Name: マイコバクテリアの半定量的、ミディアムスループット列挙のためのチャコール寒天レサズリンアッセイの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶチャコール寒天レサズリンアッセイ（CARA）を用いたマイコバクテリアに対する化合物の半定量的評価法。蛍光測定で殺菌的・静菌的活性を迅速に判定し、結核薬物開発の効率的スクリーニングに貢献します。

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CARAを開発しながら、我々は、化学の支援のための専門家の原稿のレビューとJ.デイヴィッド・ウォーレン（ワイルコーネル医科大学）のためのクリスティン・バーンズ・黄に感謝しています。この作品は、トランスレーショナル医学ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団、アビーとハワードP.ミルスタインプログラムのTB薬物アクセラレータプログラム、およびNIH TB研究ユニット（U19 AI111143）によってサポートされていました。微生物学および免疫学の専攻は、ウィリアム・ランドルフ・ハースト財団によってサポートされています。 SSKは、NIHの助成K08AI108799によってサポートされていました。

CARAマイクロプレートの調製<ol><li>あるいはオートクレーブ900 2Lのエルレンマイヤーフラスコ中の0.2％のグリセロール及び0.4％の活性炭を含むミドルブルック7H11寒天mlの、または、1 Lのガラスビーカー450ミリリットル。フラスコやビーカーに大きなオートクレーブ滅菌攪拌棒を含めます。アルミホイルでフラスコやビーカーの開口部をカバーし、オートクレーブテープでガラスに取り付けます。 </li><li>懸濁液中の木炭を維持するために低速度に設定した磁気攪拌プレート上（約55〜65℃）に触れないようにクール。 </li><li>磁気撹拌プレートを持つバイオセーフティフード内で無菌的に後続のすべての手順を実行します。 </li><li>ホイルを外します。 100ミリリットルOADCサプリメントを追加します（OADCサプリメント、10％で使用した場合、0.2％デキストロース、0.5％アルブミン、0.085パーセントのNaCl、0.0005％のオレイン酸、および0.4 mg / mlでカタラーゼの収率最終培地濃度）2 L三角フラスコへ、または1リットルのビーカーに50ミリリットルOADC、および混合を続けます。 </li><li>三角フラスコを使用した場合、約25-4を注ぎます無菌試薬槽に7H11-OADC-炭の0ミリリットル。ビーカーを使用する場合は、試薬リザーバを使用する必要はありません。 </li><li> 200μL/ウェルの試薬槽やビーカーから7H11-OADC-木炭で96ウェルマイクロプレートを埋めます。寒天固化や気泡の導入を避けるために、迅速に作業。それが真菌汚染の原因になる可能性がありとして、井戸の外に固形培地をはね避けてください。マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルプレートの8行（AH）へ7H11-OADC-炭の転送のために12フィルターチップの1セットを使用します。 注：メディアはすぐに固化します。ピペットチップを詰まらないようにするには、頻繁に変更します。 </li><li>あるいは、多数のプレートを調製する際に支援するためにフィルターチップとP1000電子マルチチャンネルピペットを使用して、マイクロプレートCARAを注ぎます。 注：これによりマイクロプレートウェルの低体積に、CARAマイクロプレート内の寒天を注ぐの分以内に固化します。 </li><li>再密封可能なプラスチック製のBAでCARAマイクロプレートの場所スタックgsが乾燥避けるために。 </li><li> 4℃でマイクロストアCARA。 </li></ol> 2. 90アッセイを複製および非複製MICの設定<ol><li> 結核菌 、M。ボビス BCGを接種するか、M.は OD 0.01から0.1の580でスメグマチスとミドル7H9-ADNで対数期中期（OD 580〜0.5）に拡張（ミドル7H9は0.2％グリセロールを含む、0.2％デキストロース0.5％のアルブミン、0.085％のNaCl）又は7H9-OADC（ミドル7H9 0.2％グリセロール及び10％OADCサプリメントを含みます）。 </li><li>細胞培養フラスコで培養を立って20ミリリットル〜として結核菌 およびM.ボビス BCGを育てるとM.は、ポリプロピレン丸底（4ミリリットル文化）または50mlコニカル遠心管（10〜20ミリリットル文化）で振とうしながらスメグマチス 。 20％O 2および5％CO 2、37℃での病原性マイコバクテリアをインキュベートし、M.、20％のO 2、37℃でスメグマチス 。 </li><li>最小限の阻害を設定します濃度（MIC 90）条件（ 図2）を複製し、非複製の下-style実験。 注：試験薬剤は、通常、96ウェルマイクロプレートあたり、それぞれ、試験4、または2の化合物を可能にするために、重複または四連でアッセイされます。例えば、96ウェルプレート中で、一つの試験薬剤は、行EHの行のADと他のでアッセイすることができます。 DMSO（車両）は、列1、2、および12であり、試験薬剤の希釈系列は、カラム11（最高濃度）に3列（最低濃度）から実行されます。 MIC 90スタイルのアッセイは、典型的に2倍希釈系列を使用します。そこマイコバクテリア14-16,18,24,25に利用可能な多数の非複製のモデルがあり、例示的な目的のために、我々は、非複製6,8,9のマルチストレスモデルを使用しています。 <ol><li>複製アッセイのために、透明底、組織培養処理した96ウェルプレートのすべてのウェルにOD 0.01の580で7H9-ADNで200μlの細胞を配布します。 </li> &lt;非複製アッセイのためLI&gt;、0.02％チロキサポールを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を2回洗浄し、非複製培地（0.05％KH 2 PO 4、0.05％のMgSO 4、0.005％クエン酸第二鉄アンモニウムで再懸濁細胞、0.0001％のZnCl 2、0.1％NH 4 Clで、0.5％のBSA、0.085パーセントのNaCl、0.02％チロキサポール、0.05％酪酸; pHを2 N NaOHで5.0に調整）。 <ol><li>非複製培地でOD 0.1の580に細胞を希釈し、最終濃度0.5mMに新たに調製した1 MストックからのNaNO 2を追加します。 </li><li>透明底、組織培養処理した96ウェルプレートのすべてのウェルにOD 0.1の580で200μlの細胞を配布します。 注：DMSO中の100倍ストック溶液として化合物の希釈液を調製します。このように、最終濃度0.4〜100μgので分子の影響を試験する典型的なMICプレート/ mlのDMSO中0.04から10 mg / mlでのストック溶液を必要とするであろう。 </li></ol></li><li>ディの2μLを加えます行AEと行EHに試験剤2の希釈液を2μlに試験剤1のlutions。完全に混合。 </li><li>カラム1、2、12（行AH）、対照ウェルに2μlの車両制御（通常はDMSO）を追加します。完全に混合。 </li><li>各実験について、このような0.004〜1 / mlの（複製アッセイ）および/または0.08〜20μgの/ mlの（非複製アッセイ）からのリファンピシンなどの少なくとも1つのポジティブコントロールが含まれています。 注：0.1〜25 / mlの非複製のマルチストレスモデルにおける選択的ナノ2依存性の活性を有する対照化合物として推奨されているに6-ブロモ-1H-インダゾール-3-アミンを使用する9。 </li><li>アッセイを複製するために、7日（ 結核菌 およびM.ボビス BCG）、または1から48時間（M.がスメグマチス ）のために20％O 2、5％CO 2で37℃でマイクロプレートインキュベートします。非複製のマルチストレスモデルは、&lt;（1％O 2および5％CO 2で37℃で7日間インキュベートし、マイクロプレートem&gt;のM。結核とM.ボビス BCG）。 </li></ol></li></ol> CARAマイクロプレートの3接種<ol><li> CARAは、読み出しとして使用された時点で、慎重によく50-75μLに設定P200マルチチャンネルピペットを使用してMIC 90スタイルのアッセイプレートの内容物を再懸濁します。静かにピペットで上下に少なくとも5〜10倍とは、ピペットチップを使用して、円を描くようによく内容を旋回させます。 </li><li> CARAマイクロプレートに移し、アッセイウェルの内容物を10μl。アッセイプレート上のウェルの内容の順序がCARAマイクロプレートのウェル内容の順序と一致していることを確認してください。転送中に飛散を避け、10μlのは、CARAのマイクロプレートウェルの中央にスポットされていることを確認します。 CARAマイクロプレートに吸収10μlのを確認してください。 注：前CARAマイクロプレート上の細胞をスポッティングするために必要な一切の希釈はありません。 </li><li>プレートテープでマイクロCARAのスタックをバインドし、その後、再密封可能なビニール袋に入れます。マイクロCARAインキュベート20％O 2、37°C​​（M.がスメグマチス ）または1％O 2および5％CO 2（ 結核菌およびM.ボビス BCG）で。 </li><li>アッセイを複製、 結核菌とM.ボビス BCGの場合：7日間インキュベート。 結核菌とM.ボビス BCG非複製アッセイのために、10日間インキュベート。 M.はスメグマチスのために、アッセイを複製し、1〜2日間インキュベートします。 M.はスメグマチスのために、非複製アッセイは、2〜3日インキュベートします。 注：時間は見積もりであり、異なる複製、非複製、およびストレス条件のために応じて修正することができます。 </li></ol> 4. CARAマイクロプレートの開発<ol><li>細菌の増殖、または大きく、肉眼で見えるコロニーのフィルムは、負（車両）コントロールウェルに表示されたときにマイクロプレートCARAを開発します。 注：長時間のインキュベーション後、CARAのマイクロプレートウェル、多くの場合、ドライ表示され、我々は、滅菌PBSでプリウエット内容をよくお勧めします。これは、低蛍光またはウェル間の変動につながる可能性がレサズリンを、吸収から炭を防止する役割を果たす。 </li><li>マルチチャンネルピペットで12 P200チップの単一のセットを使用して、ウェルの側面に沿って滅菌PBS40μlのを分配し、PBSは、寒天/細菌微小コロニーの上部に配布することができます。 </li><li> CARAは、5mgレサズリン（最終0.01％）、PBS中5％のTween80 50ミリリットルを混合することにより、試薬を開発して準備します。渦と滅菌フィルター。 注：PBS中の10％Tween80を1（体積/体積）の代替CARA現像試薬が1で溶液レサズリン商業的に調製された混合することにより調製することができます。 </li><li> 12チャンネルピペットを用いて、CARAマイクロプレートの各ウェルに試薬を開発し、新たに調製したCARAの50μLを加えます。ロックプレートは前後に数回は、各ウェル中の寒天および細菌マット全体で試薬を分配するのに役立ちます。 </li><li>プレートを置き私ナジッパー付きビニール袋とは、Mのために少なくとも30分間スメグマチスと結核菌やM.ボビス BCGのために45から60分間37℃でインキュベートします。 注：ビヒクル対照ウェルを1時間以内ピンク色をオンに失敗した場合、プレートを再度袋及びより長い時間インキュベートすることができます。 </li><li>蛍光を読み取るに先立ち、削除彼らのふたで、室温で15分間、バイオセーフティフード内でマイクロCARAを配置します。安全キャビネットの外でBSL3分光光度計を使用する場合は、板の上に光学的品質のPCRステッカーを付着し、ソフトペーパータオルでステッカーの表面を軽く押して、しっかりと密封します。 </li><li> 590 nmで530 nmでの励起および発光で読み取るトップ介して蛍光を決定します。これは、ブランクプレートをする必要はありません。 </li></ol> 5.データ解析<ol><li>リニアスケール上のY軸上のログ10スケールと蛍光上のX軸上のプロット阻害剤濃度。散乱を使用します曲線を採用したプロットは、「応答可変勾配（4パラメータ）に対する阻害剤をログに記録」としてフィット。 ±標準誤差としてプロットデータポイント。 </li></ol>

