レポーターマウスを用いたIL-22を発現するリンパ球の可視化

このマウス遺伝子改変手順の全体的な目標は、IL-22産生免疫細胞を同定、精製、および特性評価することです。免疫系の細胞は、バクテリアなどの異物から私たちを守り、損傷した組織を修復する役割を担うサイトカインと呼ばれるメディエーターを放出します。IL-22はそのようなサイトカインの1つであり、組織修復から病理学に至るまで多くの活性が認められています。

そして、免疫系の多くの異なる細胞タイプがそれを産生する能力があることが報告されています。そこで、実際にどの細胞がIL-22を産生しているのかを明らかにするために、新たにIL-22レポーターマウスを開発しました。これにより、正常条件下でのマウスおよび炎症性腸疾患モデルにおいて、in vivoで関連するIL-22産生物を特定することができました。

また、レポーター細胞を使用してIL-22発現因子を精製し、それらの他の特性を決定しました。レポーターマウスの生成方法について簡単に概説し、解析方法について説明する。記載されている方法は、発現因子を同定し、さらなる特性評価のために生存発現細胞を精製する目的で、他の遺伝子に適用することができる。

この方法は、IL-22の生物学的活性とそれを産生する細胞の特性に関する免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。私と一緒に手順を実演するのは、生物学者のジュリー・ヒクソン、ポスドクのキャロライン・アンドリュース、およびスタッフサイエンティストのウェンチン・リーです。tdTomatoレポーター遺伝子をシャトルベクターに挿入し、同じ部位内のGFP遺伝子を置き換えた後、適切な細菌人工染色体またはBACテンプレートを使用して、50マイクロリットルのPCR反応システムでAおよびBホモロジーボックスをIL-22の最初の翻訳エクソンに増幅します。

次に、精製したベクターを、クロラムフェニコールとアンピシリンを摂氏37度で含むLuria-BertaniまたはLB寒天プレート上のBACコンピテント細菌細胞に変換します。インキュベーションの終わりに、摂氏37度、225rpmのクロラムフェニコールを添加した1ミリリットルのLBブロスに2〜3コロニーを接種します。1時間後、各混合物の100マイクロリットルを、クロラムフェニコールとスクロースを補充したLB寒天プレートに広げて、摂氏37度で一晩培養します。

翌朝、大きなコロニーをクロラムフェニコールを含む新しいLB寒天プレートに再度プレートし、小さなコロニーを別のLB寒天プレートに再度プレートし、プレートを30秒間UV光にさらします。次に、UV感受性コロニーを選択し、tdTomato IL-22ヘテロ接合プライマーを使用して、PCRによって修飾されたBAC DNAの存在を確認します。脾臓と胸腺を切除した後、細点の鋸歯状解剖鉗子を使用して、小腸の壁に近い真珠のような白い腸間膜リンパ節を採取します。

次に、小腸と結腸全体を切除し、はさみを使用して腸に沿って拡張された楕円形のパイエルパッチを抽出します。すべてのリンパ組織が収集されたら、腸間膜リンパ節とパイエル板をPBSの2つのつや消しスライドの間で一緒に粉砕し、氷上のFBSを補充します。同様に個々の脾臓と胸腺の単一細胞懸濁液を生成した後、脾臓細胞を遠心分離し、脾臓赤血球溶解に続いて1ミリリットルのACK溶解バッファー脾臓で遠心分離します。

1分後、9ミリリットルのPBSで等張性を回復し、細胞を再度遠心分離します。ペレットを5ミリリットルのPBSに再懸濁し、100ミクロンのセルストレーナーで細胞をろ過します。次に、別の遠心分離で細胞を回収し、ペレットを5ミリリットルのRPI培地に再懸濁して、トリパンブルー排除による計数を行います。

十二指腸から回腸までの小腸を結腸全体とともに採取した後、鉗子を使用して腸から余分な脂肪組織と腸間膜組織を取り除き、すぐに腸組織を氷冷PBSに入れます。鉗子を使用して、小腸の遠位領域に沿ってパイエルのパッチを採取します。次に、はさみを使用して腸を縦に開き、10ミリリットルの氷冷PBSで組織を完全に洗い流します。

