合成では、ウンデシネノールは、触媒的な4つのジメチルアミン酸ピリジンの存在下でジピリジルカーボネートによって活性化され、混合炭酸塩が生成され、その後、アメンニルラクタムと反応し、ベータラクタムまたはプローブの頭部はNAAA活性部位と反応し、末端アルキンはクリックケミストリーを介してレポータータグで官能基化できます。ARN 14 six eight sixは、タンパク質ブロックによりラットの炎症を起こした足の細胞抽出物中のNAAA活性化を検出するために使用されました。ナイーブラットでは、NAAAシグナルは検出されません。

逆に、完全なフロイントアジュバントで処理されたラットでは、活性NAAAに対応する顕著なバンドが観察されます。.ARN 14 six eight sixの別の用途は、蛍光顕微鏡による組織イメージングです。ここで、赤血球は、活性NAAAに陽性の肺胞マクロファージを表しています。

NAAAは、より高い倍率で認識できるように拡散した小胞構造に局在しています。このビデオを見れば、タンパク質ブロットと蛍光顕微鏡の両方で、ARN 14、シックス、エイトシックスを合成し、組織内の活性NAAAを検出する方法について、よく理解できるはずです。さらに、このプロトコルはターゲットに固有のものですが、ここで説明するプローブアプリケーションは、NAAA以外のターゲットに固有のさまざまなアクティビティベースのプローブに対して簡単に調整できます。