Name: 調製とインビボアクティビティベースのプローブの使用のために N -acylethanolamine酸アミダーゼ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学ぶNAAA活性型検出法。ARN14686プローブの合成とインビボ応用を解説。炎症・神経変性疾患における酵素活性状態の可視化に有用で、従来抗体法より正確な情報を提供する革新的アプローチです。

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著者は、イタリア、ジェノバのIstituto Italiano di Tecnologiaにあるニコンイメージングセンターに感謝します（イタリア（NIC@IIT。

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著者らは開示するものは何もない。

酵素活性は、微RNA転写、タンパク質合成、タンパク質の転座、翻訳後修飾、およびタンパク質 - タンパク質相互作用を含む種々のレベルで調節されます。多くの場合、単独の酵素の発現は、その活性を考慮していません。 ABPPは、その天然の状態でタンパク質の活性を研究するために開発されました。二つの機能が必要とされている：共有結合プローブで標識された酵素を検出するために、興味のある酵素の活性部位とレポータータグに結合する化学プローブを。 プローブ設計と合成は、手順の重要なポイントです。プローブは、その標的に対する十分な親和性と選択性を持っている必要があります。また、レポータータグの存在は、目標係に影響を及ぼしてはなりません。この問題は、大部分は、ターゲットが捕捉された後のレポータータグが導入された二段ABPの設計によって克服されます。タグを含まないプローブは、 インビボ研究のために特に適しているタンパク質の活性最小限の外部の変化と、生きた細胞または生物で評価することができます。 NAAAプローブARN14686は、上記で概説した要件を満たすように設計されました。 βラクタム...

一般的に使用される発現パターン、相互作用、及びショットガン分析1,2のための液体クロマトグラフィー-質量分析プラットフォームを含むタンパク質の機能を調査する方法、酵母ツーハイブリッド法3,4、およびインビトロアッセイにおいて 、それらがあることで制限されていますその天然の状態でタンパク質の活性を評価することができません。活性に基づくタンパク質プロファイリング（ABPP）は、このギャップを埋めるために使用することができます。このアプローチでは、共有結合的に目的の酵素の活性部位に結合することができる小分子プローブは、標的検出を可能にするレポーター基に結合しています。クリックケミストリー（CC）を使用して、レポータープローブに組み込むことができ、または標的係合5,6を発生した後に導入することができます。後者の手順は、SUCバイオ直交反応を介してレポーター試薬の数に変更することができ、そのような末端アルキンまたはアジドなどの適切な化学基を含有するプローブの使用を必要としますCu（I）などのhはヒュイゲン[3 + 2]環7-9またはシュタウディンガーライゲーション10,11 -触媒。 最近、我々は、in vitroでの最初のABPとしてシステイン加水分解酵素、NAAA 12のインビボでの検出中の化合物ARN14686を開示しました。 NAAAは、抗炎症性核内受容体PPAR-α13-15の内因性アゴニストであるオレオイルエタノールアミド（OEA）とパルミトイルエタノールアミド（PEA）を含む飽和および一価不飽和のFAE、の加水分解不活性化を触媒します。 NAAAは、主に先天性免疫応答の調節における役割を示唆し、ならびにBリンパ球14,16のように、マクロファージおよび他の単球由来細胞において発現されます。酵素は不活性型の粗面小胞体で合成され、自己タンパク質分解機構17によって、細胞の酸性区画において活性化されます。自己タンパク質分解切断は、新しいN末端システイン（C13を生成し、マウスおよびラットにおける1、ヒトにおけるC126）、すなわちFAE加水分解18,19のための求核責任があります。 NAAA活性の薬理学的阻害は、のFAE 16,20,21の増加細胞レベルの賛成でFAE合成/分解のバランスを変化させます。いくつかのβラクトンおよびβラクタム誘導体は高い効力および選択16,22-26でNAAA活性を阻害することが示されています。これらの阻害剤は、触媒システイン16,27,28 のS -acylationを介して作用します。 （ - [（S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバミン酸4- cyclohexylbutyl- N）16化合物ARN14686は全身活性、セリン由来βラクタムNAAA阻害剤の化学構造、ARN726に基づいて設計しました。 ARN726の4-t-ブチルシクロヘキシル基は、アジドベアリングレポータータグとその後のCCのコンジュゲートのための末端アルキンタグを担持するC9飽和脂肪族鎖で置換しました。私たちは、minimallに2段階のABPを設計することにしましたyはこのようにNAAAに対するプローブの親和性を維持し、元の足場の構造を変更します。また、かさばるタグの導入を避け、そのようなプローブは、直接ABPよりin vivoでの治療のためのより適切である可能性があります。 ARN14686は、酵素12の触媒システインと共有結合付加物を形成することにより、高い効力を有するNAAA（hNAAA IC 50 = 6 nMで、rNAAA IC 50 = 13 nM）を阻害します。生きたラットの実験では、プローブは、NAAAは肺で発現撮影において選択的であることが示されました。高いプローブ濃度（ インビトロでの 10μM、10ミリグラム/静脈、静脈ミリリットル）12を使用する際に酸セラミダーゼ、NAAAと33-34％の同一性を共有する他のシステインアミダーゼは、低親和性標的として同定されました。我々はまた、完全フロイントアジュバント（CFA）29の投与後の炎症を起こしたラット組織における活性NAAAの存在を研究するためにARN14686を使用しています。 ここでは、preparatiためのプロトコルの概要を説明します（ 図1）及びex vivoで NAAA活性化の調査への応用ARN14686の上。例として、我々は、CFA投与後のラットの足でNAAAを可視化する実験手順を説明します。この実験では、タンパク質は、プローブの静脈注射後の足の組織から抽出され、ABP標識プロテオームは、ビオチンアジドとCCに供されます。ビオチン化されたサンプルは、ストレプトアビジンビーズを使用して濃縮され、そしてタンパク質ブロットが行われます。別のアプリケーションでは、我々は、プローブ処置マウスからのマウスの肺における蛍光顕微鏡により活性NAAAの局在化を説明します。この場合には、組織を切片化し、切片をローダミン添加用CCに供されます。ワークフロー方式は、図2に示されています。