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</ol>

開示する特別な利害関係はありません。

CARAは、もともと非複製またはデュアルアクティブ分子7を進んでボトルネックを軽減するために開発されました。 CARAは、一次スクリーニングのヒットとCFUアッセイ（ 図1）の濃度-応答確認の間の中間ステップとして機能します。単一CARAプレートが連続希釈液を準備するために必要な多数のマイクロタイタープレート、および生存細菌を列挙するために使用される寒天を含むペトリ皿に取って代わることができるので、CARAは、化合物濃度を含め、急速に分子の活性を評価し、一度に複数の変数をテストするための簡単な手段を提供しますおよび化合物への曝露時間。 CFUアッセイでは、多くの場合、10 6倍までの範囲で段階希釈液に加えて、寒天プレートは、典型的には、（トライスタイルペトリ皿で8ミリリットルの上に10μl）を追加〜800倍の分子を希釈します。非複製M. TU上の活性化合物のための私たちの二段、マルチストレススクリーニングアッセイberculosisアッセイの非複製段階中に存在する化合物は、五分の一伸長アッセイ6-9の（複製）段階で元の濃度で存在する、すなわち、5倍のキャリーオーバ率を有します。 CARAは、キャリーオーバー効果活性炭で小分子を隔離することによって緩和されます。結核薬および臨床候補の大部分は、アミノグリコシド、ストレプトマイシン7を除いて、迅速かつ完全に活性炭に結合します。 CFUアッセイのための寒天プレートにおける活性炭の含有は、実施オーバーTMC207およびPA-824 7,21,22により、細菌の増殖阻害、または細菌死滅を防ぎます。したがって、細菌学的寒天に活性炭を組み込むことによって、CARAは、細胞と試験薬剤の連続希釈に依存しません。 CARAは、複製活性物質及び非複製活性成分の殺菌影響の静菌または殺菌影響を予測することができます。グラムでeneral、CARAは、標準的なMIC 90アッセイと並行して使用されます。 CARAの予測力は、MIC 90とCARA結果（ 図2、 表1）を比較するから来ています。抗マイコバクテリア薬を研究するために使用する場合、CARAは正確に静菌（ 図4b）を複製し、非複製殺菌（ 図4c）、またはデュアルアクティブ（ 図4d）、殺菌（ 図4a）を複製している活動を予測することができます。 CARAはまた、投与量と時間の両方を横切る化合物の活性の簡易評価が可能になります。単独のCFUアッセイは用量および時間の広い範囲にわたって化合物の活性を評価するための努力と多くの材料を必要とするが、CARA結果は、化合物が明らかにアクティブであるものに条件の範囲を狭めると、タスクが管理対象となります （ 図5 ）。 CARAはの行動を研究する上で有用性を有しているがマイコバクテリアにNTI感染症、アッセイには限界があります。 CARAは、狭いダイナミックレンジ（2-3ログ10）を有し、かつ1以上2ログ3から10の細菌を殺すがないことも予想していた条件のために適切でないかもしれません。 CARAの予測は、CFUアッセイなどの細菌数を、列挙するために、より厳格かつ正確な方法を用いて、さらなる研究が必要です。このようなPASのようないくつかの抗感染症の抗生物質投与後効果は、 結核菌 7を複製に対して殺菌や静菌活性を有する化合物を区別するための予測ツールとしてCARAを混乱することができます。 CARAの品質を改善するには、2つの推奨事項があります。容積測定精度を維持し、マイクロウェルの外に飛散を回避しながら、まず、一つは、寒天が固化する前に、マイクロプレートを急速にCARAを注ぐ必要があります。かかわらず、必要なプレートの数の、我々はメートルを維持するのを助けるために、媒体の0.5〜1 Lのバッチを作るお勧めしますプレートを注ぐのに必要な時間の期間のための液体形態でedium。媒体とマイクロ充填しながら頻繁にヒントを変更すると、部分的に詰まったチップを使用して回避することができます。第二に、1は、反復間の蛍光の人為的な変動を最小限に抑える必要があります。マイコバクテリア微小コロニーは、 結核菌などの病原性マイコバクテリアのために、特に、しばしば不規則に成長します。例えば、寒天表面上に成長する微小コロニーのサイズ、形状、高さが変化してもよい、またはマイクロウェルの内壁まで延びていてもよいです。 1つの課題は、発展途上試薬で均一にすべての菌をカバーするものです。もう一つのハードルは、37℃での長時間のインキュベーションの後、CARAマイクロプレートの固体細菌学媒体が開発した試薬を吸収する乾燥しやすくなるかもしれないということです。活性炭はレサズリンを結合して、蛍光7を消光することができるので、原因レサズリン現像液および活性化charcoaを吸収するドライウェルにウェル間の変動があるかもしれませんレサズリンの蛍光を消光リットル。開発試薬を添加する直前にPBSですべてCARAのマイクロプレートウェルの表面を事前に湿潤これらの問題の両方を軽減する - 開発試薬は、同様にすべてのマイコバクテリアコロニーに達し、レサズリンは安全に活性炭上に残っています。 CARAは、マイコバクテリア変異体の表現型を同定し、特徴付ける、または他の細菌種のための培地スループット創薬アッセイにおける用途を有することができます。