サンプルを20ミリリットルのプリ消化バッファーに移し、摂氏37度と50rpmで30分間のインキュベーションを行い、シェーカーで12, 000rpmで組織を30秒間ボルテックスし、各インキュベーションの終わりに100ミクロンの細胞ストレーナーを介してすべてのフラグメントをプレスして上皮細胞層を収集します。次に、20ミリリットルの新鮮なEDTA溶液を細胞スラリーに加え、摂氏37度で振とうしながらさらに30分間インキュベーションし、インキュベーションの終わりに腸上皮細胞をろ過して冷却します。残りの腸片を氷の上に置き、遠心分離によってプールされた腸上皮細胞を回収し、続いてFBSを添加したHBSSの10ミリリットルで洗浄します。

洗浄したペレットを8ミリリットルの44%コロイダルシリカ培地に再懸濁し、細胞懸濁液を5ミリリットルの67%コロイダルシリカ培地で覆います。遠心分離により細胞を分離し、1ミリリットルのピペットを使用して、細胞分離培地の上部5ミリリットルを取り出します。次に、界面で細胞を収集し、腸上皮細胞を10ミリリットルのRPMI培地で洗浄し、ペレットを5ミリリットルの新鮮なRPMIに再懸濁します。

IL-22 td-Tomatoマウスから単脾細胞懸濁液を調製した後、ちょうど示したように。無菌PBS中に細胞を1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞濃度で再懸濁し、マウスCD4細胞陰性単離法を使用してCD4陽性T細胞を精製します。次に、T細胞を抗CD4抗体および抗CD45RB抗体で摂氏4度で30分間標識します。

インキュベーションの終了時に、遠心分離により細胞を回収し、続いてFBSを添加したPBSの2ミリリットルで洗浄します。洗浄したペレットを1ミリリットルの新鮮なPBSおよびFBSに再懸濁し、標識T細胞をフローサイトメトリーでCD4およびCD45RB共発現により選別します。すべての細胞を選別したら、遠心分離によりそれらを回収し、ペレットを無菌PBSに10〜6細胞/mLの濃度で再懸濁し、RAG1ノックアウトマウスレシピエントに細胞を注入します。

マウスIL-22レポーター作製には、導入遺伝子の組換えを用いて、陽性選択マーカーとクロラムフェニコール系抗生物質耐性遺伝子を含むIL-22バッタを運ぶ細菌の人工染色体を改変しました。tdTomatoをエクソン1に導入した後、シグナルペプチド配列が破壊され、IL-22発現細胞内にtdTomatoレポーターがトラップされ、フローサイトメトリーによる検出と単離が可能になりました。IL-22レポーターの忠実度をテストするために、in vitroで生成された脾臓細胞をTh22または中性の条件下で培養し、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡の両方でIL-22 tdTomatoの発現が明らかになります。

In vivoでは、IL-22レポーターは、腸の固有層細胞で観察されたシグナルの大部分で、恒常性条件下でさまざまなマウス組織を検出しましたが、腋窩リンパ節、脾臓、胸腺では観察されませんでした。レポーターCD4陽性CD45RB高T細胞のRAG1ノックアウトマウスへの移植によって誘発されたマウス大腸炎モデルでは、tdTomatoレポーターは最初に腸間膜リンパ節で視覚化されますが、最終的には遠位小腸および結腸組織の固有層に蓄積します。この手順を試行する際には、適切なBACクローンを選択することを忘れないでください。

この手順に続いて、このレポーターマウスを使用して肺または皮膚感染モデルの確立などの他の方法を実行し、宿主の防御と組織修復におけるIL-22の役割に関する追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者が、このようなマウスモデルを使用して、低発現を示す分泌タンパク質の機能を探索する道を開きました。このビデオを見れば、トランスジェニックレポーターマウスの作製方法と、in vitroおよびin vivoでのIL-22レポーター遺伝子の同定方法について十分に理解できるはずです。