脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

この方法の全体的な目標は、薄層クロマトグラフィーとHPLCを使用して、好中球細胞外トラップの放出中の好中球の脂質組成の変化を調べることです。この方法は、好中球細胞外トラップの形成、または略してNET形成に関与するメカニズムについて、より詳細な情報を得るために使用することができます。この手順の主な利点は、わかりやすいプロトコルを利用して、好中球の一般的な機能における脂質の役割に関する情報を提供することです。

ヒト血液由来細胞の単離は、私たちの研究室の元博士課程の学生であるAriane Neumannによって実証されます。そして、彼女はフリーデリケ・ロイナーによって支援されます。脂質分析のための細胞の調製は、私の研究室のポスドクであるGraham Brogdenと生化学プログラムの修士課程の学生であるDiab Huseinによって実証されます。

ヒトの血液由来好中球を分離するには、約20 mLの血液を、炎の近くの20 mLのジアトリゾエート/デキストランナトリウム溶液に混合せずに重ねます。.ブレーキをかけずに470倍gで30分間遠心分離します。血液相と溶液中の密度グレードを混合しないことが重要です。

遠心分離ステップと単核細胞の後、細胞の汚染や非特異的な活性化を避けるために、単核細胞を慎重に除去する必要があります。単核細胞と黄色がかった血漿層を取り除きます。多形核細胞(PMN相)を新しい50 mLチューブに移し、1Xリン酸緩衝生理食塩水で最大50 mLを満たします。

ブレーキをかけながら、サンプルを470 gで10分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、ペレットを5mLの滅菌水に5秒間再懸濁して赤血球を溶解します。すぐにチューブを1X PBSで50 mLまで満たし、サンプルを遠心分離します。

上清を取り除くと、ペレットは白くなるはずです。それでも赤の場合は、これらの手順を繰り返します。次に、ペレットを1000マイクロリットルのロズウェルパークメモリアルインスティテュート、またはRPMI培地に再懸濁します。

Trypan Blue染色と光学顕微鏡下での血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。RPMIで細胞懸濁液を調製し、1mLあたり200万個の細胞濃度で調製します。20mLの血液から約2,500万個の好中球を採取できます。

脂質分析のために好中球を薬理学的に治療するには、調製した細胞の1500万を使用します。反応チューブ内でサンプルを摂氏37度、二酸化炭素5%で2時間インキュベートします。サンプルの遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを300マイクロリットルのHBSSに再懸濁します。

同じパラメータを使用してサンプルを再度遠心分離した後、細胞ペレットを1:1クロロホルム:メタノール溶液1 mLに再懸濁します。次に、再懸濁したペレットを26ゲージのカニューレで、サンプルを1mLシリンジに10回出し入れしてホモジナイズします。ヒト末梢血由来好中球から脂質を単離するには、調製した好中球を採取し、氷の上に置きます。

好中球をPTFEシール付きの15mLスクリューキャップガラスチューブにピペットで移し、1分間振とうして均質化します。次に、2 mLのメタノールを加え、1分後に1 mLのクロロホルムを加えます。さらに1分間振とうした後、ガラス管を室温、50rpmで30分間回転させます。

次に、溶液を摂氏7度および1,952倍gで10分間遠心分離することにより、タンパク質画分をペレット化する。上清を新しい15 mLガラス製スクリューキャップチューブに慎重にデカントし、タンパク質含有ペレットを残します。将来の定量のために、ペレットを摂氏20度で保存します。

クロロホルム1mLを加え、1分間待ちます。次に、1 mLの二重蒸留水を加え、サンプルと一緒にガラス製スクリューキャップチューブを30秒間反転させます。前と同じようにサンプルを遠心分離した後、上相を曇った層を含まないまで取り除いて廃棄します。

サンプルを真空濃縮器で摂氏60度で乾燥させ、必要になるまで摂氏20度で保存します。まず、対応するガラスチャンバーに各溶液を最大5mL充填します。各チャンバーの走行速度を上げるために、あらゆる種類の濾紙を追加します。