結核菌 、結核の病原体は、抗生物質の根絶に難治性である潜伏状態で、ホストの中で生き残ることができます。感染中の結核菌の表現型（非遺伝的）抵抗は非複製桿菌1,2の集団と、部分的に起因すると考えられています。表現型の薬剤耐性を表示するクラスI存続は、薬剤感受性細胞3,4の大集団の中でまれな確率論的機構を介して起こります。クラスII存続は、感染中に発生した微小環境における外部ストレスを含む宿主免疫の要因によって非複製をレンダリングされます。我々は最近、活性化マクロファージおよび肉芽腫で結核菌が直面条件を模倣するために、クラスII非複製持続性のin vitroモデルを開発しました。クラスII持続のマルチストレスモデルは、その条件を含む、脂肪酸の炭素源、及び完全にHALのような遅い成長、このような穏やかな酸性度（pH値5.0）、低酸素（1％O 2）、一酸化窒素および他の反応性窒素中間体5-9のようにTの成長、。非複製のこのマルチ応力モデルを用いた大規模スクリーニング、および他のクラスII非複製モデルは、その活性が非複製状態5-7,9-18に対して向けられる多様な分子をもたらしました。同じ非複製画面も複製および非複製桿菌の両方に対して活性を有する分子のカテゴリを明らかにし、「二重の活性物質」7,10,12,19,20と呼ばれます。 ヒット・ツー・リード段階で抗菌薬の発見は、ヒットの拡張、予備的な薬理学的特性評価、標的の同定、および予備的なin vivoでの有効性試験のためのリード線を選択する候補分子の大規模な特性評価を伴います。初期段階として、抗感染薬は、それらの作用静菌または殺菌機構により分類し、殺菌場合、ワットされていますhether細菌の死滅は、時間および/または濃度依存性です。コロニー形成単位（CFU）アッセイは、これらの問題に対処するための古典的な、金の標準的な方法です。 CFUアッセイでは、細菌は、連続的に希釈し、アリコートを除去した後、試験剤に曝露され、そして希釈液のアリコートを、固体細菌学的培地に塗布し、生存細胞の成長を可能にするためにインキュベートします。最後に、細菌コロニーが列挙されています。 CFUアッセイは、生存コロニーを列挙するために、細胞および寒天を含むペトリプレートを希釈するためにマイクロタイタープレートを大量に必要とします。成長の遅いマイコバクテリアのためのCFUアッセイは、コロニーがプレート上に表示されるようにするために約3週間を必要とする彼らの遅い世代時間（18-24時間）、によって妨げられています。また、インキュベータ空間は、しばしば特殊な生物学的安全レベル3の施設に制限されます。 面倒ながら、CFUアッセイはmycobacter上の非複製およびデュアル活性分子の影響を特徴づけるためのゴールドスタンダードでありますIA。非複製アッセイは、細胞生存率の6-8を評価するためのアッセイを複製に結合されているような多くの高偽陽性率の対象となっています。例えば、 結核菌を複製に対して強力な活性を有する化合物（「アクティブ複製」）非複製アッセイ中に殺すために失敗することがありますが、それでもの非複製相からのキャリーオーバーによって殺すことができます複製（「複製条件」）をサポートしている条件下で実施されるアッセイの回復期にアッセイ。化合物は、さらに、それが困難な活動は非複製、複製、またはデュアルたかどうかを区別すること、二重活性分子の分析を複雑に繰り越します。 上記課題を解決するために、我々はそのようなM. tuberculなどのマイコバクテリア種の急速な、半定量的列挙にssay（CARA）をesazurin C harcoal AガーRを開発しましたOSIS、M.ボビス BCG、およびM.はスメグマチス 7（ 図1および図 2）。 インビトロでの緩衝液において、活性炭は急速結核7を治療するために使用される標準的な薬物の大部分を隔離します。アッセイマイクロプレートから繰り越すことができる化合物を結合し、CARAのこの機能は、シリアル前列挙7,21,22にアッセイウェルの内容物を希釈する必要がなくなりマイクロCARAで活性炭。 CARAマイクロプレートの寒天表面上のマイコバクテリア微小コロニーの数はレサズリンを添加することによって推定され、その還元型、レゾルフィン青色色素は、その蛍光分光光度計23によって測定されたピンク色の分子です。 M.のために1-2日間インキュベートされたマイクロプレートをCARAはスメグマチスや、 結核菌とM.ボビス BCGのような成長の遅いマイコバクテリアのための7-10日。 CARAは〜2-3ログ10 diffeの狭いダイナミックレンジを持っていますCFUでrence。代わりにCFUアッセイの使用する場合、単一CARAマイクロプレートは、連続希釈液およびめっきに使用される120トライスタイルの寒天プレートに使用される約5 96ウェルプレートに置き換えられます。 CARAデータの解釈はより面倒CFU-基づくアッセイをでテストするためにインキュベーション時間および化合物濃度を決定することによって、その後の研究を導くのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>ミドルブルック 7H9</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>ミドルブルック 7H11</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>298810</td><td></td></tr><tr><td>ミドルブルック OADC</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>BSA、ヒートショック</td><td>ロシュ</td><td>3118958001</td><td></td></tr><tr><td>活性炭</td><td>シグマ</td><td>C5510</td><td></td></tr><tr><td>PBS、ダルベッコのCa2+およびMg2+フリー</td><td>ライフテクノロジーズ/ Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>tween 80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>チロキサポール</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td></td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン</td><td></td><td>Sigma R3501</td><td></td></tr><tr><td>6-ブロモ-1H-インダゾール-3-アミン</td><td>アルファAesar</td><td>H34095</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム、七水和物&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸第二鉄アンモニウム&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>硫酸亜鉛、七水和物</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>酪酸、液体</td><td>シグマ</td><td>B103500</td><td></td></tr><tr><td>レサズリン粉末</td><td>シグマ</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>J.T.ベイカー</td><td>4058-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>調製されたレサズリン溶液&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>PCR ステッカー</td><td>デンビル</td><td>B1212-5</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>分子デバイス</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル、組織培養処理済みマイクロプレート</td><td>コーニング</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー</td><td>VWR&nbsp;</td><td>89094-678</td><td></td></tr><tr><td>再封可能なビニール袋</td><td>VWR&nbsp;</td><td>395-94602</td><td></td></tr><tr><td>14 ml ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>50 ml 円錐形遠心分離チューブ</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 細胞培養フラスコ</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>透明、平底組織培養処理済み 96 ウェル マイクロプレート</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 OS X</td><td>GraphPad</td><td>http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td><td></td></tr></tbody></table>