<table><tbody><tr><td>1,1'-スルホンニルジイミダゾール&nbsp;</td><td>シグマAldrich</td><td>367818</td><td>有害な</td></tr><tr><td>2-ジピリジルカーボネー</td><td>トFluorochem</td><td>11331</td><td></td></tr>有害な<tr><td>2-メチルブタン</td><td>シグマAldrich</td><td>M32631</td><td>可燃性、有毒、水生環境に有害</td></tr><tr><td>4-(ジメチルアミノ)ピリジン</td><td>シグマAldrich</td><td>107700</td><td></td></tr>有毒<tr><td>な酢酸</td><td>シグマAldrich</td><td>695092</td><td>可燃性、腐食性</td></tr><tr><td>アセトニトリル&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>34998</td><td>可燃性、有毒</td></tr><tr><td>な活性炭</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A9434</td><td>有害な</td></tr><tr><td>アジド-PEG3-ビオチン</td><td>イエナ・バイオサイエンス</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>アジド-PEG3-フルオロ 545</td><td>イエナ・バイオサイエンス</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>BCA タンパク質アッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>バイオスピンカラム</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>高毒性</td></tr><tr><td>ボビン血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>健康被害</td></tr><tr><td>セリック硝酸アンモニウム&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td>酸化<td>性、有害な</td></tr><tr><td>クロラール水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td>高毒性</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>209198</td><td>有毒</td></tr>な<tr><td>シクロヘキサジエン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>125415</td><td>可燃性、健康被害</td></tr><tr><td>シクロヘキサン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>34855</td><td>可燃性、有害、健康被害、環境被害</td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>34856</td><td>有害、健康被害</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td>296082 可燃性、有害な</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>アクロス有機物348441000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシドd6(DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>可燃性、有害な</td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>可燃性、有害な</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptavidin&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>使用前に簡単に遠心分離してタンパク質複合体を沈殿させる</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>高毒性</td></tr>メタ<tr><td>ノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>可燃性、毒性、健康被害</td></tr><tr><td>N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N&prime;-エチルカルボジイミド塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>有害、腐食性</td></tr><tr><td>N,N-ジイソプロピルエチルアミン</td><td>Σ Aldrich</td><td>D125806</td><td>可燃性、腐食性、毒性</td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>可燃性、有害、健康被害</td></tr> <tr><td>N-CBZ-L-Serine</td><td>Fluorochem</td><td>M03053</td><td>有害な</td></tr><tr><td>ニコン A1 共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>取扱説明書を読む</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>パラジウム・オン・カーボン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-アニシジン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A88255</td><td>毒性, 健康被害, 環境ハザード</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>441244</td><td>有毒、呼吸器系有害、腐食性、反証可能な</td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 色あせ防止マウンタント DAPI付き&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36931</td>気<td>泡形成を避ける</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>S6014</td><td></td></tr>ド<tr><td>デシル硫酸ナトリウム(SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>有毒、腐食性、反発性</td></tr><tr><td>水素化ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>452912 可燃性</td></tr><tr><td>硫酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 immage scanner</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>Read&nbsp; 取扱説明書</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン アガロース</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tert-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>有毒で可燃性の</td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>186562</td><td>可燃性、有害、健康被害</td></tr><tr><td>チオ尿素ア</td><td>クロス オーガニック</td><td>424542500</td><td>有毒で、50°Cで暖かい。トリスを溶解するC</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>Aldrich RDD008</td><td></td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 塩基性組織ホモジナイザー</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>有害</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>有毒、50°Cで暖かい;Cを溶解する</td></tr></tbody></table>

調製と<em&gt;インビボ</em&gt;アクティビティベースのプローブの使用のために<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine酸アミダーゼ

