LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます
December 30th, 2016
光学的に制御された物質は、シグナル伝達経路を研究するための強力なツールです。実験の可能性を広げるために、フローサイトメトリーを用いて光学制御物質をリアルタイムに研究する装置「LED Thermo Flow」を開発しました。
この方法の全体的な目標は、フローサイトメトリー測定中に光学的に制御された物質を刺激することです。この新しいデバイスは、光学的に制御された物質の力とフローサイトメトリーを組み合わせることで、細胞シグナル伝達の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。初めて、オプトジェネティクスツールをフローサイトメトリーを使用して特性評価および分析できるようになりました。
今日まで、これに匹敵する確立された方法は存在しませんでした。まず、形質導入したRamos Bリンパ球を1ミリリットルあたり100万個の細胞の濃度で懸濁し、ガラスFACSチューブに移します。次に、フローサイトメーターの黒いOリングをゴム製のOリングに交換し、シリコーングリースを塗布して密閉性を高めます。
ガラス管をフローサイトメーターに挿入し、ライトを消した状態でLEDプロトタイプをチューブの周りに置き、GFPチャネル内のDronpaの蛍光強度を測定します。手順の最も重要なステップは、ガラス管の取り扱いです。
ガラスFACSチューブは非常に壊れやすいため、実験を行う前に、ガラスチューブをサイトメーターに挿入する練習をすることをお勧めします。次に、チューブの外側にある500ナノメートルのLEDライトをオンにし、ドロンパの蛍光強度の測定を続けます。Dronpa-Linker-Dronpaタンパク質の光スイッチングを測定するために、必要な最小光強度を推定するために、Dronpa蛍光強度が減少するまでLEDライトの強度を上げます。
次に、チューブの外側にあるプロトタイプの400ナノメートルLEDライトを点灯させ、ドロンパの蛍光強度の測定を続けます。400ナノメートルのLEDライトの光強度を、ドロンパの蛍光強度が増加するまで増加させます。まず、付属のテキストプロトコルの設計と製造の手順に従って、フォトスイッチングLEDデバイスの内層と外層を製作します。
400ナノメートルと500ナノメートルの波長のLEDをデバイスのチャネルに挿入します。それらを所定の位置に接着し、指示どおりに配線します。これらの特定の波長は、Dronpa-Linker-Dronpa融合タンパク質を暗い状態と明るい状態の間で切り替えるために使用されます。
次に、変圧器の電源を入れる前に、デバイスを組み立て、漏れを防ぐために水密であることを確認してください。デバイスの組み立て後、Ramos Bリンパ球を採取し、1ミリリットルあたり3000万から1000万個の細胞の密度で懸濁します。600マイクロリットルの細胞をガラスFACSチューブに移します。
それらを氷の上に置き、測定されるまで細胞を光から保護します。組み立てたデバイスを温水ポンプに接続し、温度を摂氏37度に調整します。次に、ガラス製FACSチューブをデバイスに慎重に挿入し、フローサイトメーターに接続します。
GFPチャンネルでDronpaの蛍光強度を記録します。このオプトジェネティクスデバイスの設計には、サンプルの温度を一定の値に維持するために循環水供給に接続できるチャンバーが含まれています。このデバイスは3つの異なる波長を放出しましたが、FACSサンプルでは、37°Cの水をデバイスに流すと、わずかな温度上昇しか見られませんでした。
Dronpa-Linker-Dronpa融合コンストラクトをクローニングし、Ramos B細胞に形質導入しました。500ナノメートルの光源でモノマー状態に向けると、発光強度は減少します。そして、光源を400ナノメートルの光に切り替えると、ドロンパモノマーは急速にダイマー状態に変化し、強度は急速に増加します。
このデバイスを使用して、細胞質Dronpa-Linker-Dronpa融合タンパク質を複数回光スイッチングすることができました。ダーク状態への切り替えはゆっくりと行われますが、明るい状態への切り替えはほぼ瞬時に行われます。暗闇でのDronpaの自発的な蛍光回復は、明るい形態への効率的な光切り替えには特定の照明が必要であり、自然にゆっくりとしか起こらないことを示しています。
速度論的解析は、光スイッチング速度が全体的に非常に再現性が高く、暗闇での長時間のインキュベーション後でも、光スイッチングなしで蛍光の約10%しか回復しないことを示しています。この手順に続いて、カルシウムフラックス測定を含むあらゆるフローサイトメトリー解析を実施して、選択したオプトジェネティクスツールの機能を調べることができます。開発後、この技術は、光遺伝学の分野の研究者が細胞シグナル伝達経路の配線を探求するための道を開くでしょう。
このビデオを見れば、特定のオプトジェネティクスツールのためのフォトスイッチングプロトコルを確立する方法についてよく理解できるはずです。UV光は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、保護メガネなどの予防策を常に着用する必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、フローサイトメトリーを使用して光学的に制御された物質のリアルタイム研究のために設計された新しいデバイスを紹介します。オプトジェネティクスツールとフローサイトメトリ測定を統合することで、研究者は細胞シグナリングの重要な問題を探ることができます。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞シグナリング
- オプトジェネティクス
- フローサイトメトリー
背景
- 光学的に制御された物質はシグナリング経路を研究するのに有用です。
- フローサイトメトリーは細胞集団の分析を可能にします。
- 以前の方法では、これら2つの強力な技術を組み合わせていませんでした。
- この研究では、この統合を可能にするデバイスを紹介します。
研究の目的
- フローサイトメトリー測定中に光学的に制御された物質を刺激すること。
- フローサイトメトリーを使用してオプトジェネティクスツールを特性化し分析すること。
- 細胞シグナリングを調査するための新しい方法を提供すること。
使用した方法
- 1ミリリットルあたり100万個の濃度の懸濁した形質転換されたRamos Bリンパ球。
- ガラスFACSチューブに細胞を移しました。
- フローサイトメーターの黒いOリングをゴムのOリングに交換しました。
- より良い密閉のためにシリコングリースを塗布しました。
主な結果
- デバイスはオプトジェネティック刺激とフローサイトメトリーを正常に統合します。
- 細胞シグナリング経路のリアルタイム分析を可能にします。
- 初めてオプトジェネティクスツールの特性化を可能にします。
- 細胞シグナリングを研究するための既存の方法論のギャップに対処します。
結論
- この新しいデバイスは細胞シグナリングの研究において重要な進歩を表しています。
- 光学的に制御された物質を使用した研究の新たな道を開きます。