マイコバクテリアの半定量的、ミディアムスループット列挙のためのチャコール寒天レサズリンアッセイの可視化

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

発見し、結核（TB）治療期間を短縮する抗感染を進行する緊急の必要があります。 結核菌、結核の病原体は、原因表現型の薬剤耐性を示す菌の存在に迅速かつ持続的な化学療法に難治性です。 ssay（CARA）esazurin C harcoal Aガーrは 結核菌を複製し、非複製に対するハイスループットスクリーニングキャンペーンによって発見された活性分子を特徴づけるためのツールとして開発されました。細菌学的寒天培地中の活性炭の含有は、化合物のキャリーオーバーの影響を緩和するのに役立ちますし、CARAマイクロプレート上にスポッティングする前に、細胞を事前に希釈する必要がなくなります。 37℃で7〜10日間のインキュベーション期間の後、CARAマイクロプレートウェルの表面上に成長マイコバクテリアの微小コロニーによるレサズリンの還元は、半定量的ASSEを可能にします蛍光法を介した細菌数のssment。 CARAは約細菌数で2-3ログ10差を検出し、≥99％の細菌を殺す（MBC≥99）に至る最小殺菌濃度を予測します。 CARAは、分子が複製されている菌、非複製、またはその両方にアクティブであるかどうかを判断するのに役立ちます。 CARAを用いたパイロット実験は、試験薬剤および化合物暴露の時間の濃度は、コロニー形成単位（CFU）アッセイによりさらに評価を必要とするの識別を容易にします。複製活性物質は殺菌性または静菌性である場合に加えて、CARAは予測することができます。