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

活性に基づくタンパク質プロファイリング（ABPP）は、酵素の活性部位を標的とする化学的プローブの使用を介して複雑なプロテオームにおける目的の酵素を同定するための方法です。プローブに導入されたレポータータグは、ゲル内蛍光スキャニング、タンパク質ブロット、蛍光顕微鏡、または液体クロマトグラフィー - 質量分析法による酵素標識の検出を可能にします。ここでは、化合物のARN14686、選択的にNが酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine酵素を認識し、クリックケミストリーアクティビティベースのプローブ（CC-ABP）の製造および使用を記載します。 NAAAは、パルミトイルエタノールアミド（PEA）及びオレオイルエタノールアミド（OEA）などの内因性ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR） - アルファアゴニストを非活性化することによって炎症を促進するシステイン加水分解酵素です。 NAAAは、リソソームの酸性pHで自己タンパク質分解によって活性化される不活性な完全長プロ酵素として合成されます。ローカリゼーション研究の時間AVEは、NAAAは、主にマクロファージおよび他の単球由来細胞における、並びにBリンパ球で発現されることを示します。我々はARN14686タンパク質ブロット、蛍光顕微鏡によりげっ歯類組織において活性NAAA エクスビボの検出および定量化するために使用できる方法の例を提供します。

ARN14686はNAAA阻害剤ARN726の足場に基づいて設計されました。 ARN726の4-t-ブチル-シクロヘキシル基は、C9の飽和脂肪族鎖は、末端アルキンタグ（ 図1）を有する基で置換しました。アルキンタグは、フルオロフォアまたはCCを介してビオチン分子を追加するために二段階標識化手順の使用を可能にするために導入されました。この機能は、in vitroおよびin vivoで NAAAを調査するために非常に汎用性の高いツールをARN14686レンダリングします。 ここでは、この分子の潜在的なの代表的なものであるARN14686の二つのアプリケーションを示す。 図2は、ここで報告された実験手順のスキームです。プローブの静脈内投与した後、二つの異なる検出方法を使用することができる：タンパク質ブロットによるアクティブNAAA式のⅰ...

ここでは、アクティビティベースのプローブの調製および使用を記載する（ARN14686、ウンデカ-10- ynyl- N - [（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバメート）の検出および定量を可能にします前炎症性酵素Nの活性形態は、in vitroおよびex vivoの両方、酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine。

調製と<em&gt;インビボ</em&gt;アクティビティベースのプローブの使用のために<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine酸アミダーゼ

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

この手順の全体的な目的は、N-アシルエタノールアミン酸アミダーゼ（NAAA）に特異的な活性ベースプローブであるARN 14686の合成を示し、細胞抽出物および組織切片において触媒活性を持つ酵素を検出するためのその使用方法について説明することです。この手法は、炎症性疾患や神経変性疾患などの異なる生理学的および病理学的条件下におけるNAAAの活性化に関する知見を提供し、NAAAのin vivaにおける機能に関する疑問を解決するのに役立ちます。主な利点は、プローブとNAAAの反応後に簡単な操作を行うだけで済むため、酵素のin vivaにおける活性化状態に関する信頼性の高い情報を得られることです。もう一つの利点は、特異的抗体とは異なり、本プローブが酵素の活性型のみを検出することであり、これは蛍光顕微鏡による状態観察に有用です。適切な合成から最終的なアプリケーションに至るまで、完全なストーリーを構築するために異なる専門知識を統合しているため、本手法を視覚的に実証することは極めて重要です。50 milliliterの丸底フラスコに、350 milligramsのundecynenolと3.5 millilitersの脱水ジクロロメタンを溶解させます。次に、この溶液に25 milligramsのDMAPと530 milligramsのDPCを加えます。混合物を室温で16時間撹拌します。16時間後、溶液に20 millilitersのジクロロメタンを加えます。混合液を分液漏斗に移します。15 millilitersの水を加えます。混合液を振り混ぜ、2層に分離させます。次にストップコックを開き、底部の有機相を回収してストップコックを閉じ、有機相を分液漏斗に戻します。混合物に飽和重曹水（飽和炭酸水素ナトリウム溶液）15 millilitersを加えます。分液漏斗を振り、2つの相を分離させます。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、綿を用いて滴下漏斗付き丸底フラスコにろ過します。次に、エバポレーターを用いて減圧下で有機層を乾固させます。フラスコを量り、2-ピリジルウンデシニルカルボネートとウンデシノール-2-オキシピリジンカルボキシレートが1.7：1の比率で混合したオイルを600 mg得ます。10 mLの丸底フラスコに、60 mgのoxo asetydenol ammonium asetateを2 mLの脱水ジクロロメタンに溶解させます。この溶液を氷浴で0 °Cまで冷却し、そこに81 µLのdiazapropalethylamineを滴下します。次に、undecynol two oxypyridine carboxylateを含む粗混合物350 mgを2 mLの脱水ジクロロメタンに溶解させます。溶解した混合物を溶液に加え、室温で15時間撹拌します。その後、エバポレーターを用いて減

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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学ぶNAAA活性型検出法。ARN14686プローブの合成とインビボ応用を解説。炎症・神経変性疾患における酵素活性状態の可視化に有用で、従来抗体法より正確な情報を提供する革新的アプローチです。

調製と

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