- 将来の研究では、この方法を活用して複雑なシグナリング経路を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Integrating optogenetic control with flow cytometry enables real-time, single-cell resolution analysis of signaling dynamics, addressing a critical gap in mechanistic de-risking for target validation. This approach enhances predictive confidence by allowing quantitative, reproducible assessment of photoswitching kinetics in live cells, supporting early discovery decisions. The low-cost, adaptable design facilitates enterprise reuse across optogenetic tool development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time photoswitching of optogenetic tools in live cells.
- Operational Value: Provides quantitative fluorescence readouts to clarify pathway dynamics and reduce mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports target confidence by characterizing optogenetic tool performance under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible optogenetic control.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise light intensity, wavelength, and temperature control during flow cytometric measurements.
- Scalability: Supports high-throughput analysis of thousands of cells per second, facilitating screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase optogenetic characterization to preclinical validation by enabling functional assessment in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows exploration of optogenetic tool functionality in complex signaling pathways, reducing late-stage biological risk.
- Predictive Confidence: Generates quantitative kinetic data to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself at the intersection of early discovery and lead identification, enabling hypothesis testing and assay readiness for optogenetic tool evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing real-time manipulation and measurement of optically controlled substances in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible photoswitching measurements at single-cell resolution.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence intensity readouts and kinetic analysis to compare conditions and assess tool performance.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by characterizing optogenetic tools in a flow-compatible, physiologically relevant format.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, low-cost platform adaptable to diverse optogenetic tools and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in optogenetic tool function, reduction of mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of photoswitching measurements across cell populations.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in tool development, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of optogenetic candidates based on quantitative kinetic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, flow cytometry, and basic device assembly.
- Needs access to a flow cytometer, LED light sources, and temperature control via water pump.
- Demands cross-team standardization for consistent light delivery, temperature control, and sample handling.
- Involves adaptation considerations for different cell types, optogenetic tools, and wavelength requirements.
- Includes practical limitations such as glass tube fragility and UV light hazards requiring protective measures.