予想CARA結果を図2に記載され、 表1に要約されています。細胞を複製するために、CARAは、標準的なMIC 90アッセイと並行して実行され、非複製アッセイのために、CARAは伸長相に結合されている適合MIC 90アッセイと並行して実行されます。バックグラウンドレベルを超えて上昇するCARA蛍光の故障につながる試験物質の濃度は、CARA-MBC≥99（ 図3a）です。 「≥99 &quot;添字がCARA-MBCは≥2ログ10細菌の死滅（≥99％の死滅）を生じる試験物質の推定濃度を提供することを示しています。 液体ブイヨンMIC 90アッセイは、殺菌や静菌作用とを区別することができないと、この区別は、CFUアッセイによって解決されなければなりません。によって大会、成長の遅いマイコバクテリアのための静菌作用から殺菌を区別する閾値は約7日間7,26オーバー2-3ログ10キルです。 CARAのダイナミックレンジも2~3ログ10キルであるので、CARAは、殺菌又は静菌活性の推定値を提供することができます。 CARAは、簡単にバックグラウンドレベル（ 図2）にCARA蛍光を減少させることにより、これらの化合物の故障に静菌などの一部の複製活性物質を特定します。しかし、 結核菌を複製に対する静菌活性を有するいくつかの化合物は、それらがあっても、化合物のキャリーオーバーの不存在下で回復期の間に細菌の再増殖を抑制し続けることを意味し、強力な抗生物質投与後効果を持っています。この効果は、CARAアッセイにおいて認識することが困難であることができます。彼らは「静的なウィンドウ」を表示ならば、化合物は、右betweeへ&gt; 4倍のシフトとして定義され、抗生物質投与後効果を発揮すると疑われていますnはMICとCARA曲線（ 図3b）。静的なウィンドウには、 結核菌を複製に対して活性分子ではなく、殺菌性の静菌であり得ることを示しています。いくつかのケースでは、静的なウィンドウのみCARA蛍光（ 図3C及び3D）のための拡張Y軸の検査後に明らかです。 CARA及びMIC 90のデータは、通常、（ 図4）を一緒にプロットされています。 MIC 90とCARAによって試験replicating-及び非複製活性分子のための代表的なデータは図4に示されています。分子のための4つの主要な活動のクラスがあります：1）イソニアジド、 図4aで実証殺菌（）を複製します。 2）複製静菌（リネゾリド、 図4b）で実証。オキシフェンブタゾンで実証3）非複製殺菌（ 図4c）。そして、4）担当者アクティブlicating（PA-824、 図4dで実証）（静菌または殺菌）および非複製殺菌。重要なことは、 図4aおよび図4bは、しばらくイソニアジドとリネゾリドは、MIC 90アッセイによる非複製細菌に対する活性を有するように見えることを示している図 、CARAは、彼らがテストした非複製条件下で不活性である示唆しています。 （ 図5a - D）リファンピシンの濃度を増加にさらされたM.スメグマチスを複製、分子の時間および濃度依存への影響を予測する際にCARAの有用性をテストするには、1〜24時間の間の様々な時間で、アリコートをスポットしましたCARAプレート上。これらのデータは、リファンピシンは、早ければ1時間（ 図5a）のような影響を及ぼさ3および24時間（ 図5B-D）との間で増加殺菌活性を示したことが示され、そして2によって〜を10μg/ mlで≥2-3ログ10を殺しました4時間（ 図5d）。同様の実験は、ビヒクル対照の四重及び9薬物濃度を試験する、および4の時点で、標準CFUに基づくアッセイによって法外です。 したがって、CARA媒体スループット、分子の活性プロファイルを識別するための迅速な手段として創薬において役割を有します。 CARAの予測は厳密に標準CFUアッセイを用いて評価されるべきです。 CFU解析のためのペトリ皿に0.4％活性炭の添加は、CARAデータとの相関を向上させることができ、より正確なCFUカウントになることがあり、補正の大きさは、一般的に、化合物の効力21,22に比例します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig1.jpg" /> 図1：CARAは、薬物発見における予測ツールです。この図は、CARAの有用性をまとめたもの薬物スクリーニング（シングルポイントスクリーニング、チェリーピッキング、および用量反応アッセイ）と時間がかかるのヒット・ツー・リードアッセイ（CFUアッセイおよび標的の同定）との間の中間段階。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig2.jpg" /> 図2： 予想される結果とブイヨンMIC 90アッセイおよびCARAの概略図。どちらのMIC 90およびCARA結果は、8つの可能な活動のために提示されています。 MIC 90マイクロプレートウェルのために（成長なし）白で、茶色（成長）、およびCARAのためのコーディングは色マイクロプレートは、黒（蛍光なし）とピンク（レゾルフィン蛍光）です。データは推測に基づくものです。 [ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig3.jpg" /> 図3： 専門CARAの用語と定義。 CARA蛍光のバックグラウンドレベルをもたらす分子の最小殺菌濃度はCARA-MBC≥99（A）です。複製条件下では、MIC 90の右側にCARA-MBC≥99の≥4倍のシフトは、多くの場合、静菌作用を示し、「静的なウィンドウ」（B）と呼ばれています。強力な抗生物質投与後効果を有する分子の場合、静的なウィンドウが（c）を観察し、必要とすることが困難な場合がありますY軸（CARA蛍光）の膨張は（d）に可視化します。データは推測に基づくものです。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig4.jpg" /> 図4： 実例MIC 90および選択化合物のためのCARA結果。 MIC 90（赤色）とCARA（青）のデータは、（a）は、イソニアジド（INH）、（b）は、リネゾリド、（C）オキシフェンブタゾン、及び（D）PA-824のために示されます。野生型のヒト結核菌H37Rvを、標準的な複製状態または非複製7-9のマルチストレスモデルで7日間化合物に曝露しました。<html> 図2に示すように、MIC 90アッセイおよびCARAを行いました。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig5.jpg" /> 図5： リファンピシンの用量および時間依存性活性。非病原性、急成長しているM.スメグマチスは、図1（a）、図3（b）、図6（c）にCARAのためにサンプリングし、図24（d）の時間た複製条件アリコート下リファンピシンの漸増濃度に暴露しました。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7].COM /ファイル/ ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54690/54690tbl1.jpg" /> 表1：図2の予想結果のまとめ 。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690tbl1large.jpg" target="_blank">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

charcoal agar resazurin assay (CARA) は、複製する、複製しない、またはその両方であるマイコバクテリアに対する試験剤の活性を評価するための、半定量的で中程度のスループットの方法です。 CARAは、時間および濃度に依存する活性の迅速な評価を可能にし、コロニー形成単位(CFU)アッセイによって追求するパラメータを特定します。

