ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

修飾クロマチン免疫沈降法およびDNAスーパーコイリング実験の全体的な目標は、ヒト細胞の化学療法剤または発がん性物質によって誘発される部位特異的DNA損傷に対する構造タンパク質によって誘発される関連およびその後のトポロジカル修飾を研究することです。この方法論により、DNAの損傷と修復に関する重要な問題に対処することができ、がん治療のための新しい薬理学的標的の発見が促進されるはずです。私たちの技術により、部位特異的なDNA損傷を指示することができ、ヒトのがんに関連する重要なDNA修復プロセスの評価が容易になります。

まず、トランスフェクションの24時間前に、抗生物質なしで10%FBSを補給したDMEMで、60ミリメートル皿あたり400,000個の哺乳動物細胞をプレートします。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。14ミリリットルの丸底チューブに、30マイクロリットルの室温トランスフェクショナリー剤と、摂氏37度に温めた500マイクロリットルの1X成長培地を組み合わせます。

2本目のチューブで、2マイクログラムのTFO指向性ICL含有プラスミドを500マイクロリットルの1X増殖培地に混合します。チューブを室温で10分間インキュベートします。ミックス1とミックス2を組み合わせ、ピペットで上下に動かしてよく混ぜます。

次に、溶液を室温で25〜30分間インキュベートします。次に、温かいPBSを使用して細胞を2回洗います。次に、トランスフェクションミックスを滴下し、溶液を細胞プレート全体に均一に分配します。

プレートに1ミリリットルの成長培地を追加し、最終容量を2ミリリットルにします。よく混ぜ合わせ、培養プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%に置きます。4時間後、培地を10%FBSを含む3ミリリットルの成長培地と交換し、さらに16時間インキュベートします。

インキュベーション後、プレートあたり80マイクロリットルの新鮮な37%ホルムアルデヒドを細胞に加え、室温で暗所で10分間インキュベートします。1プレートあたり300 μLの冷却グリシンを添加してホルムアルデヒド架橋をクエンチし、5分間インキュベートします。次に、メディウムを取り出し、冷やしたPBSを使用してプレートを2回洗います。

次に、冷やしたPBSを1mm加えた後、サンプルを常に氷上に保持しながら、氷上の微量遠心チューブに掻き込んで細胞を回収します。細胞ペレットを13倍、Gの400倍、摂氏4度で5分間遠心分離して調製します。次に、上清を取り除き、ペレットを氷の上に置きます。

1ミリリットルの冷却バッファーAを使用してペレットを均一に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。次に、前と同じように細胞をペレット化します。次に、1ミリリットルの冷却バッファーBでペレットを均一に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートし、時折反転させて混合します。

次に、前と同じように細胞をペレット化します。細胞を再び懸濁した後、200マイクロリットルの冷却バッファーBに、2マイクロリットルのマイクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)を加え、室温で10分間反応をインキュベートします。次に、チューブを氷上に置いてMNase反応を停止し、40ミリモルのEDTAを添加します。

ミクロコッカスヌクレアーゼによる消化レベルは非常に重要です、なぜなら、過剰消化はシグナルの損失を引き起こす可能性があり、一方、消化不足は多くの非特異的バックグラウンドを引き起こす可能性があるからです。細胞をペレット化した後、ペレットを100マイクロリットルのクロマチン免疫沈降またはChIPバッファーに再懸濁し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。次に、細胞懸濁液を薄肉の微量遠心チューブに移します。

サンプルをウォーターバスソニケーターに20秒間浮かべ、続いて氷上で20秒間浮かべて、サンプルを超音波処理します。超音波処理ステップを9回繰り返して、約800〜1, 200塩基対フラグメントを生成します。超音波処理されたサンプルの20マイクロリットルに、5モル塩化ナトリウムの3マイクロリットル、およびRNase A.Vortexの1マイクロリットルをチューブに加え、37°Cで30分間インキュベートします。

次に、2マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏65度で2時間インキュベートします。サンプルを精製した後、テキストプロトコルに従って、1%アガロースゲル上で実行し、臭化エチジウムで視覚化します。3本の別々の冷却済みシリコン処理チューブに、30マイクロリットルのライセートと、プロテアーゼ阻害剤を添加した冷却1X ChIPバッファー70マイクロリットルを加えます。

1マイクログラムの抗IgG抗体、抗ヒストンH3抗体、または抗HMGB1抗体をそれぞれのチューブに加えます。連続回転しながら冷蔵室で一晩インキュベートします。冷蔵室で、Protein Gビーズを再懸濁した後、各反応チューブに4マイクロリットルのビーズを加え、さらに2〜4時間回転させて冷蔵室でインキュベートします。