20x10cm HPTLC シリカゲル 60 ガラスプレートを最初の溶液で事前にインキュベートします。ランニング溶液がプレートの上部に到達したら、摂氏110度で10分間乾燥させます。真空濃縮器で乾燥させておいた脂質ペレットを所望量の1:1クロロホルム:メタノール溶液に溶解し、37°Cで15分間インキュベートして溶解します。

次に、定規と柔らかい鉛筆を使用して、必要なサンプル数と少なくとも1つの標準試料のローディングスポットをマークします。最初のランニング溶液の場合は約4 cm、2番目のランニング溶液の場合は約6 cmで走行距離をマークします。サンプルをロードするには、新しいサンプルをロードする前に、10マイクロリットルのシリンジを1:1クロロホルム:メタノールで3回洗浄します。

各サンプルの10マイクロリットルをドロップワイズにロードし、サンプルをできるだけ小さな領域に集中させようとします。プレートを最初のチャンバーに垂直に置き、溶液1を実行します。プレートがガラスチャンバーの壁と平行になっていることを確認して、均一な移動速度を実現します。

プレートがガラスチャンバーの後壁と平行に配置され、脂質が効率的に分離されるように、溶媒の前面が行き過ぎないように注意してください。溶媒ラインが最初のマークに達したら、プレートを取り外して乾燥させ、2番目の溶液に入れます。2 番目と 3 番目の実行中のソリューションについても、同様の手順を繰り返します。

溶媒の前面がプレートの上部に達するまで、プレートを溶液に入れたままにします。その後、プレートを取り出し、室温で1分間乾燥させます。プレートを硫酸銅溶液に7秒間置きます。

皿を十分に乾かした後、170°Cのオーブンで7分間焼きます。プレートをオーブンから取り出し、冷まします。HPLCを行うには、カラムを装置のガードカートリッジに取り付け、32°Cに加熱します。

移動相としてメタノールを1 mL/分、65 barの流速で使用します。UV検出器を202ナノメートルで測定するように設定して、各サンプル中のコレステロール量を定量化します。サンプルを分析する前にHPLCマシンを十分に洗浄し、テキストプロトコルに記載されているようにコレステロール標準曲線を確立します。

最後に、サンプルを琥珀色の1.5 mLガラス瓶に入れた500マイクロリットルの1:1クロロホルム:メタノールに再懸濁し、スクリュートップの赤色PTFE/白色シリコン蓋を付けてから、HPLC装置にロードします。ここに示されているのは、HPTLCプレート上の好中球の脂質プロファイルです。脂質は、移動距離を標準と比較することで同定できます。

また、2 つの大きなピークを示す HPLC クロマトグラムも示されています。2分直前の最初のピークはクロロホルムです。5分後の2番目の大きなピークはコレステロールです。

ここに示されているのは、HPLCとHPTLCによって決定されたコレステロール標準曲線です。HPLCによって得られる標準曲線は、HPTLC標準曲線と比較して、より広い濃度範囲にわたって線形です。このビデオを見れば、ヒトの血液由来好中球を単離し、その後、その脂質組成を分析する方法について十分に理解できるはずです。

この手順を試行している間は、危険なクロロホルム:メタノールへの曝露から手を保護し、ヒュームフードの下で作業するために、ニトリル手袋を着用することを忘れないでください。今後の実験では、NET形成に関与するメカニズムや一般的な好中球機能について、まだ完全には解明されていないさらなる情報が得られるでしょう。ヒトの血液由来の初代細胞を扱うには、倫理的な許可と、ヒトの病原体へのリスクにさらされないように、それぞれのバイオセーフティラボで働くなどの適切な安全対策が必要であることを忘れないでください。

最後に、私たちの研究の目的は、自然免疫系に基づく感染症に対する新しい治療標的を見つけることであり、特に脂質組成は、好中球が感染症に対して抗菌薬として作用している理由を理解するのに役立つため、私たちにとって非常に興味深いものです。