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

CARAの総合的な目的は、複製中および非複製中のマイコバクテリアに対する化合物の活性を、中スループットで半定量的に評価することです。この手法の主な利点は、CFU（コロニー形成単位）の代用として、化合物の用量依存性および時間依存性を迅速に試験できることです。本法は、化合物が複製中の細菌に対して静菌的か殺菌的か、また非複製中の細菌に対して殺菌的であるかを確認するなど、結核薬の創薬分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法のデモンストレーションを行うのは、当研究室のアソシエイトであるJulia Robertsです。1Lのガラスビーカーに450 millilitersの水を入れるか、2Lのエルレンマイヤーフラスコに900 millilitersの水を加えます。ビーカーまたはフラスコにオートクレーブ対応の撹拌子を入れてください。次に、Middlebrook 7H11粉末、活性炭を最終濃度0.4%になるように加え、さらに50%グリセロール溶液を加えて最終濃度0.2%にします。フラスコまたはビーカーの開口部をアルミホイルで覆い、オートクレーブ用テープでガラスに固定します。培地をオートクレーブした後、活性炭を懸濁状態に保つため、低速に設定したマグネチックスターラー上で約55〜65°Cまで冷却します。マグネチックスターラーを備えたバイオセーフティキャビネット内で無菌的に操作を行い、培地からアルミホイルを取り除き、2Lフラスコまたは1LビーカーにOADCサプリメントをそれぞれ100mLまたは50mL加え、攪拌を続けます。8チャンネルまたは12チャンネルのフィルターチップ付きマルチチャンネルピペットを使用し、リザーバーまたはビーカーから7H11-OADC-charcoalを96ウェルマイクロプレートの各ウェルに200µLずつ分注します。この際、アガルの凝固や気泡の形成を防ぐため、迅速に作業してください。CARAマイクロプレートを重ねて再封可能なプラスチック袋に入れ、乾燥を防ぎながら4°Cで保存します。Middlebrook 7H9-ADNまたは7H9-OADCをそれぞれ4 mLまたは20 mL含むポリプロピレン製の丸底または円錐形遠心チューブに、OD580が0.01から0.1となるようにM.smegmatisを接種します。M.smegmatisの培養液を37 °C、20%O2で振盪培養し、対数増殖期中期またはOD580が約0.5になるまで増殖させます。複製条件および非複製条件の下で最小発育阻止濃度（MIC）形式の実験を行うため、OD580が0.01の7H9-ADN中細胞懸濁液200 µLを、透明底の組織培養処理済み96ウェルプレートのすべてのウェルに分注します。非複製アッセイでは、0.02% tyloxapolを含むPBSを用いて細胞を2回洗浄します。その後、非複製培地を用いて細胞を再懸濁してください。非複製培地を用いて細胞をOD580が0.1になるように希釈し、新しく調製した1 Mストック溶液から硝酸ナトリウムを最終濃度0.5～5 mMになるように添加します。OD580が0.1の細胞懸濁液200 µLを、透明底の組織培養処理済み96ウェルプレートのすべてのウェルに分注します。テキストプロトコルに従って試験剤を調製した後、試験剤1を2 µLずつA行からE行に、試験剤2を2 µLずつE行からH行に加え、十分に混合します。アッセイを反復する場合、M.smegmatisマイクロプレートを37 °C、20%O2および5%CO2条件下で1時間から48時間インキュベートします。CARAをリードアウトとして使用する各時点において、50から75 µLに設定したp200マルチチャンネルピペットを用い、ピペッティングを5回から10回繰り返すことで、MIC90形式のアッセイプレートのウェル内容物を慎重に再懸濁します。次に、ピペットチップを使用して、ウェル内容物を円を描くように静かに撹拌します。未希釈のアッセイウェル内容物10 µLを、飛散させないように注意しながらCARAマイクロプレートの対応するウェルに転移させ、10 µLのアリコートがCARAマイクロプレートのウェル中央に滴下されるようにします。プレートテープを用いてCARAマイクロプレートのスタックを固定し、再封可能なプラスチック袋に入れます。M.smegmatis CARAマイクロプレートを37°C、20% O2条件下で、複製プレートの場合は1〜2日間、非複製プレートの場合は2〜3日間インキュベートします。陰性対照ウェルに細菌増殖の膜または大きな肉眼的コロニーが確認できたら、マルチチャンネルピペットと12本のp200チップ1セットを使用し、40 µLの滅菌PBSをウェルの側壁に沿って分注し、PBSがアガロース/細菌マイクロコロニーの表面全体に広がるようにします。5 mgのレサズリンと50 mLの5%Tween80（PBS調製）を混合し、CARA現像試薬を調製します。CARAマイクロプレートの各ウェルに、調製直後のCARA現像試薬を50 µLずつ加えます。その後、プレートを数回前後に揺らし、各ウェルのアガーおよび細菌マット全体に試薬が行き渡るようにします。プレートを密閉可能なプラスチック袋に入れ、M.smegmatisの場合は37 °Cで少なくとも30分間インキュベートします。蛍光を測定する前に、CARAマイクロプレートの蓋を取り外し、バイオセーフティフード内で室温で15分間放置します。バイオセーフティキャビネット外でBSL3分光光度計を使用する場合は、プレートに光学品質のPCRステッカーを貼り、柔らかいペーパータオルを使用してステッカー表面を軽く押さえ、しっかりと密閉してください。励起波長 530 nanometers、蛍光波長 590 nanometersでトップリードにより蛍光を測定します。プレートのブランク処理は不要です。データを解析するには、X軸に阻害剤濃度をlog10スケールで、Y軸に蛍光強度を線形スケールでプロットします。追加の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。CARAの蛍光がバックグラウンドレベル以上に上昇しなかった試験剤の濃度がCARA-MBCであり、ここでは≧99として示されています。この≧99という下付き文字は、CARA-MBCが、10の2乗（2 log10）以上の細菌死滅をもたらすと推定される試験剤濃度であることを示しています。MIC曲線とCARA曲線の間に4倍以上の右方シフト（スタティック・ウィンドウと定義される）が見られる場合、その化合物はポストアンチバイオティクス効果を発揮していると考えられます。スタティック・ウィンドウの存在は、複製中のM.tuberculosisに対して活性を持つ分子が、殺菌的ではなく静菌的である可能性を示しています。強力なポストアンチバイオティクス効果を持つ分子では、スタティック・ウィンドウの観察が困難な場合があり、ここに示すようにCARA蛍光のY軸を拡大して確認することによってのみ判明することがあります。MIC90およびCARAによって試験された、複製能のあるおよび複製能のない活性分子をここに示します。MIC90アッセイでは、イソニアジドとリネゾリドは非複製細菌に対して活性を持つように見えますが、CARAの結果は、試験した非複製条件下ではこれらが不活性であることを示唆しています。このCARA実験において、M.smegmatisを漸増濃度のリファンピシンに曝露させたところ、わずか1時間で影響が現れ、3時間から24時間にかけて殺菌活性の上昇が認められ、24時間後には約10 micrograms per milliliterで2〜3 log10以上の殺菌能を示しました。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、プレートの準備に約2時間、CARAプレートへの細胞転送に1時間未満、そしてCARAプレートの発色および蛍光測定に約1～2時間で完了させることができます。本手順を行う際は、CARAを予測アッセイとして用い、化合物が複製中または非複製のマイコバクテリアに対して殺菌活性または静菌活性を有するかどうかを判定することが重要であるという点を忘れないでください。このビデオを視聴することで、CARAのセットアップ方法と、化合物の活性タイプを予測するのに役立つデータ解析方法について、十分に理解できるはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、結核菌に対する抗菌化合物の活性を評価するためのCharcoal Agar Resazurin...