チューブを磁気ラックに置き、ビーズをペレット化し、上清を取り除きます。200マイクロリットルの1X ChIPバッファーとプロテアーゼ阻害剤カクテルをペレットに加え、5分間回転させて冷やしてください。次に、高塩分1X ChIPバッファーを用いて、追加洗浄を行います。

次に、160 μLの溶出バッファーを使用してペレットを再懸濁し、摂氏37度で30分間回転させてインキュベートします。ビーズをペレット化し、上清を新しいチューブに集めます。6マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムと2マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏65度で一晩インキュベートします。

DNAを精製した後、テキストプロトコールに従って、プライマーセットを使用して目的の領域にPCR反応を行い、エチジウムブロマイドで染色した1%アガロースゲル上で生成物を分離します。使用前に、あらかじめ調製したDNA修復合成バッファーを氷上で解凍し、40ミリモルのホスホクレアチンと2.5マイクログラムのクレアチンホスホキナーゼを加えます。10Xスーパーコイリングバッファーを調製した後、テキストプロトコルに従って、1マイクロリットルのワクシニア・トポイソメラーゼ1と1Xスーパーコイソメラーゼ1を10マイクロリットルの反応で使用して、300ナノグラムのスーパーコイルプラスミドPCA FG1を線状化します。

リラックスしたプラスミドに、解凍したばかりのHeLa細胞抽出物25マイクロリットルとDNA合成バッファーを加えます。よく混ぜ合わせてから、1マイクロリットルのワクシニア・トポイソメラーゼ1を反応に加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。1%SDSと0.25ミリグラム/ミリグラムのプロテイナーゼKを添加して反応を終了し、摂氏65度で2時間インキュベートします。

1%アガロースゲルを1X TPEバッファーでキャスティングした後、DNAローディング色素を反応液に加え、サンプルを少なくとも4レーン離してゲルに直接ロードします。ゲルを1X TBEで2ボルト/センチメートルで8〜10時間、室温で1次元に泳動し、トポ異性体を分離します。2リットルの1X TBEを1ミリリットルあたり3マイクログラムのリン酸クロロキンで調製します。

ゲルを200ミリリットルの溶液に浸し、アルミホイルで20分間覆います。ゲルを2次元で電気泳動するには、ゲルを時計回りに90度回転させ、1X TBEを含むクロロキンで2ボルト/センチメートルで4〜6時間実行して、正と負のスーパーコイルを分離します。電気泳動バッファーおよびゲル中のクロロキンの量は非常に重要であり、ゲルを2次元目で非常に低い電圧で運転することは、正と負のスーパーコイルを分離するために非常に重要です。

テキストプロトコルに従ってゲルを染色および脱染した後、イメージャーを使用してトポ異性体の熱分布を視覚化します。このゲルに見られるように、TFO指向性ICLを有するプラスミドの約79%は、架橋されていないコントロールプラスミドと比較して、アガロースゲルマトリックス中をゆっくりと移動します。コントロールプラスミドまたはTFO指向性ICLを含むプラスミドをトランスフェクトしたヒトU2OS細胞由来のライセートに対して実施したChIPアッセイでは、抗HMGB1抗体で免疫沈降した場合、コントロール領域と比較してP-ICL領域でのHMGB1の濃縮が見られました。

siRNA処理によってHMGB1を細胞から枯渇させると、P-ICL特異的な濃縮度は減少しました。同じサンプルを抗IgG抗体を用いて免疫沈降させたところ、最小限のPCR増幅が検出されました。最後に、この図では、2次元アガロースゲル電気泳動により、HeLa細胞抽出物中のHMGB1による負のスーパーコイリングとしてのTFO指向ICL含有プラスミドの構造修飾が示されています。

このテクニックを習得すると、正しく実行すれば、約5日で実行できます。この手順を試みる際には、室温での洗浄がバックグラウンド信号を増加させる可能性があるため、すべての洗浄は冷蔵室で行う必要があることを覚えておくことが非常に重要です。この手順に続いて、siRNAを介したタンパク質の枯渇や、それに続く突然変異スクリーニングアッセイなどの他の方法を実行して、目的のタンパク質がDNA修復に関与しているかなどの質問に答えることができます。

それとも、プロセス中に突然変異スペクトルが大幅に変化しますか?この技術は、タンパク質と部位特異的なDNA損傷との関連を研究する道を開きました。このビデオを見れば、DNA架橋を標的とする建築タンパク質の会合を研究する方法、そしてその後、そのような会合がDNAのトポロジーに及ぼす影響を判断する方法について、よく理解できるはずです。

エチジウムブロマイドでの作業は非常に危険である可能性があるため、この実験を行うときは常に適切な保護具を着用する必要があることを忘れないでください。