マイコバクテリアの半定量的、ミディアムスループット列挙のためのチャコール寒天レサズリンアッセイの可視化

CARAの全体的な目標は、複製するマイコバクテリアと非複製するマイコバクテリアに対する化合物の活性をミディアムスループットの半定量的に評価することです。この手法の主な利点は、CFUの代理として、CARAを使用すると、化合物の用量と時間依存性を迅速にテストできることです。この方法は、化合物が複製細菌に対して静菌性または殺菌性を持つかどうか、非複製性細菌に対して殺菌性があるかどうかを判断するなど、結核創薬分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この方法をデモンストレーションするのは、私たちの研究室のアソシエイトであるJulia Robertsです。1リットルのガラスビーカーに450ミリリットルの水を加えるか、2リットルの三角フラスコに900ミリリットルの水を加えます。ビーカーまたはフラスコにオートクレーブ可能な攪拌棒を含めます。

次に、ミドルブルック7H11粉末、活性炭を0.4%の最終濃度に、50%のグリセロール溶液を加えて0.2%の最終濃度を達成します。フラスコまたはビーカーの開口部をアルミホイルで覆い、オートクレーブテープでガラスに貼り付けます。培地をオートクレーブした後、低速に設定された磁気攪拌板で摂氏約55〜65度に冷却して、木炭を懸濁状態に保ちます。

磁気攪拌板を備えたバイオセーフティフードで無菌的に作業しながら、媒体からホイルを取り出し、2リットルのフラスコまたは1リットルのビーカーにそれぞれ100ミリリットルまたは50ミリリットルのOADCサプリメントを加えて混合を続けます。8つまたは12個のフィルターチップを備えたマルチチャンネルピペットを使用して、試薬リザーバーまたはビーカーからの7H11-OADC-木炭の200マイクロリットルウェルを96ウェルマイクロプレートに充填し、寒天の固化と気泡の形成を迅速に回避します。CARAマイクロプレートは、乾燥を防ぐために再封可能なビニール袋に積み重ねて置き、摂氏4度で保管します。

0.01から0.1のOD580でM.smegmatisとミドルブルック7H9-ADNまたは7H9-OADCのそれぞれ4または20ミリリットルを含むポリプロピレン丸底または円錐形の遠心分離管を接種します。M.smegmatisの培養物を摂氏37度、O2度で振とうしながらインキュベートし、培養物を中対数期またはOD580の約0.5まで拡大します。複製および非複製条件下で最小抑制濃度スタイルの実験を設定するには、OD580が0.01の7H9-ADN中の200マイクロリットルの細胞を、透明底の組織培養処理済み96ウェルプレートのすべてのウェルに分配します。

非複製アッセイでは、0.02%チロキサポールを含むPBSを使用して細胞を2回洗浄します。また、非複製培地を使用して細胞を再懸濁します。非複製培地を使用して細胞をOD58000000.1に希釈し、新たに調製した1モルストックから硝酸ナトリウムを最終濃度0.5〜5ミリモルまで添加します。

OD580 0.1 で 200 マイクロリットルの細胞を、透明底の組織培養処理済み 96 ウェルプレートのすべてのウェルに分配します。テキストプロトコルに従ってテストエージェントを準備した後、テストエージェント1の2マイクロリットルを行AからEに追加し、テストエージェント2の2マイクロリットルを行EからHに追加し、十分に混合します。アッセイの複製には、M.smegmatisマイクロプレートを摂氏37度、20%O2、および5%CO2で1〜48時間インキュベー

CARAをリードアウトとして使用する時点で、50〜75マイクロリットルに設定されたp200マルチチャンネルピペットを使用して、MIC90スタイルのアッセイプレートのウェル内容物を5〜10回ピペッティングして慎重に再懸濁します。次に、ピペットの先端を使用して、ウェルの内容物を円を描くように静かに渦巻きます。10マイクロリットルのアッセイウェルの内容物をCARAマイクロプレートの対応するウェルに移し、移動中の飛散を避け、10マイクロリットルのアリコートがCARAマイクロプレートウェルの中央にスポット