マイコバクテリアに対する試験化合物活性を評価するための木炭寒天レサズリンアッセイ

このビデオは、結核菌(Mtb)感染に対する薬の有効性を評価するためのアッセイを示しています。Mtb/マクロファージ凝集体を含むin vitro感染モデルは、in...

結核菌感染モデルに対する薬剤効果評価法

このビデオは、結核菌に対する抗生物質の有効性を決定するためのブロス内アッセイを示しています。細菌培養物は、異なる濃度の殺菌性抗生物質とインキュベートされます。殺菌効果は、レサズリンアッセイを使用して生存細菌の存在を評価することによって測定されます。...

ブロス中のマイコバクテリアに対する試験化合物の有効性の評価

ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核...

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

我々は、細胞内および細胞内のブロス増殖する細菌、ならびに哺乳動物宿主細胞に対する細胞毒性を標的、 結核菌に対する新規化合物を発見するためのモジュラーハイスループットスクリーニングシステムを開発しました。...

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

次世代の抗結核薬の初期の医薬品開発プロセスを改善する新しいモデルとアッセイが非常に望ましいです。ここでは、結核菌に対する薬効を評価するための迅速で安価なBSL-2適合アッセイについてご説明します。このアッセイは、ハイスループットスクリーニングに容易に適応できます。...

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

結核菌の細胞内増殖を迅速かつ効率的に定量することは 、結核(...

結核の宿主向け治療の前臨床試験に使用する自動培養システム

コロニー形成単位(CFU)の測定は、目に見えるコロニーを形成するのに数週間かかる結 核菌...

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

この研究では、最近作成されたダブルレポーター株を用いた マイコバクテリウム・アブセッサス...

マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

ここでは、4-アミノキノリン化合物の化学合成、結核菌に対する最小阻害濃度の決定、哺乳類細胞株における細胞毒性の評価を含む表現型スクリーニングを通じて潜在的な抗結核薬候補を特定するプロトコルを提示します。...

潜在的な抗結核候補の同定:哺乳類細胞における合成、MIC決定、細胞傷害評価のステップバイステップガイド

学ぶチャコール寒天レサズリンアッセイ（CARA）を用いたマイコバクテリアに対する化合物の半定量的評価法。蛍光測定で殺菌的・静菌的活性を迅速に判定し、結核薬物開発の効率的スクリーニングに貢献します。

マイコバクテリアの半定量的、ミディアムスループット列挙のためのチャコール寒天レサズリンアッセイの可視化

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