プレートテープでCARAマイクロプレートのスタックを結合し、再封可能なビニール袋に入れます。M.smegmatis CARAマイクロプレートを摂氏37度で20%O2とインキュベートし、複製プレートの場合は1〜2日間、非複製プレートの場合は2〜3日間インキュベートします。ネガティブコントロールウェルに細菌増殖またはより大きな巨視的コロニーの膜が見える場合は、マルチチャンネルピペットを備えた12個のp200チップの単一セットを使用して、ウェルの側面に沿って40マイクロリットルの滅菌PBSを分注し、PBSが寒天/細菌マイクロコロニーの上部に分布できるようにします。

PBSで5ミリグラムのレサズリンと50ミリリットルの5%Tween80を混合して、CARA現像試薬を調製します。調製したばかりのCARA現像試薬50マイクロリットルをCARAマイクロプレートの各ウェルに加えます。次に、プレートを数回前後に揺らして、各ウェルの寒天マットとバクテリアマット全体に試薬を分散させます。

プレートを再封可能なビニール袋に入れ、摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。蛍光を読み取る前に、CARAマイクロプレートをバイオセーフティフードに室温で15分間入れ、蓋を外します。バイオセーフティキャビネットの外でBSL3分光光度計を使用する場合は、プレートに光学品質のPCRステッカーを貼り、柔らかいペーパータオルを使用してステッカーの表面を優しく押してしっかりと密封します。

530ナノメートルの励起と590ナノメートルの発光でトップリードを介して蛍光を決定します。プレートをブランクにする必要はありません。データ解析を行うには、X軸に阻害剤濃度をlog10スケールでプロットし、Y軸に蛍光を線形スケールでプロットします。

詳細については、テキストプロトコルを参照してください。CARA蛍光がバックグラウンドレベルを超えて上昇しない原因となる試験剤の濃度は、ここに示されている99以上のCARA-MBCです。「より大きい」は「99」の添え字は、CARA-MBCが試験剤の推定濃度を提供し、2つのlog10細菌の死滅以上を生じさせることを示しています。

化合物は、MIC曲線とCARA曲線の間で右に4倍以上シフトすると定義される静的ウィンドウを表示する場合、ポスト抗生物質効果を発揮すると疑われます。静的ウィンドウは、複製する結核菌に対して活性な分子が殺菌性ではなく静菌性である可能性があることを示しています。強力なポスト抗生物質効果を持つ分子の場合、静的ウィンドウは観察が難しい場合があり、ここで見られるように、CARA蛍光の拡張Y軸を検査した後にのみ明らかになります。

MIC90とCARAで試験した複製活性分子と非複製活性分子を示します。MIC90アッセイでは、イソニアジドとリネゾリドは非複製細菌に対して活性があるように見えますが、CARAは、試験した非複製条件下では不活性であることを示唆しています。このCARA実験では、M.smegmatisをリファンピシンの濃度の増加に曝露すると、わずか1時間で影響が見られ、3時間から24時間の間に殺菌活性の増加が示され、24時間までに1ミリリットルあたり約10マイクログラムで2〜3個のlog10が死亡しました。

この手法を習得すると、プレートの準備に約2時間、細胞をCARAプレートに移すのに1時間未満、適切に行えばCARAプレートの蛍光を発生および測定するのに約1〜2時間で完了します。この手順を試行する際には、化合物が複製または非複製するマイコバクテリアに対して殺菌活性または静菌活性を持つかどうかを判断するための予測アッセイとしてCARAを使用することを忘れないようにすることが重要です。このビデオを見れば、CARAの設定方法と、化合物の活性の種類を予測するのに役立つ方法でデータを分析する方法を十分に理解できるはずです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。